禽流感DNA疫苗(H5亞型Re-8株)對黃羽肉雞免疫程序的優(yōu)化

唐榮宏,范莉莉,王冬雪,李亞杰,郁宏偉,楊保收,鮑恩東

(天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司,天津 300308)

禽流感(avian influenza,AI)是A類禽類烈性傳染病之一,由正黏病毒科的A型流感病毒所引起,該病毒為單股、負鏈RNA病毒,禽類、鳥類、人類及低等哺乳動物為其易感動物[1]。A型流感病毒分為多種亞型,其中H5、H7亞型屬于高致病性強毒株,由其引發(fā)的高致病性禽流感具有發(fā)病急、傳播速度快、死亡率高等特點。2003年以來,H5亞型高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza,HPAI)在我國多數(shù)地區(qū)呈現(xiàn)不同程度的爆發(fā),嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[2]。不僅如此,我國已有HPAI(H5亞型)感染人并致死的報道[3-4]。H5亞型HPAI作為一種人獸共患病,對人類安全及動物健康具有嚴重危害,因此對其防控具有重要的經(jīng)濟及公共衛(wèi)生意義。

目前我國主要采用免疫接種H5亞型禽流感滅活疫苗的方式來預(yù)防禽流感[5-6]。然而,禽流感滅活疫苗具有干擾臨床檢疫(檢測)及流行病學(xué)調(diào)查等缺點。作為第3代疫苗的DNA疫苗不僅具有滅活苗的安全性,不會干擾臨床檢疫及流行病學(xué)調(diào)查,而且還具有以下優(yōu)點:1)可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生全面的免疫反應(yīng)——體液免疫和細胞免疫;2)能不斷刺激機體產(chǎn)生抗體,免疫效力持續(xù)時間長[7];3)有利于多價苗及多聯(lián)苗的研制,疫苗生產(chǎn)簡便、易于運輸且成本低廉。因此,越來越多的學(xué)者致力于研究禽流感DNA疫苗,包括其免疫原性、免疫保護效力、與其他類型疫苗聯(lián)合免疫等方面。與用同一種疫苗免疫相比,聯(lián)合免疫更能刺激機體產(chǎn)生更強的體液免疫反應(yīng)和更高的抗體效價[8-12]。本試驗的主要目的在于探索禽流感(H5亞型Re-8株)DNA疫苗用于黃羽肉雞的合理免疫程序,及其與H5亞型禽流感滅活苗聯(lián)合免疫的免疫效果,為防控H5亞型禽流感提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與受試疫苗

210羽1日齡黃羽肉雞購自溫氏公司滄州孵化場。受試疫苗H5禽流感D7+rD8二價滅活疫苗購自廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司(批號1709001);H5亞型禽流感DNA疫苗(pDNA Re-8)由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司生物制品研究分院提供(1.0 mg·mL-1,批號20160722)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組將1日齡未免疫禽流感疫苗的210羽健康黃羽肉雞隨機均分為A、B、C、D、E、F、G共7組,每組30羽。具體分組及處理見表1。

表1 試驗分組信息及免疫接種程序Table 1 Trial grouping information and immunization program

1.2.2 血清采集A、B和C組受試雞分別于免疫前及免疫后1、2及3周采集血樣;D、E、F組受試雞于首免后1、2、3周以及加強免疫后1、2、4、6、8、10、12周采集血樣;G組(空白對照組)受試雞于1、7、14、21、28、35、42、49、63、77、91日齡時采集血樣。各組受試雞在各采樣時間點均采取翅下靜脈方式采集血液,每羽0.5 mL。分離血清作為待檢樣品。

1.2.3 抗體檢測采用血凝(HA)及血凝抑制(HI)方法檢測抗體滴液(HI效價log2)。具體操作按照《中國獸藥典》(2005版)所述進行,即HA試驗測出H5亞型禽流感Re-8株血凝價,根據(jù)測定的血凝價配制HI試驗所需要的4單位抗原。檢測結(jié)束后,對所得結(jié)果進行判斷:陽性(HI效價≥4)、陰性(HI效價≤3)、可疑(3

1.3 數(shù)據(jù)處理

抗體滴度(HI效價)采用算數(shù)平均數(shù)表示;抗體合格率=合格抗體數(shù)/檢測數(shù)×100%。用GraphPad及SPSS 16.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃羽肉雞禽流感母源抗體消長規(guī)律

空白對照G組受試雞血清樣品的抗體滴度(HI效價)效價檢測結(jié)果如圖1所示。黃羽肉雞母源抗體HI效價在7～14 d時下降最快(由5.1降至3.5),抗體合格率也由88.9%降至39.3%。14 d后其母源抗體的保護作用顯著降低,不足以產(chǎn)生對雞群的免疫保護。

圖1 黃羽肉雞禽流感(H5亞型Re-8株)母源抗體消長規(guī)律及母源抗體合格率Fig.1 Fluctuation and growth of maternal antibody to avian influenza(H5 subtype RE-8 strain)in Yellow broiler and qualified rate of maternal antibody

2.2 禽流感DNA疫苗(H5亞型 Re-8株)單次免疫效果比較

不同日齡(1、10、14日齡)受試雞單次免疫禽流感DNA疫苗(pDNA Re-8株)后其血清樣品抗體滴度檢測結(jié)果(圖2)所示:C組(14日齡免疫)受試雞血清抗體的HI效價及合格率在免疫DNA疫苗1周后即出現(xiàn)上升(由2.3升至4.1);B組(10日齡免疫)受試雞血清抗體HI效價在免疫后2周出現(xiàn)上升(由3.5升至3.8);A組(1日齡組)受試雞血清抗體HI效價免疫后3周內(nèi)一直呈現(xiàn)下降趨勢。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,A、B、C 3組受試雞血清抗體HI效價及合格率差異均不顯著(P>0.05),C組受試雞呈現(xiàn)出的免疫效果優(yōu)于A組和B組。

圖2 禽流感DNA疫苗(H5亞型Re-8株)單次免疫效果(A)和抗體合格率(B)比較Fig.2 Comparison of single immune effect(A)and passing rate of antibody(B)of avian influenza DNA vaccine(H5 subtype RE-8 strain)

2.3 禽流感DNA疫苗加強免疫對黃羽肉雞的免疫效果比較

用pDNA Re-8疫苗對黃羽肉雞進行不同日齡首免后,再次追加免疫DNA疫苗或二價滅活疫苗,受試雞血清禽流感病毒抗體滴度檢測結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出:F組(10和31日齡2次經(jīng)頸背部皮下注射H5禽流感D7+rD8二價滅活疫苗)受試雞血清抗體HI效價最高;其次是E組受試雞(10日齡,肌肉注射pDNA Re-8疫苗,31日齡時再次經(jīng)過頸背部皮下注射H5禽流感D7+rD8二價滅活疫苗);而D組(14和35日齡2次經(jīng)肌肉注射pDNA Re-8疫苗)受試雞血清抗體HI效價普遍低于F組和E組。然而,3個試驗組受試雞血清中相應(yīng)抗體的持續(xù)期均較長(抗體HI效價>5)。F組受試雞抗體合格率在免疫期一直處于較高水平,D、E組受試雞血清抗體合格率在免疫后持續(xù)增高,免疫后2周均達到50%以上,為雞群提供較好的免疫保護。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,D、E 2組受試雞的抗體HI效價及抗體合格率差異均不顯著(P>0.05),而D、F 2組受試雞血清抗體HI效價及抗體合格率差異顯著(P<0.05),E、F 2組抗體HI效價及抗體合格率差異均不顯著(P>0.05)。因此,F組的免疫效果最佳,其次是E組,然后是D組。D、E和F這3組受試雞在免疫后抗體均能較快升至5.0,可為雞群提供長期的免疫保護。

圖3 加強免疫對H5禽流感DNA疫苗免疫雞血清抗體滴度(HI效價,A)及抗體合格率(B)比較Fig.3 Comparison of HI titer(A)and passing rate(B)of serum antibody against H5 avian influenza DNA vaccine immunized chicken by enhanced immunization

3 討論

近年來,AI新毒株在中國廣泛傳播并導(dǎo)致人感染[1,13],其中至少包含6個亞型(H5N1、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8和H5N6)的AIV[14]。以常用的H5N1亞型禽流感滅活疫苗應(yīng)對新出現(xiàn)的AIV或許已不能滿足AI防控的要求了。目前關(guān)于DNA疫苗的研究較多,已顯示出其在傳染病預(yù)防方面的重要性[15-16]。因此,本文選取禽流感(H5亞型,Re-8株)DNA疫苗與在市面上銷售的H5禽流感D7+rD8二價滅活疫苗進行免疫效果的評價與分析,為DNA疫苗的實際應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

大部分滅活疫苗的免疫效果會受母源抗體的影響,而DNA疫苗的免疫效果不受母源抗體的影響[17]。為更加貼近生產(chǎn)實際,本研究將單次免疫禽流感疫苗的受試雞日齡設(shè)為1、10和14日齡,試驗結(jié)果顯示黃羽肉雞免疫禽流感DNA疫苗的最佳日齡為14日齡,其次為10日齡,這一結(jié)果與文獻[18]的結(jié)果不同。究其原因,可能是隨著雛雞不斷成長,其免疫系統(tǒng)發(fā)育愈發(fā)成熟,肌肉組織處于快速發(fā)育階段,進入肌纖維的DNA質(zhì)粒及表達的抗原越多,免疫系統(tǒng)對抗原的遞呈越有效、應(yīng)答越快[19-24],當(dāng)?shù)腿正g進行DNA疫苗免疫時,雛雞母源抗體過高會中和DNA疫苗抗原。

為探究較優(yōu)的免疫程序以實現(xiàn)對黃羽肉雞提供較好保護力,本研究將DNA疫苗與市售禽流感二價疫苗進行單獨及聯(lián)合免疫,結(jié)果顯示,E組受試雞血清抗體HI效價和抗體合格率在免疫期的前期低于F組,但其抗體水平足以達到保護雞群免于AIV感染,且2組間的差異不顯著,說明禽流感DNA疫苗與目前市售滅活苗聯(lián)合免疫可以給雞群提供良好免疫保護。本試驗中,D組受試雞免疫效果整體比E組及F組差,但其抗體HI效價大于4,免疫合格率大于50%,也可實現(xiàn)對雞群的免疫保護。

通過對黃羽肉雞禽流感DNA疫苗(H5亞型Re-8株)免疫效果和免疫程序研究,我們初步認為以下2種免疫程序可以獲得對禽流感較佳的免疫保護效果:第1種為14日齡首免禽流感(H5亞型Re-8株)DNA疫苗,每羽30 μg,21 d后同等劑量加強免疫,其所產(chǎn)生的HI抗體足夠保護雞群免于AIV的感染;第2種為10日齡首免禽流感DNA疫苗,每羽30 μg,21 d后免疫禽流感H5亞型滅活苗0.3 mL,受試雞產(chǎn)生的抗體高,持續(xù)期長。