不同產(chǎn)羔數(shù)和發(fā)情時期湖羊代謝產(chǎn)物及腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異分析研究

王智博,姚曉磊,張紅琳,張艷麗*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省家畜胚胎工程實驗室,江蘇 南京 210095;2.南京曉莊學院食品科學學院,江蘇 南京 211171)

動物胃腸道微生物區(qū)系平衡直接關(guān)系宿主(動物)的健康狀況和生產(chǎn)性能,當外界環(huán)境、日糧或應(yīng)激狀態(tài)改變時,微生物區(qū)系平衡會受到?jīng)_擊,進而影響機體生理狀態(tài)[1-3]。有報道,腸道微生物與機體內(nèi)生殖激素的濃度有關(guān)[4-5],其中腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化是調(diào)節(jié)機體雌激素水平的重要方式[6]。人類醫(yī)學研究也表明,腸道微生物會參與調(diào)節(jié)機體雌激素的代謝和卵巢發(fā)育。Kritas等[7]報道在日糧中添加益生菌后可以縮短母豬的繁殖周期。唐義梅[8]通過對梅山豬進行糞菌移植,發(fā)現(xiàn)腸道微生物可以提早母豬初情日齡,影響發(fā)情周期激素水平,促進卵泡發(fā)育。這些已有的研究提示:腸道微生物結(jié)構(gòu)與動物繁殖力可能存在一定的相關(guān)性。繁殖性能作為動物重要的生產(chǎn)性能指標,也可能與腸道微生物息息相關(guān)[7]。然而,目前關(guān)于腸道微生物的研究主要集中在動物營養(yǎng)、免疫和生理等方面,而有關(guān)腸道菌群與繁殖性能之間的相關(guān)研究很少。

湖羊作為我國特有的高繁殖力綿羊品種,產(chǎn)羔率達220%以上。排卵率和產(chǎn)羔數(shù)是高繁殖性能綿羊的重要經(jīng)濟性狀,而繁殖作為一個復(fù)雜的生理過程,其是否與腸道微生物存在相關(guān)性尚未見報道。此外,乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸等揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)是消化道內(nèi)生物代謝的產(chǎn)物,其濃度對動物的腸道健康具有影響[9]。因此,本試驗首次嘗試以單、多羔湖羊為研究對象,分別在發(fā)情前(撤栓時)和發(fā)情時2個階段采集糞樣,測定其VFA濃度,并進行高通量測序分析,探究不同繁殖力、不同發(fā)情時期湖羊的腸道菌群及VFA變化規(guī)律,為利用腸道微生物調(diào)控母羊繁殖性能提供理論依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及處理

試驗在泰州海倫國家級湖羊種羊場進行,依據(jù)生產(chǎn)記錄選取體重40～50 kg,年齡2～3歲,連續(xù)三胎產(chǎn)三羔(高繁組,high prolificacy,HP組)和產(chǎn)單羔(低繁組,low prolificacy,LP組)的健康空懷母羊12只,進行檢疫消毒驅(qū)蟲防疫。試驗羊舍通風良好,自然光照,試驗前用消毒劑對羊舍地面、墻壁和羊欄等進行徹底消毒,預(yù)飼期間對試驗羊進行健康檢查、驅(qū)蟲和健胃。試驗羊采用分欄飼養(yǎng),試驗開始第1天對試驗羊進行放栓處理,同時注射氯前列烯醇,11 d后撤栓,注射氯前列烯醇,次日用試情公羊開始試情(早晨、中午、傍晚各1次),母羊接受公羊爬跨視為發(fā)情。

每只羊采集5粒直腸內(nèi)容物(在落地污染前用20 mL固定管直接從羊肛門中取出),分別在撤栓時和發(fā)情時采集,采集后樣品于-80 ℃保存。具體試驗設(shè)計見表1。

表1 試驗分組Table 1 Experimental group

1.2 試驗方法

1.2.1 VFA的測定參照劉文濤等[10]的方法,其中氣相色譜儀測定改為采用毛細吸管柱,柱溫120 ℃,汽化溫度180 ℃,采用氫離子火焰檢測器,檢測溫度180 ℃,載氣為氦氣,壓力60 kPa,氫氣壓力50 kPa。

1.2.2 生物信息學分析將樣品送至百邁客生物科技有限公司的Illumina MiSeq平臺進行高通量測序。利用雙末端測序的方法,構(gòu)建小片段文庫進行測序。通過對reads拼接過濾,進行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)聚類和物種分類分析,并將序列相似度≥97%聚類同一OTU。同時使用Mothur(v.1.30)軟件,對樣品α多樣性指數(shù)進行評估,得到稀釋度曲線,香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、CHAO、ACE和Simpon指數(shù)用來評估樣品的測序深度、菌群多樣性。使用QIIME軟件進行β多樣性分析,得到β距離箱線圖,并進行UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic mean)分析和主坐標分析(principal coordinates analysis,PCoA)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單羔和多羔湖羊直腸內(nèi)容物中VFA含量的差異分析

各組直腸內(nèi)容物中VFA水平如表2所示。發(fā)情前,各組直腸內(nèi)容物中丙酸、丁酸、異戊酸含量均無顯著差異(P>0.05),但LP組直腸內(nèi)容物中乙酸含量顯著低于HP組(P<0.05)。發(fā)情時各組直腸內(nèi)容物中乙酸、丙酸、丁酸及異戊酸含量均無顯著差異(P>0.05)。對于LP組湖羊,發(fā)情時直腸內(nèi)容物中丙酸及丁酸含量顯著高于發(fā)情前(P<0.05)。發(fā)情時,HP組乙酸、丙酸及丁酸含量較發(fā)情前顯著提高(P<0.05),但異戊酸含量在各組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 繁殖力和不同發(fā)情時期對湖羊直腸內(nèi)容物中揮發(fā)性脂肪酸的影響Table 2 Effect of prolificacy and estrus cycle on volatile fatty acid(VFA)in Hu sheep rectal contents mmol·L-1

2.2 單羔和多羔湖羊腸道微生物的α多樣性分析

如圖1所示:測序共獲得OUT 928條,通過微生物α多樣性分析發(fā)現(xiàn)各組等級豐度曲線、稀釋性曲線和香農(nóng)指數(shù)均逐漸趨于平緩,說明樣品的測序深度已滿足試驗要求。通過計算Shannon、CHAO、Simpson和ACE指數(shù),不同發(fā)情時期及不同產(chǎn)羔數(shù)對腸道菌群構(gòu)成有一定的影響。

圖1 不同繁殖力及發(fā)情期對湖羊腸道微生物菌群多樣性指數(shù)的影響Fig.1 Effect of protificacy and estrus stage on intestinal microflora diversity index of Hu sheep*P<0.05,**P<0.01.

2.3 發(fā)情期湖羊腸道微生物物種注釋及差異分析

測序結(jié)果表明,在門水平共測得15種菌群,屬水平上發(fā)現(xiàn)172個。湖羊直腸內(nèi)容物中主要菌群構(gòu)成為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和變形菌門(Proteobacteria)。微生物菌群門水平分析表明(圖2-A,表3),HP組和LP組湖羊發(fā)情時,直腸內(nèi)容物中厚壁菌門和藍藻門菌群的比例均低于發(fā)情前,而擬桿菌門占比則均有所上升,且厚壁菌門和擬桿菌門與未發(fā)情組存在顯著差異。為進一分析樣品菌群的差異,本研究又進行了屬水平的分析(圖2-B,表4)。結(jié)果顯示,湖羊發(fā)情后,LP2組和HP2組的[Eubacterium]_coprostanoligenes_group和Akkermansia豐度均顯著下降(P<0.05),Rikenellaceae_RC9_gut_group 和擬桿菌屬(Bacteroides)豐度顯著提高(P<0.05)。

表3 不同發(fā)情期湖羊腸道微生物區(qū)系中門水平的相對豐度差異Table 3 The relative abundance difference of phylum in the gut microflora of Hu sheep in different estrous period

表4 不同發(fā)情期湖羊腸道微生物區(qū)系中屬水平的相對豐度差異Table 4 The relative abundance difference of genus in the gut microflora of Hu sheep in different estrous period

圖2 不同發(fā)情期和繁殖力湖羊腸道微生物區(qū)系中門(A)和屬(B)水平的相對豐度差異Fig.2 Relative abundance of phylum(A)and genus(B)of gut microflora of Hu sheep with different estrou periods and fecundity

2.4 不同發(fā)情期及產(chǎn)羔數(shù)對母羊腸道微生物β多樣性的影響

基于Weighted UniFrac距離的組間β多樣性分析表明:與發(fā)情前相比,HP組和LP組湖羊在發(fā)情時微生物群落構(gòu)成差異均極顯著(P<0.01);與LP2組相比,HP2組的菌群結(jié)構(gòu)也有顯著差異(P<0.05)(圖3-A)。基于Weighted UniFrac的UPGMA聚類樹顯示:樣品菌群基于是否發(fā)情大致聚集成2類,LP1組和HP1組間距離較近,而LP2組和HP2組則距離較遠(圖3-B),證明發(fā)情期對腸道菌群具有較大的影響。用PCoA分析腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn)HP2組和LP2組呈現(xiàn)區(qū)域性聚集,HP1組和LP1組所處區(qū)域距離較遠(圖3-C),與UPGMA結(jié)果一致。證明繁殖力和發(fā)情期對腸道菌群均具有較大的影響。

圖3 發(fā)情周期對胡羊母羊腸道微生物多樣性組成的影響Fig.3 Effect of estrous cycle on microbial diversity in the intestine of Hu sheepA. 基于β多樣性箱型圖β diversity box plot;B. UPGMA聚類樹UPGMA clustering tree;C. 多樣本主坐標分析(n=3)Multi-sample principal coordinate analysis(PCoA).

3 討論

動物生殖與腸道微生物關(guān)系密切,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),腸道中棲息著龐雜繁多的微生物菌群,發(fā)揮著動物第二“大腦”的作用,不僅調(diào)控著宿主營養(yǎng)吸收、能量供應(yīng)和疾病的發(fā)生與發(fā)展,而且影響著動物的情緒、行為、生理狀態(tài)等,其腸道菌群與動物生殖生理密切相關(guān)[11-14],可能會影響到動物的繁殖性能。飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂綿羊模型中,腸道菌群失調(diào)與膽汁酸水平降低影響脂溶性維生素A在腸-睪軸的運輸,睪丸中維生素A缺乏導(dǎo)致精子發(fā)生異常[15]。腸道微生物可以通過代謝生物體內(nèi)雌激素以調(diào)控雌激素功能活性[4]。湖羊因其多胎性能而倍受關(guān)注,在繁殖、營養(yǎng)、生理等方面已有較多研究[16-17],但有關(guān)其繁殖性能與腸道菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)性研究未見報道。本研究結(jié)果顯示,不同繁殖力湖羊的腸道微生物存在差異,提示腸道微生物對動物的繁殖力有一定影響。研究表明機體雌激素的代謝與腸道菌群有關(guān)[6,18-19]。據(jù)此推測微生物可能通過影響激素代謝進而影響動物繁殖力,但是具體機制尚需進一步研究。

本試驗結(jié)果顯示,在門水平上,湖羊發(fā)情時,厚壁菌門和藍藻菌門豐度會顯著降低;在屬水平上,湖羊發(fā)情后,高繁組和低繁組中Ruminococcaceae-UGG-013豐度均顯著下降,Rikenellaceae_RC9_gut_group和擬桿菌屬Bacteroides豐度顯著提高。另外,雌激素也會影響腸道菌群中Ruminococcaceae科的豐度[20];Kwa研究發(fā)現(xiàn),Bacteroides和Ruminococcaceae參與人體雌激素代謝[5]。而雌激素與動物的生殖系統(tǒng)發(fā)育以及發(fā)情周期的調(diào)控密切相關(guān)[21-22]。本試驗基于UPGMA聚類樹和PCoA結(jié)果可以看出,發(fā)情時,高繁組和低繁組湖羊直腸菌群結(jié)構(gòu)差異明顯,提示湖羊繁殖力的高低與菌群結(jié)構(gòu)可能存在一定關(guān)聯(lián)。

VFA作為腸道微生物的代謝產(chǎn)物,對動物發(fā)情周期有影響。田鼠發(fā)情會改變其胃腸道中VFA含量[23];動物腸道中 VFA 含量與直腸內(nèi)容物總菌數(shù)、腸桿菌數(shù)、乳酸桿菌數(shù)有關(guān),妊娠動物直腸內(nèi)容物中 VFA 與對照組差異顯著時,腸道菌群也差異顯著[24]。本研究中,在低繁組和高繁組中,未發(fā)情時丙酸及丁酸含量均顯著低于發(fā)情組;在高繁組中,未發(fā)情時直腸內(nèi)容物中乙酸含量顯著低于發(fā)情組。由于乙酸及丙酸是腸道菌群主要的代謝產(chǎn)物,這同樣說明不同發(fā)情時期湖羊的腸道菌群結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同變化。

總之,本試驗通過VFA含量的測定和對菌群結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)不同繁殖力和發(fā)情時期的湖羊在腸道菌群結(jié)構(gòu)上均存在差異。表明湖羊繁殖性能與腸道微生物變化可能存在一定的相關(guān)性,但具體的調(diào)控機制還有待進一步研究。本試驗結(jié)果為利用腸道微生物調(diào)控母羊繁殖性提供了理論依據(jù)和新思路。