不同類型土壤中CP4-EPSPS基因的降解規(guī)律及對環(huán)境影響的研究

王 康

(廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院 熱帶農(nóng)林學(xué)院 作物生產(chǎn)技術(shù)系，廣東 廣州 510000)

為此，本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因抗除草劑玉米CC-2為試材，通過室內(nèi)掩埋試驗(yàn)，建立不同環(huán)境下該蛋白在土壤中的降解模型，明確其降解時間，進(jìn)而解析轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因玉米CC-2中外源表達(dá)蛋白CP4-EPSPS在土壤中的降解規(guī)律，為今后轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因抗除草劑玉米CC-2商業(yè)化做監(jiān)控數(shù)據(jù)積累，為其后續(xù)釋放田間、進(jìn)行大面積種植的環(huán)境安全監(jiān)測提供理論依據(jù)。

1 文獻(xiàn)回顧

1.1 主要轉(zhuǎn)基因作物的研究進(jìn)展

隨著現(xiàn)代化農(nóng)牧業(yè)逐漸向產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已然成為了國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不同作物中的應(yīng)用領(lǐng)域主要涉及4個方面：(1)基于抗蟲改良方面的研究：以抗棉鈴蟲、抗作物根部線蟲等方面的研究為主；(2)基于抗除草劑改良方面的研究：主要應(yīng)用在抗草甘膦、抗草銨膦等方面的品種開發(fā)；(3)給予耐逆性改良方面的研究：主要針對在干旱環(huán)境、鹽堿環(huán)境等條件下的改良研究；(4)基于綜合性狀提升的品質(zhì)改良，是目前轉(zhuǎn)基因育種的新興領(lǐng)域，側(cè)重于某些特殊要求的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用研究：主要應(yīng)用在生產(chǎn)特殊蛋白、特定的需求成分等方面。

1.2 轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物環(huán)境安全評價研究進(jìn)展

自1996年轉(zhuǎn)基因作物在美國商業(yè)化種植，其在全球的種植面積一直呈現(xiàn)持續(xù)、快速增長的趨勢。所種植的轉(zhuǎn)基因作物主要是抗除草劑和抗蟲作物，其中抗除草劑作物占種植總面積較大?？钩輨┳魑锏姆N植為雜草的高效控制提供了新的手段，但其可能帶來的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險也引起了世界各國的廣泛關(guān)注和爭議。從轉(zhuǎn)基因作物的研制開始,其安全性問題一直受到各國政府、專家及公眾的廣泛關(guān)注。在轉(zhuǎn)基因作物大規(guī)模商業(yè)化種植前對其進(jìn)行系統(tǒng)、嚴(yán)格的安全性評價，并在釋放后進(jìn)行跟蹤監(jiān)測是目前各國對轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險管理的共識。我國政府對轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化利用持積極而謹(jǐn)慎的態(tài)度，既充分肯定轉(zhuǎn)基因技術(shù)對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的巨大推動作用，積極支持和推進(jìn)轉(zhuǎn)基因生物的研發(fā)利用，也充分考慮轉(zhuǎn)基因作物的種植對生態(tài)環(huán)境及人類健康可能帶來的潛在風(fēng)險,高度重視轉(zhuǎn)基因作物的安全性評價。

對于轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物的安全性評價問題[1]，目前國外對轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物的環(huán)境風(fēng)險進(jìn)行了評估，并作出相關(guān)的風(fēng)險假設(shè)，主要與以下三類潛在危害有關(guān)：(1)CP4-EPSPS蛋白可能對非目標(biāo)生物體產(chǎn)生一定的環(huán)境風(fēng)險；(2)宿主植物的轉(zhuǎn)化及其后續(xù)CP4-EPSPS的表達(dá)可能改變植物的特性，產(chǎn)生一定的環(huán)境風(fēng)險(例如雜草增加)；(3)CP4-EPSPS基因滲入性相容的植物物種可能改變該物種，導(dǎo)致一定的環(huán)境風(fēng)險(例如建立新的雜草種群)。由于轉(zhuǎn)基因作物商品化的歷史還非常短，人們對轉(zhuǎn)基因作物大量釋放的風(fēng)險到底有多大還知之甚少，特別是轉(zhuǎn)基因作物大范圍長期釋放對生態(tài)環(huán)境的影響更不可能是在短時間內(nèi)可以了解清楚的。因此科學(xué)家們將本著科學(xué)、認(rèn)真的態(tài)度對轉(zhuǎn)基因植物可能引起的生態(tài)風(fēng)險進(jìn)行全面、長期的跟蹤評價，同時研究發(fā)展監(jiān)測轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)風(fēng)險的新方法和新技術(shù)也是非常必要的。目前轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米環(huán)境安全評價主要集中在對節(jié)肢動物的影響和基因漂移等方面。

1.3 轉(zhuǎn)基因作物中外源蛋白在土壤中降解規(guī)律研究

生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化主要是在土壤中進(jìn)行。目前普遍認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物外源物質(zhì)進(jìn)入土壤的途徑主要有以下幾種：土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場所，轉(zhuǎn)BT基因植物外源基因表達(dá)的BT蛋白可通過根系分泌物、殘茬分解、花粉飄落等途徑進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，并且可以快速吸附在土壤活性顆粒表面，與之緊密結(jié)合而避免生物降解，能在較長時間內(nèi)保持活性[2]。因此，轉(zhuǎn)基因作物的常年種植可能會造成土壤中外源蛋白殘留、富集的現(xiàn)象，改變土壤微生物環(huán)境系統(tǒng)，打破微生物、植株及土壤三者間的平衡，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)中的特異生物功能類群以及土壤生物多樣性[3-5]，進(jìn)而影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。在土壤環(huán)境中失活或消除的途徑主要包括三個方面：一是昆蟲消耗；二是太陽光中紫外線的降解；三是微生物的降解。在三種降解方式中，以土壤微生物的降解為主。生物作用主要是昆蟲消耗和土壤微生物的降解作用。

1.4 先導(dǎo)試驗(yàn)中外源蛋白在土壤中降解的最適環(huán)境篩選

在先導(dǎo)試驗(yàn)中，不同含水量(25%、50%、100%)、溫度(15 ℃、25 ℃、35 ℃)、pH值(5、7、9)、土壤因素(土壤滅菌處理、土壤非滅菌處理)的條件下，根據(jù)混合正交試驗(yàn)設(shè)計，測定各個取樣時期葉片粉末中CP4-EPSPS蛋白在土壤中的殘留量。結(jié)果顯示，各個處理?xiàng)l件下，土壤中的CP4-EPSPS蛋白殘留量均呈前期快速降解后期緩慢降解并逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢；隨著溫度的升高CP4-EPSPS蛋白的降解速度加快，滅菌處理的土壤環(huán)境能夠加快CP4-EPSPS蛋白的降解速度。鑒于pH值和含水量對該試驗(yàn)的影響較小，故本試驗(yàn)予以忽略。

2 主要內(nèi)容

以轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因抗除草劑玉米CC-2為材料，分別與取自吉林公主嶺、北京上莊、山東濟(jì)南、河南新鄉(xiāng)的干葉混合，在保持溫度和含水量恒定的條件下進(jìn)行掩埋處理，分別在掩埋0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、35、45、60、75、90、105、120 d提取總蛋白，采用ELISA方法檢測CP4-EPSPS蛋白在不同土壤中的殘留量，利用sigmaplot12.0軟件擬合降解方程，計算DT50及DT90，獲得其降解曲線，明確CP4-EPSPS蛋白在不同土壤環(huán)境中的室內(nèi)降解規(guī)律。

3 材料方法

3.1 供試材料

試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因抗除草劑基因玉米CC-2采用盆栽的方式種植于室內(nèi)溫室。

三是建立項(xiàng)目整合系統(tǒng)治理模式。湖北省相關(guān)部門應(yīng)整合各部門涉河湖項(xiàng)目資金和資源，統(tǒng)籌水資源保護(hù)、水污染防治、水環(huán)境保護(hù)、水生態(tài)修復(fù)、水域岸線管理、河湖管理保護(hù)監(jiān)管等工作經(jīng)費(fèi)，推廣實(shí)施山水林田湖草系統(tǒng)治理和水岸人綜合治理的項(xiàng)目模式，作為河湖長制專項(xiàng)項(xiàng)目支撐，并納入長江大保護(hù)項(xiàng)目庫予以重點(diǎn)支持。

3.2 玉米樣品處理及根際土壤樣品采集

收集葉片，120℃殺青10min，37℃烘干。將烘干葉片粉碎后過1mm篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)所用土壤采自吉林公主嶺、北京上莊、山東濟(jì)南、鄭州新鄉(xiāng)表層(0—20cm)土壤(四種土壤基本理化性質(zhì)見表1)。將土壤樣品在室溫下風(fēng)干并通過1mm篩子，然后將該土壤樣品密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)

3.3 試驗(yàn)設(shè)計

為簡化試驗(yàn)，精準(zhǔn)獲得典型性代表性關(guān)鍵數(shù)據(jù)，根據(jù)先導(dǎo)試驗(yàn)中樣地總體環(huán)境狀況篩選優(yōu)化出來的試驗(yàn)因素組合，選擇蛋白降解速度適中的一組因素條件(即溫度為25 ℃、含水量為50%的條件)進(jìn)行室內(nèi)模擬CP4-EPSPS外源蛋白降解試驗(yàn)。

3.4 掩埋及取樣方法

試驗(yàn)稱取0.2g土和0.02g葉均勻混合，裝入頂部帶有一個2mm小孔的2.0ml離心管中，根據(jù)既定的試驗(yàn)方案，加入相應(yīng)的無菌水，最后利用萬分之一天平稱量每個離心管的質(zhì)量并標(biāo)注。樣品準(zhǔn)備完畢后統(tǒng)一放入溫度為25℃的室內(nèi)恒溫培養(yǎng)箱中，進(jìn)行室內(nèi)模擬掩埋，每隔一天按照稱量前后的樣品重量差補(bǔ)加無菌水，每相差0.01g補(bǔ)水10μl，以保持每個樣品含水量恒定，每個處理3次重復(fù)。

共設(shè)置33個取樣時間點(diǎn)，分別為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、35、45、60、75、90、105、120d，每次取3次重復(fù)進(jìn)行檢測；將每個處理取出并標(biāo)注清楚后放入-80℃冰箱統(tǒng)一檢測。

3.5 CP4-EPSPS蛋白測定

用ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測。

3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Excel將ELISA檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理匯總，導(dǎo)入SPSS軟件中進(jìn)行方差分析，再導(dǎo)入SigmaPlot 12.0軟件，將各因素影響下，CP4-EPSPS蛋白降解的殘留量與降解天數(shù)之間建立起數(shù)學(xué)模型關(guān)系，得出CP4-EPSPS蛋白的降解曲線圖；根據(jù)ELISA檢測數(shù)據(jù)求出方程的參數(shù)值，最終確定函數(shù)擬合模型；最后用Excel求出具體的DT50和DT90值，并分析CP4-EPSPS蛋白降解規(guī)律。

4 結(jié)果與分析

4.1 相關(guān)性分析

通過表2可知，不同的土壤理化性質(zhì)會對外源蛋白在土壤中的降解規(guī)律產(chǎn)生不同程度的影響，其中與有機(jī)質(zhì)和有效磷含量均達(dá)到顯著相關(guān)，說明有機(jī)質(zhì)和有效磷含量高的土壤有利于CP4-EPSPS蛋白在土壤中的降解。

4.2 降解規(guī)律

CP4-EPSPS蛋白在土壤中的降解動態(tài)如圖1所示，各處理CP4-EPSPS蛋白含量從左向右呈指數(shù)下降趨勢，CP4-EPSPS蛋白的初始含量(降解處理0d)均為100%，隨著掩埋天數(shù)的增加，蛋白含量均呈下降趨勢。觀察CP4-EPSPS蛋白在四種不同的土壤環(huán)境下的降解趨勢不難發(fā)現(xiàn)，CP4-EPSPS蛋白均呈現(xiàn)出前期降解速度較快、后期逐漸緩慢并最終趨于穩(wěn)定的趨勢。

表2 土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

注：XX：新鄉(xiāng)；JN：濟(jì)南；BJ：北京；GZL：公主嶺。

縱向比較發(fā)現(xiàn)，在公主嶺的土壤環(huán)境下，CP4-EPSPS蛋白在0—1.68d的降解速度最快，降解了50%，1.68—5.79d的降解速度逐漸緩慢，降解了90%，且于第5.79d后逐漸趨于穩(wěn)定；北京的土壤環(huán)境下，CP4-EPSPS蛋白在0—1.88d降解速度最快，降解了50%，1.88—5.84d降解速度逐漸緩慢，降解了90%，且于5.84d以后逐漸趨于穩(wěn)定；在濟(jì)南的土壤環(huán)境下，CP4-EPSPS蛋白在0—1.95d的降解速度最快，降解了50%，1.95—6.54d降解速度逐漸緩慢，降解了90%，且于6.54d以后逐漸趨于穩(wěn)定；在新鄉(xiāng)的土壤環(huán)境下，CP4-EPSPS蛋白在0—2.38d的降解速度最快，降解了50%，2.38—7.44d后降解速度逐漸緩慢，降解了90%，且于7.44d后逐漸趨于穩(wěn)定。

各土壤環(huán)境相互比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過相同的降解時間，CP4-EPSPS蛋白的降解殘留量在新鄉(xiāng)的土壤環(huán)境下最高，在公主嶺的土壤環(huán)境下最低，其相應(yīng)的蛋白殘留量從高到低排列為：新鄉(xiāng)>濟(jì)南>北京>公主嶺。

4.3 模型擬合

本試驗(yàn)中4組處理下CP4-EPSPS蛋白降解指數(shù)模型見表3。從表3中可以看出，所有處理的模型相關(guān)系數(shù)R值在0.993—0.999(p<0.001)，表明該模型能較好地擬合該蛋白的降解過程。在四種不同土壤環(huán)境下，CP4-EPSPS蛋白的DT50分別為新鄉(xiāng)2.38d、濟(jì)南1.95d、北京1.88d、公主嶺1.68d；其DT90分別為新鄉(xiāng)7.44d、濟(jì)南6.54d、北京5.84d、公主嶺5.79d，表明CP4-EPSPS蛋白在公主嶺的土壤環(huán)境下降解速度較快。

各土壤環(huán)境相互比較發(fā)現(xiàn)，CP4-EPSPS蛋白在公主嶺的土壤環(huán)境下降解速度最快，在新鄉(xiāng)的土壤環(huán)境下降解速度最慢，其相應(yīng)的蛋白降解速度從快到慢排列為：公主嶺>北京>濟(jì)南>新鄉(xiāng)。

表3 CP4-EPSPS蛋白在土壤中降解的指數(shù)模型

5 結(jié)論

本研究中，使用四種土壤中的CP4-EPSPS蛋白初始值相同均為100%，在其他環(huán)境條件，溫度、含水量等均一致的情況下，隨著掩埋天數(shù)的增加，CP4-EPSPS蛋白的含量均發(fā)生不一樣的變化，在試驗(yàn)前期大量快速降解，中后期少量緩慢降解，降解動態(tài)符合指數(shù)方程。

本試驗(yàn)表明土壤活性顆粒對CP4-EPSPS 蛋白有吸附作用[6]，通過與具有表面活性的土壤微粒結(jié)合，抑制土壤中外源蛋白的降解，吸附后CP4-EPSPS 蛋白就不能或極少被土壤微生物作為碳、氮源利用，造成CP4-EPSPS蛋白在土壤中長期存在并富集[7]。轉(zhuǎn)抗除草劑玉米中的CP4-EPSPS蛋白在土壤微生物的作用下，均能被慢慢降解，只有少數(shù)殘留，對土壤環(huán)境沒有明顯持續(xù)的負(fù)面影響[8]。因此，為了更加全面地評價其對生態(tài)環(huán)境的安全性，可進(jìn)一步考慮將降解試驗(yàn)擴(kuò)大到田間，將室內(nèi)模擬環(huán)境條件轉(zhuǎn)變成田間生態(tài)環(huán)境，從而對該試驗(yàn)進(jìn)行更加細(xì)致和長期的環(huán)境安全監(jiān)測。秸稈還田作為一種重要的途徑，既能夠在生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展形勢下合理利用農(nóng)業(yè)資源，又與本試驗(yàn)的理念相符合，可以本試驗(yàn)的結(jié)果作為理論基礎(chǔ)[8]。