楊梅枯萎病拮抗內(nèi)生菌的分離及其抑菌機制研究

曹鵬飛，劉青娥

(1.麗水市農(nóng)林科學研究院，浙江 麗水 323000； 2.麗水學院，浙江 麗水 323000)

楊梅是我國南方特色水果，種植面積和產(chǎn)量均占全世界的90%以上[1-2]。隨著楊梅產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴大，楊梅病害也不斷增多，其中枯萎病最為突出。楊梅枯萎病主要是由異色擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisversicolor)和小孢擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsismicrospora)引起的發(fā)病率極高的毀滅性真菌病害[3]，發(fā)病率為35%～100%，最高死亡率達80%[4]，具有潛伏時間長、侵染范圍廣、死株嚴重、防治難度大等特點，被稱為楊梅癌癥[5]。目前，對枯萎病的防治以土壤清潔或噴灑化學殺菌劑為主，但效果不理想，且長期使用化學農(nóng)藥易引起抗藥性、藥物殘留、環(huán)境污染等問題。因此，尋找低毒、高效的防治手段迫在眉睫。

微生物防治具有高效性、選擇性強、不易產(chǎn)生抗藥性、對人畜低毒等特點，是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ姆乐畏椒ā５酝^大多數(shù)的枯萎病拮抗菌株主要是從土壤或根際分離篩選得到，其與土傳病原真菌的競爭作用易受外界環(huán)境因素影響，不易在土壤中定殖生存，很大程度降低了防病促生效果[6-7]。植物內(nèi)生菌是指在植物生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官的細胞間隙或細胞內(nèi)的微生物類群。相對其他生防菌，植物內(nèi)生菌生存環(huán)境相對穩(wěn)定，不易受溫度、滲透壓、紫外輻射等環(huán)境因素影響，能在體內(nèi)長期定殖，從而有效地抑制病原菌生長，控制病害或提高植株抗病性，獨特的優(yōu)勢使其成為一類極具開發(fā)和應(yīng)用潛力的生防資源[8]。近些年來，已分離出了一些拮抗枯萎病的植物內(nèi)生菌，如徐亞軍等[9]從野艾蒿中分離篩選出7株對棉花枯萎病有明顯抑制作用的內(nèi)生菌株。易天鳳等[10]從海南廣藿香中分離獲得了61株內(nèi)生真菌，其中鐮刀菌屬(Fusarium)菌株 PfuJ20、PfuG16 和 PfuG5 對澳洲堅果葉枯病菌的抑制效果最好，棒孢屬(Corynespora)菌株 PfuH2 對西瓜枯萎病菌抑菌效果較好。但對拮抗枯萎病病原菌的內(nèi)生菌研究主要集中在分離篩選以及活性測定上，關(guān)于抑菌機制僅有零星報道。此外，現(xiàn)有分離的拮抗枯萎病內(nèi)生菌菌株主要針對的是由尖孢鐮刀菌引起的棉花[11]、香蕉[6,12]、黃瓜[13]、西瓜[7]等植物的枯萎病，而關(guān)于拮抗由擬盤多毛孢菌引起的楊梅枯萎病植物內(nèi)生菌的分離報道更是罕見。鑒于此，以擬盤多毛孢菌為研究對象，從健康的楊梅植株、魚腥草、金銀花等植物中分離篩選出對楊梅枯萎病病原菌有拮抗作用的內(nèi)生菌株，并對其抑菌機制進行研究，旨在為楊梅枯萎病的防治提供新的生防資源，為闡明內(nèi)生菌對枯萎病拮抗機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 新鮮健康的楊梅植株采自青田縣；魚腥草、鳳尾草、金銀花采自麗水白云山。

1.1.2 供試病原菌菌株 從發(fā)病的楊梅枯枝中分離獲得擬盤多毛孢菌。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要儀器 臺式高速離心機(德國 SIGMA Laborzentrifugen Gmb H，3K15)、超微量紫外分光光度計(美國 Quawell 公司，Q5000)、超聲波破碎儀(北京星越天成科技有限公司，Sonifier 250D/450D)等。

1.2.2 主要試劑 蘋果酸脫氫酶(MDH)試劑盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，麥角甾醇標準品購于北京世紀奧科生物科技有限公司，pBR322 DNA購于北京鼎國生物科技有限公司等。

1.2.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨、PDA、高氏一號等培養(yǎng)基[14]，分別用于內(nèi)生細菌、真菌和放線菌的分離培養(yǎng)。另外，PDA培養(yǎng)基也用于楊梅枯萎病病原真菌擬盤多毛孢菌的培養(yǎng)。

1.3 內(nèi)生菌的分離

取健康楊梅、魚腥草、鳳尾草、金銀花等植物的根莖葉，采用表面組織消毒法[15-16]，將其接種于培養(yǎng)基上，于適宜溫度培養(yǎng)2～7 d，觀察菌落生長情況，挑取單菌落，經(jīng)純化后4 ℃保存。

1.4 楊梅枯萎病優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株的篩選

1.4.1 內(nèi)生菌胞外代謝產(chǎn)物的制備 分離得到的內(nèi)生菌株經(jīng)活化后，用無菌水制成10 mL的菌懸液，接入相應(yīng)的培養(yǎng)液，于適宜溫度振蕩培養(yǎng)2～5 d，離心取上清液濃縮至20 mL，經(jīng)冷凍干燥后配成質(zhì)量濃度為0.5 g/mL溶液，過濾除菌備用。

1.4.2 優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株的篩選 采用菌絲生長抑制率法[17]。將內(nèi)生菌株的胞外代謝產(chǎn)物與冷卻至50 ℃的PDA培養(yǎng)基混合后倒平板，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度為0.2 g/mL，以加無菌水的PDA培養(yǎng)基為空白對照。用打孔器(直徑6.5 mm)打取病原菌擬盤多毛孢菌的菌絲塊，菌面朝下，移至平板中央，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，每天用游標卡尺十字交叉法測量菌落直徑，等空白對照菌落布滿培養(yǎng)皿2/3以上時停止測量，同一處理重復(fù)3次。菌絲生長抑制率按公式計算，生長抑制率=(空白組菌落直徑-處理組菌落直徑)/空白組菌落直徑×100%。根據(jù)菌絲生長抑制率大小篩選出楊梅枯萎病病原菌優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株。

1.4.3 優(yōu)勢菌株最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和EC50、EC90的確定 采用二倍稀釋法[18]配制不同質(zhì)量濃度含優(yōu)勢菌株胞外代謝產(chǎn)物的PDA培養(yǎng)基，以無菌水作空白對照，移植病原菌菌塊于培養(yǎng)基，測定菌絲生長抑制率，以完全抑制病原菌生長的最低質(zhì)量濃度作為MIC。采用劑量對數(shù)抑菌率-概率值法計算EC50、EC90及毒力回歸方程[19]。

1.5 楊梅枯萎病優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株的鑒定

參照《真菌鑒定手冊》[20]，根據(jù)菌落的形態(tài)特征、菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)確定其種屬。

1.6 楊梅枯萎病優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株抑菌機制研究

1.6.1 優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株對病原菌菌絲形態(tài)的影響 用打孔器(直徑6.5 mm)打取病原菌擬盤多毛孢菌菌絲塊，接入10 mL PDA培養(yǎng)液，分別加入優(yōu)勢內(nèi)生菌株的胞外代謝產(chǎn)物，使其質(zhì)量濃度為EC50和EC90，以無菌水為對照，振蕩培養(yǎng)48 h后，4 000 r/min 離心10 min，收集菌絲，抽干水分，采用乳酸石炭酸棉藍染色法進行鏡檢，觀察菌絲形態(tài)變化。

1.6.2 優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株對病原菌細胞壁的影響 按1.6.1中方法用優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株胞外代謝產(chǎn)物對病原菌分別處理0、12、24、36、48、60 h，取病原菌菌絲加0.05 mol/L Tris-HCl冰浴研磨，10 000 r/min、4 ℃離心，取上清液，參照劉芳等[21]的方法于波長544 nm下測定N-乙酰葡萄糖胺含量和幾丁質(zhì)酶活性。以每分鐘產(chǎn)生1 μmol N-乙酰葡萄糖胺所需酶量表示幾丁質(zhì)酶活性。

1.6.3 優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株對病原菌細胞膜的影響 按1.6.1中方法用優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株胞外代謝產(chǎn)物對病原菌分別處理0、2、4、6、8、10 h，取培養(yǎng)液于4 000 r/min離心10 min，取上清，采用考馬斯亮藍G-250染色法[22]測定可溶性蛋白含量；根據(jù)苯酚-硫酸法[23]測定可溶性糖含量。收集處理72 h的菌絲，用石油醚提取，于282 nm波長下測吸光值，同時繪制標準曲線，根據(jù)吸光值計算麥角甾醇含量。

1.6.4 優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株對病原菌RNA含量的影響 按1.6.1中方法用優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株胞外代謝產(chǎn)物對病原菌分別處理12、24、36、48、60 h，取菌絲用Trizol法[24]提取RNA，用超微量紫外分光光度計測定其含量。

1.6.5 優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株對病原菌呼吸代謝的影響 按1.6.1中方法用優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株胞外代謝產(chǎn)物對病原菌分別處理24、48、72 h，5 000 r/min離心10 min，收集菌絲，加0.1 mol/L Tris-HCl冰浴研磨，參考徐明生等[25]的方法制備粗酶液，用試劑盒測蘋果酸脫氫酶(MDH)及琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性。

1.6.6 優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株對病原菌拓撲異構(gòu)酶Ⅰ活性的影響 取培養(yǎng)72 h楊梅枯萎病病原菌菌絲用1×PBS磷酸緩沖液重復(fù)洗滌2次，4 000 r/min離心10 min，取菌絲，參照SULLIVAN等[26]的方法制備拓撲異構(gòu)酶Ⅰ粗酶液。在2 μL稀釋粗酶液中加入0.5 μg超螺旋pBR322質(zhì)粒DNA、2 μL不同質(zhì)量濃度的優(yōu)勢內(nèi)生菌株胞外代謝產(chǎn)物，用雙蒸水補至20 μL，37 ℃溫浴30 min后于1%瓊脂糖凝膠進行電泳。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均采用DPS 16.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅枯萎病拮抗優(yōu)勢內(nèi)生菌株的分離和篩選

從健康楊梅、鳳尾草、魚腥草和金銀花中分離得到內(nèi)生菌22株，包括內(nèi)生細菌和真菌各7株，內(nèi)生放線菌8株。對楊梅枯萎病病原菌有拮抗作用的共有14株，各菌株之間的生長抑制率差異極顯著(F=34.918，P<0.01)，結(jié)果如表1所示。其中，分別從鳳尾草和健康楊梅植株分離的FWB1J、YMB1J菌株抑菌效果最好，生長抑制率分別約為83.61%、82.67%，將FWB1J和YMBIJ菌株作為楊梅枯萎病拮抗優(yōu)勢內(nèi)生菌株。

表1 不同內(nèi)生菌菌株對楊梅枯萎病病原菌的生長抑制率Tab.1 Growth inhibition rate of different endophytic strain against fusarium wilt pathogen of myrica %

2.2 FWB1J和YMBIJ菌株的鑒定

FWB1J菌落形態(tài)如圖1所示，白色菌絲，致密，菌落形態(tài)為圓形，向四周擴展，產(chǎn)綠色孢子，中央變成綠色。分生孢子梗形態(tài)如圖2所示，分生孢子梗略彎曲，尖端生分生孢子團，孢子無色，球形至卵形。YMB1J菌落形態(tài)如圖3所示，菌落表面光滑、濕潤、黏稠，邊緣不規(guī)整、不透明，正反面和邊緣的顏色均一，呈乳白色。菌體細胞形態(tài)如圖4所示，子細胞不脫落分離，細胞成串排列，形成類菌絲狀，無子囊孢子。根據(jù)《真菌鑒定手冊》[20]初步鑒定FWB1J為木霉屬(Trichoderma)，YMB1J為假絲酵母屬(Candida)。

圖1 FWB1J菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of FWB1J strain

圖2 FWB1J菌株菌絲形態(tài)Fig.2 Mycelial morphology of FWB1J strain

圖3 YMB1J菌株菌落形態(tài) Fig.3 Colony morphology of YMB1J strain

圖4 YMB1J菌株菌體形態(tài) Fig.4 Mycelial morphology of YMB1J strain

2.3 FWB1J和YMBIJ菌株對楊梅枯萎病病原菌MIC及EC50和EC90的確定

在0.100 0～0.400 0 g/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，隨著內(nèi)生菌株胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，病原菌的生長抑制率增加。當FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度達0.400 0 g/mL時，病原菌在平板上不生長，因此確定0.400 0 g/mL為這2個菌株胞外代謝產(chǎn)物對楊梅枯萎病病原菌的 MIC。在0.012 5～0.200 0 g/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度越高，其對枯萎病病原菌的抑制作用越強，在質(zhì)量濃度為0.200 0 g/mL時，兩者的抑制率分別達89.16%、85.89%。通過劑量對數(shù)抑菌率-概率值法分析可得FWB1J和YMB1J菌株的毒力回歸方程，分別為y=6.951 5+1.337 4x，R=0.986 6和y=7.088 4+1.357 9x，R=0.979 7。根據(jù)方程可知，其EC50分別為0.034 7、0.029 0 g/mL，EC90分別為0.315 5、0.254 6 g/mL。

2.4 FWB1J和YMBIJ菌株對楊梅枯萎病病原菌的抑菌機制

2.4.1 對楊梅枯萎病病原菌菌絲形態(tài)的影響 經(jīng)FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物處理48 h后的枯萎病病原菌菌絲形態(tài)如圖5所示。對照組菌絲細長、光滑，經(jīng)質(zhì)量濃度為EC50的FWB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后的菌絲出現(xiàn)分支，在質(zhì)量濃度為EC90時菌絲出現(xiàn)膨大，表面粗糙。經(jīng)質(zhì)量濃度為EC90的YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌菌絲比EC50處理下膨大，且部分菌絲中出現(xiàn)大液泡，表面粗糙。說明2株優(yōu)勢拮抗菌株胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度越高，對枯萎病病原菌菌絲形態(tài)的影響越大。

a—e：CK，F(xiàn)WB1J胞外代謝產(chǎn)物EC50、EC90，YMB1J胞外代謝產(chǎn)物EC50、EC90處理48 h后 a—e: CK,48 h after treated by the EC50 and EC90 of extracellular metabolites from FWB1J strain and YMB1J strain 圖5 FWB1J和YMB1J菌株對楊梅枯萎病病原菌菌絲形態(tài)的影響Fig.5 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on the mycelium morphology of fusarium wilt pathogen of myrica

2.4.2 對楊梅枯萎病病原菌細胞壁的影響 從圖6可知，整體上經(jīng)FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌N-乙酰葡萄糖胺含量極顯著高于對照(F=3.2×105，P<0.01)。對照組在0～24 h內(nèi)N-乙酰葡萄糖胺含量升高， 在24 h達到最大值，之后逐漸下降。而經(jīng)FWB1J、YMB1J菌株處理后，在0～36 h內(nèi)N-乙酰葡萄糖胺含量升高，在36 h時達最大值，YMB1J菌株質(zhì)量濃度EC90處理組比對照組高176.700 μg/g，36 h之后含量逐漸降低。說明其胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度越高，病原菌的N-乙酰葡萄糖胺含量越高。如圖7所示，隨處理時間的延長，對照組幾丁質(zhì)酶活性維持在較低水平，經(jīng)FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌幾丁質(zhì)酶活性先增加后降低，并極顯著高于對照(F=1.0×104，P<0.01)。在36 h時，2株優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌胞外代謝產(chǎn)物處理組的幾丁質(zhì)酶活性達最大。可見，在處理36 h時，優(yōu)勢拮抗內(nèi)生菌株處理組的N-乙酰葡萄糖胺含量和幾丁質(zhì)酶活性同時達到最大，表明此時幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)并產(chǎn)生大量N-乙酰葡萄糖胺，使病原菌細胞壁完整性被破壞。

圖中FW、YM分別代表FWB1J、YMB1J，下同F(xiàn)W and YM in the figure represent FWB1J and YMB1J respectively，the same below圖6 FWB1J和YMB1J菌株對N-乙酰葡萄糖胺含量的影響Fig.6 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on N-acetylglucosamine content

2.4.3 對楊梅枯萎病病原菌細胞膜的影響 由圖8可知，隨處理時間延長，對照組可溶性糖滲漏量維持在較低水平，經(jīng)FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后，病原菌可溶性糖滲漏量不斷增加，并極顯著高于對照(F=302 1，P<0.01)。在處理10 h時滲漏量達到最大，其中YMB1J菌株質(zhì)量濃度EC90處理組的可溶性糖滲漏量高達9 300.000 μg/g。如圖9所示，病原菌可溶性蛋白滲漏量趨勢與可溶性糖相似，經(jīng)FWB1J、YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后病原菌的可溶性蛋白滲漏量極顯著高于對照(F=379.48，P<0.01)。隨處理時間延長，可溶性蛋白滲漏量逐漸增加，在10 h時滲漏量達最大，其中FWB1J菌株質(zhì)量濃度EC90處理組可溶性蛋白滲漏量較對照高14.350 μg/g。說明優(yōu)勢拮抗菌株胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度越高，病原菌細胞膜通透性越大，使內(nèi)含物大量滲漏。

圖7 FWB1J和YMB1J菌株對幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.7 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on chitinase activity

圖8 FWB1J和YMB1J菌株對可溶性糖滲漏量的影響Fig.8 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on the soluble sugar leakage

圖9 FWB1J和YMB1J菌株對可溶性蛋白滲漏量的影響Fig.9 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on the soluble protein leakage

如圖10所示，經(jīng)FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物處理的病原菌麥角甾醇含量與對照組差異極顯著(F=124.2，P<0.01)。對照組麥角甾醇含量最高，經(jīng)2株優(yōu)勢菌株處理后，其含量明顯降低。且隨著胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度的升高，病原菌麥角甾醇含量逐漸降低，其中FWB1J菌株質(zhì)量濃度EC90處理組含量最低，比對照組降低了82.460 μg/g?？梢?，優(yōu)勢菌株胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度越高，對麥角甾醇的合成抑制作用越強，細胞膜結(jié)構(gòu)破壞越嚴重。

不同小寫字母表示5%顯著水平(P<0.05)，不同大寫字母表示1%極顯著水平(P<0.01),下同Different lowercase letter represents 5% significant level(P<0.05)， different uppercase letter represents 1% significant level(P<0.05)，the same below圖10 FWB1J和YMB1J菌株對麥角甾醇含量的影響Fig.10 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on the ergosterol content

2.4.4 對楊梅枯萎病病原菌菌體RNA含量的影響 從圖11可知，當處理時間為12 h時，各處理組RNA含量差異不明顯。自24 h開始，各處理組RNA含量逐漸增加，但經(jīng)FWB1J、YMB1J菌株作用后，病原菌RNA含量極顯著低于對照(F=1.1×105，P<0.01)。至60 h時，F(xiàn)WB1J菌株質(zhì)量濃度EC90處理組的RNA含量較低，較對照組低16.450 μg/g。說明2株優(yōu)勢菌株胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度越高，對病原菌核酸的抑制作用越強。

圖11 FWB1J和YMB1J菌株對RNA含量的影響Fig.11 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on the RNA content

2.4.5 對楊梅枯萎病病原菌呼吸作用的影響 由圖12、13可知，0～24 h，經(jīng)FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物處理后病原菌SDH活性與對照無明顯差異，自48 h開始SDH活性極顯著低于對照(F=46.3，P<0.01)。在0～48 h病原菌MDH活性與對照差異極顯著(F=190.9，P<0.01)。至72 h時，2種酶活性下降最大，其中FWB1J菌株質(zhì)量濃度EC90處理組SDH和MDH活性最低，比對照分別降低2.750、318.330 U/mg。FWB1J和YMB1J菌株質(zhì)量濃度EC90處理組SDH和MDH活性均低于EC50組。這說明FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物對病原菌呼吸有抑制作用，并且質(zhì)量濃度越高，對呼吸酶的抑制作用越強，從而對能量代謝系統(tǒng)產(chǎn)生影響。SDH、MDH活性下降可能是因為優(yōu)勢菌株胞外代謝產(chǎn)物中的有效成分與酶結(jié)合，使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖12 FWB1J和YMB1J菌株對SDH活性的影響Fig.12 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on SDH activity

圖13 FWB1J和YMB1J菌株對MDH活性的影響Fig.13 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on MDH activity

2.4.6 對楊梅枯萎病病原菌拓撲異構(gòu)酶Ⅰ活性的影響 從圖14可知，對照Form Ⅰ(超螺旋)逐漸減少，F(xiàn)orm Ⅱ(開環(huán)或線性)逐漸增加。隨著FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，F(xiàn)orm Ⅱ(開環(huán)或線性)逐漸減少，F(xiàn)orm Ⅰ(超螺旋)逐漸增加，其中經(jīng)質(zhì)量濃度為EC90的FWB1J菌株處理后，F(xiàn)orm Ⅰ(超螺旋)最多。這說明2株優(yōu)勢菌株胞外代謝產(chǎn)物對拓撲異構(gòu)酶活性有抑制作用，并且質(zhì)量濃度越高，抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅰ對pBR322 DNA解旋的作用越強。

a:pBR322 DNA;b:FWB1J 菌株EC90組;c:FWB1J 菌株EC50組;d:YMB1J 菌株EC90組; e:YMB1J 菌株EC50組; f:對照組a:pBR322 DNA；b:FWB1J strain EC90 group； c:FWB1J strain EC50 group； d:YMB1J strain EC90 group； e:YMB1J strain EC50 group；f:Control group圖14 FWB1J和YMB1J菌株對拓撲異構(gòu)酶Ⅰ活性的影響Fig.14 Effect of FWB1J strain and YMB1J strain on topoisomerase Ⅰ

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生菌多樣性十分豐富，由于特殊的生存環(huán)境，在生長和代謝過程中植物內(nèi)生菌可產(chǎn)生各種具有特殊化學結(jié)構(gòu)類型和特殊生理功能的活性物質(zhì)，使其在生物防治方面得到廣泛關(guān)注。但近年來分離出的抗枯萎病的內(nèi)生菌株較少，且對其拮抗機制的研究鮮有報道。因此，本研究從健康楊梅、鳳尾草、魚腥草、金銀花植株中篩選拮抗楊梅枯萎病的內(nèi)生菌，并對其抑菌機制進行探索。研究結(jié)果表明，從4種植物中共分離出內(nèi)生菌22株，包括7株細菌，7株真菌，8株放線菌，其中從健康楊梅和鳳尾草植株分離的內(nèi)生真菌YMB1J、FWB1J菌株對楊梅枯萎病病原菌擬盤多毛孢菌拮抗作用最強，經(jīng)鑒定FWB1J為木霉屬(Trichoderma)，YMB1J為假絲酵母屬(Candida)。而近年來篩選出的抗枯萎病的優(yōu)勢內(nèi)生菌大多屬于芽孢桿菌屬，且主要對由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病有效。如于蘋蘋等[28]篩選出的內(nèi)生芽孢桿菌XJPL-YB-26菌株對由尖孢鐮刀菌引起的西瓜枯萎病有較好的拮抗作用；郝曉娟等[29]發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病拮抗菌JK-2菌株也屬于芽孢桿菌屬。經(jīng)測定FWB1J和YMB1J菌株胞外代謝產(chǎn)物的EC50分別為0.034 7、0.029 0 g/mL，EC90分別為0.315 5、0.254 6 g/mL。而王一光等[30]發(fā)現(xiàn)，防治藥劑80%代森錳鋅WP對楊梅枯萎病的EC50為1.66 g/mL，說明菌株YMB1J、FWB1J胞外代謝產(chǎn)物對楊梅枯萎病病原菌的抑菌效果好于化學藥物80%代森錳鋅WP。

細胞壁是真菌的重要結(jié)構(gòu)，與微生物形態(tài)的維持、代謝等生理特性密切相關(guān)。葡聚糖和幾丁質(zhì)是真菌細胞壁的最主要成分，是抗真菌藥物作用的理想靶點[31-32]。幾丁質(zhì)酶是一種廣泛存在于微生物中的糖苷酶，可催化水解細胞壁中的幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰葡萄糖胺，從而破壞細胞壁的完整性[33]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)FWB1J、YMB1J菌株作用后，楊梅枯萎病病原菌的N-乙酰葡萄糖胺含量和幾丁質(zhì)酶活性均顯著高于對照組，且隨著時間的延長先升高后降低。張曉麗[34]的研究也證明,經(jīng)紫莖澤蘭揮發(fā)物Carvacrol處理后，稻瘟病菌和番茄灰霉病菌胞內(nèi)N-乙酰葡萄糖胺含量和幾丁質(zhì)酶活性均顯著升高。這表明，F(xiàn)WB1J、YMB1J菌株可激活楊梅枯萎病病原菌幾丁質(zhì)酶活性，從而水解幾丁質(zhì)，以此破壞細胞壁的完整性。

細胞膜是細胞的天然屏障，既可以穩(wěn)定代謝的胞內(nèi)環(huán)境，又能控制物質(zhì)進出[35]。若細胞膜通透性增加，易使可溶性蛋白、可溶性糖等內(nèi)含物滲漏[36]。此外，麥角甾醇是真菌細胞膜的重要成分之一，如果麥角甾醇合成受到抑制，膜的結(jié)構(gòu)和功能會受到損害，甚至導致菌體死亡[37]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)FWB1J、YMB1J菌株處理后，楊梅枯萎病病原菌胞外可溶性蛋白、可溶性糖滲漏量明顯升高，麥角甾醇含量逐漸下降。徐崢等[37]研究證實,抗真菌類藥物可與麥角甾醇生物合成途徑中各種酶作用，干擾或阻斷麥角甾醇的生物合成。由此可知，F(xiàn)WB1J、YMB1J菌株可抑制麥角甾醇生物合成途徑中相關(guān)酶活性，導致枯萎病病原菌細胞膜結(jié)構(gòu)破壞，通透性增加，大分子外泄。

琥珀酸脫氫酶(SDH)和蘋果酸脫氫酶(MDH)是細胞進行三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶，在能量代謝中起著重要作用，其活性變化可反映細胞的能量代謝狀況[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)WB1J、YMB1J菌株對楊梅枯萎病病原菌胞內(nèi)的SDH和MDH的活性具有極顯著的抑制作用，其中經(jīng)質(zhì)量濃度為EC90的FWB1J菌株處理后病原菌的SDH和MDH活性最低，比對照分別降低了2.750、318.330 U/mg。這與徐明生[25]等研究魚精蛋白對黑曲霉細胞內(nèi)的SDH和MDH活性的影響結(jié)果相同。其作用機制可能是胞外代謝產(chǎn)物中有效成分與這2個酶側(cè)鏈的氨基酸結(jié)合，改變其構(gòu)象，使酶活性降低，從而抑制病原菌的呼吸代謝。

菌體內(nèi)的生物大分子如蛋白質(zhì)、DNA和RNA是衡量菌體生長狀況的重要指標，菌體內(nèi)RNA含量發(fā)生改變，可能影響其正常生長，造成代謝紊亂[36]。本研究結(jié)果表明，內(nèi)生菌FWB1J和YMB1J菌株的胞外代謝產(chǎn)物可通過抑制RNA的合成影響楊梅枯萎病病原菌的正常生長。核酸是遺傳信息的攜帶者，其含量變化會嚴重影響菌體的各種生理機能，而拓撲異構(gòu)酶能參與DNA的斷裂、修復(fù)、重組、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，其活性直接與菌體核酸的合成密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)生菌FWB1J和YMB1J菌株可通過抑制拓撲異構(gòu)酶的功能而阻礙病原菌DNA合成。汪業(yè)菊等[38]也研究發(fā)現(xiàn)，秦皮中的秦皮素可以抑制DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的活性。

綜上所述，分別從鳳尾草、楊梅健康植株中篩選出的木霉屬FWB1J、假絲酵母屬YMB1J菌株對楊梅枯萎病病原菌有較強的抑制作用，其抑菌機制主要是通過破壞細胞壁及細胞膜的完整性，抑制三羧酸循環(huán)中的SDH和MDH活性，抑制DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ的活性，進而影響菌體核酸合成等途徑來實現(xiàn)。因此，木霉屬FWB1J、假絲酵母屬YMB1J菌株有望用于由擬盤多毛孢菌引起的楊梅枯萎病防治，但其發(fā)酵條件的優(yōu)化以及田間施用條件還有待進一步的研究。