小飛蓬內(nèi)生耐錳細菌的篩選及其生物學特性研究

滕 崢，楊翠鳳，賈桂康，藍趙云，顧俐俐

(百色學院 農(nóng)業(yè)與食品工程學院，廣西 百色 533000)

隨著工業(yè)化和城市化的發(fā)展，土壤重金屬污染狀況越來越嚴重，據(jù)調(diào)查，我國現(xiàn)階段約有20%的土地受到了嚴重的重金屬污染，總計面積達0.11億km2[1]。土壤重金屬污染治理的舉措主要有2種：一是使土壤環(huán)境中的重金屬固定沉降下來；二是把重金屬從污染土壤中除去[2]。伴隨產(chǎn)生的修復技術有物理修復、化學修復與生物修復[3]。其中，生物修復主要有植物修復、微生物修復等。植物修復綠色環(huán)保，但效率不高；微生物修復速度快、價格低廉，但修復能力不穩(wěn)定，受環(huán)境影響大。因此，亟需探究更為有效、持續(xù)時間更長的修復新方法[4-5]。植物-微生物聯(lián)合修復過程中，耐重金屬的內(nèi)生菌可提高植物抗逆性，增強植物對重金屬的吸收與轉(zhuǎn)化[6-7]，為土壤重金屬污染治理提供新方向，因此，挖掘有益的重金屬抗性內(nèi)生菌，開展植物-微生物聯(lián)合修復具有重要的現(xiàn)實意義。已報道的重金屬超積累植物有龍葵、木荷、三葉鬼針草、蜈蚣草、商陸、小飛蓬等，這些植物體內(nèi)通常分布多種既有促生長效應又能抗重金屬的內(nèi)生細菌。何琳燕等[8]從龍葵中分離得到2株屬于芽孢桿菌屬的抗Cd內(nèi)生細菌AR1和AY1，能夠產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)和鐵載體，在1.5 mg/L的Cd2+污染條件下，能明顯促進油菜幼苗根的伸長。朱靈佳[9]從井口邊草和蜈蚣草體內(nèi)分離得到多種抗砷菌株，優(yōu)勢種群為芽孢桿菌屬，均能產(chǎn)IAA。胡澤瑞等[10]從三葉鬼針草內(nèi)分離得到34株內(nèi)生細菌，其中菌株GF-1、GF-8、YF-1、YF-2、JF-1為芽孢桿菌，菌株GF-2為假單胞菌，菌株JF-8為伯克氏菌，這7株菌株都具有高產(chǎn)IAA和耐受多種重金屬的能力，是生物修復的優(yōu)良候選菌株。盧文顯[11]從商陸根莖葉組織中分離篩選得到19株能產(chǎn)IAA的抗錳內(nèi)生細菌，它們在分類上屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、球菌屬、硫胺素芽孢桿菌屬、桿菌屬6個屬，其中，芽孢桿菌是優(yōu)勢種群，這些菌株可有效提高商陸的抗重金屬毒性和對重金屬的去除效率。隨著研究的深入，越來越多的抗重金屬菌株將被發(fā)掘。小飛蓬(Conyzacanadensis)為菊科(Asteraceae)飛蓬屬(Conyza)的一種具有較強環(huán)境適應能力的入侵雜草，研究表明，小飛蓬植株對重金屬具有較強的耐受性[12-13]。植物內(nèi)生耐重金屬細菌的挖掘和利用是拓寬重金屬污染土壤生物修復的有效途徑，目前關于小飛蓬內(nèi)生細菌的研究鮮有報道，鑒于此，從礦區(qū)生長良好的小飛蓬植物組織中分離篩選出具有重金屬抗性的內(nèi)生細菌，以期為植物-微生物聯(lián)合修復的研究豐富功能菌種資源庫，為土壤污染治理提供更多的選擇。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2018年3月于百色市百礦集團右江區(qū)錳礦區(qū)周邊生長旺盛的小飛蓬植株，野外采集新鮮植株后立即帶回實驗室，用自來水沖洗干凈備用。

1.2 材料預處理

將礦區(qū)采集的新鮮小飛蓬用自來水沖洗干凈，超純水清洗3遍，然后用滅菌剪刀剪下適量的小飛蓬葉子，放到滅菌燒杯進行表面消毒。消毒程序如下：75%乙醇消毒30 s→無菌水沖洗3次→0.1% HgCl2滅菌5 min→無菌水沖洗3次，3 min/次。消毒完畢后，取最后一次浸泡小飛蓬葉子的無菌超純水涂布到培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)皿上有無微生物生長，以此檢驗是否消毒成功。

1.3 培養(yǎng)基的配制

試驗所用的培養(yǎng)基配制及滅菌方法參照《現(xiàn)代微生物學實驗技術》[14]。試驗用到的培養(yǎng)基有LB培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水溶液、淀粉水解培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、Citrate medium、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、石蕊牛奶培養(yǎng)基、無氮培養(yǎng)基、解磷培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、蛋白胨水、鐵載體檢測培養(yǎng)基。其中，鐵載體檢測培養(yǎng)基是參照王東升等[15]的方法制備并改進的CAS檢測培養(yǎng)基。

1.4 小飛蓬內(nèi)生細菌的分離純化

將經(jīng)過預處理的小飛蓬葉子用無菌濾紙吸干后置于無菌研體中，加入10 mL PBS緩沖液，用研體研磨，過濾。按10-1、10-2、10-3梯度稀釋濾液，分別吸取100 μL不同稀釋度的濾液，涂布接種到LB培養(yǎng)基(含已過濾除菌的200 mg/L Mn2+溶液)上培養(yǎng)(37 ℃，24 h)。待長出菌落，挑取不同形態(tài)的單菌落進行純化培養(yǎng)。

1.5 耐Mn、耐Pb及耐Cr試驗

將純化后的內(nèi)生細菌依次接種到逐級加大Mn2+含量的固體LB平板上，直至篩選出內(nèi)生細菌耐受的最高Mn2+含量。

耐Pb試驗和耐Cr試驗同上。

1.6 菌株生理生化特性鑒定

參照《現(xiàn)代微生物學實驗技術》[14]進行菌株生理生化試驗測定。測定項目有接觸酶試驗、甲基紅反應、V-P試驗、淀粉水解試驗、明膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗、硝酸鹽還原試驗和石蕊牛乳試驗。

1.7 菌株促生長特性研究

菌株促生長特性試驗包括固氮、溶磷、解鉀、拮抗、產(chǎn)IAA和產(chǎn)鐵載體試驗，參照張中峰等[16]、楊杉杉等[17]、武燕等[18]方法。

1.8 菌株16S rDNA序列分析

內(nèi)生細菌DNA提取采用碧云天基因組DNA小量抽提試劑盒(離心柱式)。PCR擴增引物為16S rDNA通用引物27f/1492r。PCR反應體系：27f引物、1492r引物各2 μL，MIX 24 μL，去離子水18 μL，DNA模板 4 μL。PCR反應程序[13]：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 min，循環(huán)35次；72 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物回收純化(天根生化科技有限公司)后連接至pMD18-T載體，16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)入E.coilDH5α感受態(tài)細胞，藍白斑篩選后挑取陽性克隆送至深圳華大基因測序部測序。將測序所得16S rDNA序列與BLAST數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性分析，并用MEGA 5.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.9 菌株生長曲線測定

采用24 h連續(xù)培養(yǎng)法測定菌株的生長曲線，24 h內(nèi)每2 h測定1次600 nm處的吸光值，以LB液體培養(yǎng)基為空白對照，試驗設3次重復。

1.10 不同酸堿度及滲透壓對菌株生長的影響

液體培養(yǎng)條件下，設置不同酸堿度和滲透壓的LB培養(yǎng)基，pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，NaCl含量分別為2%、3%、4%、5%、6%，滅菌之后接入5 mL種子液，置28 ℃、180 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，測定600 nm處吸光值。

2 結果與分析

2.1 小飛蓬內(nèi)生細菌對重金屬的耐受能力

從小飛蓬葉片組織中篩選得到6株Mn抗性內(nèi)生細菌，分別命名為XFP-01—06(表1)。其中，菌株XFP-02、XFP-06的耐Mn性較差，在含800 mg/L Mn2+的LB培養(yǎng)基上幾乎不生長，菌株XFP-04、XFP-05耐Mn性最高，在含2 500 mg/L Mn2+的LB培養(yǎng)基上仍能正常生長。選取耐Mn性較好的菌株XFP-01、XFP-03、XFP-04、XFP-05進行耐Pb和耐Cr試驗，發(fā)現(xiàn)菌株XFP-01、XFP-03、XFP-05對Pb2+抗性在600 mg/L以下，3株菌株在含400 mg/L Cr6+的培養(yǎng)基上生長受到明顯抑制，而菌株XFP-04對重金屬Pb和Cr表現(xiàn)出較高的抗性，最高可耐受800 mg/L Pb2+和400 mg/L Cr6+。

2.2 菌株XFP-04促生長特性及生理生化特性

菌株XFP-04在固體培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)為：菌落呈乳白色，近圓形，邊緣不規(guī)則，表面黏稠，有光澤，不透明。顯微鏡下觀察到該菌為鏈狀排列的革蘭氏陽性桿狀菌。

表1 小飛蓬內(nèi)生抗性細菌的篩選

由表2可知，菌株XFP-04具有固氮、溶磷、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體的特性，表明該菌株具有良好的促生長能力，能夠幫助小飛蓬在逆境環(huán)境中生長。拮抗試驗中，菌株XFP-04對芒果葉斑病菌、香蕉枯萎病菌并未表現(xiàn)出拮抗作用，而對其他病原菌的拮抗還有待進一步研究。

表2 菌株XFP-04的生物學特性Tab.2 Biological characteristics of strain XFP-04

菌株XFP-04生理生化特性研究中，除了V-P試驗為陰性結果外，其他試驗的檢測結果都為陽性。植物在新陳代謝過程中會產(chǎn)生氧化性較高的H2O2，對植物具有毒害作用。菌株XFP-04的接觸酶試驗為陽性，表明菌株XFP-04可以產(chǎn)生過氧化氫酶，能將對植物具有毒害作用的H2O2分解為無害的H2O和O2，消除小飛蓬植株在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。其他生理生化測定結果還顯示，其能利用葡萄糖、乳糖等各種糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能產(chǎn)淀粉酶水解淀粉，能產(chǎn)生明膠酶水解明膠蛋白，能利用檸檬酸鹽作為唯一的碳源分解檸檬酸鈉，能將環(huán)境當中難以利用的硝酸鹽還原為植物能夠吸收的亞硝酸鹽。

2.3 酸堿度對菌株XFP-04生長的影響

菌株適應的pH值范圍越大，說明該菌對環(huán)境的適應力越強。從圖1得知，XFP-04菌株在pH值為中性條件生長最好，偏酸或者偏堿情況都會不同程度抑制菌株的生長，尤其是pH值低于5.0或高于9.0條件下，菌株生長受到明顯抑制(P<0.05)。

圖1 pH值對菌株XFP-04生長的影響

2.4 滲透壓對菌株XFP-04生長的影響

滲透壓是維持生物細胞生理的重要指標，微生物所處生長環(huán)境的滲透壓與其細胞內(nèi)部的滲透壓幾乎相同。在重金屬污染的水域、礦場周圍，往往含有眾多的金屬離子和鹽離子，所處的環(huán)境屬于高滲透壓環(huán)境，而處在高濃度滲透壓條件下，細胞可能會失水引起質(zhì)壁分離。如圖2所示，隨著滲透壓增大，菌株生長狀態(tài)呈下降趨勢，但差異不顯著(P<0.05)，表明該菌株屬于輕度嗜鹽菌，在高滲透壓下仍能正常生長。

2.5 菌株XFP-04生長曲線的測定

用連續(xù)培養(yǎng)法測定菌株的生長曲線，由圖3可知，在接入菌種之后0～2 h菌種處于延滯期，2～12 h菌種處于對數(shù)期，12～16 h菌種到達穩(wěn)定期，16 h之后菌種進入衰亡期，連續(xù)培養(yǎng)法顯示菌株的穩(wěn)定期為4 h。

圖2 滲透壓對菌株XFP-04生長的影響

2.6 XFP-04菌株16S rDNA序列分析

利用16S rDNA序列所建立的菌株XFP-04與參比菌株的進化樹見圖4。從進化樹來看，菌株XFP-04與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)同源性最高，聚為同一分支。結合菌株的生化特性可以確定該菌株在分類上屬于Bacilluscereus。Bacilluscereus是一類理想的生物防治細菌，易培養(yǎng)、繁殖速度快，可在植物體內(nèi)定殖、轉(zhuǎn)移，能產(chǎn)生某些抗性分泌物和促生性活性物質(zhì)。因此，本研究分離的菌株XFP-04不僅可以提高植物對重金屬污染的抗性，還能有效促進植物生長，是理想的生物修復菌株。

3 結論與討論

在微生物修復錳污染中，多種細菌已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有對錳離子的耐受性和去除能力，趙晗等[19]從造紙廠的污染土壤分離出2株耐Mn細菌，分別命名為MN1和MN6，研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+和Mn2+能夠促進菌株的生長，MN1對Mn2+的耐受力達到1 000 mg/L，菌株MN6則達到2 000 mg/L。而本研究分離獲得的菌株中有4株耐Mn2+能力可以達到2 000 mg/L，菌株XFP-04和XFP-05對Mn2+的耐受力更為突出，最高可耐受2 500 mg/L Mn2+，其中,菌株XFP-04對重金屬Pb和Cr還表現(xiàn)出較高的耐受性，值得繼續(xù)深入研究。

圖4 菌株XFP-04與參比菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

從連續(xù)培養(yǎng)的生長曲線得出，菌株XFP-04在無Mn條件下培養(yǎng)12 h后進入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期為12～16 h，其結果與田群[20]在無Mn條件下測定菌株S7的生長曲線相似，菌株S7的生長速度同樣很快，在14 h之后達到穩(wěn)定期，穩(wěn)定期為14～18 h。凌薇薇[21]篩選出3株耐Mn性強的菌株，分別編號為2、3、80，篩選的3株菌適應pH值范圍較寬，而菌株XFP-04最適pH值為7.0左右，低于5.0或高于9.0菌株生長才會明顯受到抑制。馬文花[22]從藥廢水中篩選出菌株HB1和HB2,在0.5%～10% NaCl的液體基本培養(yǎng)基中能夠生長良好，可見，在高污染環(huán)境的土壤和水域中容易分離到耐高滲透壓的菌株，本研究中菌株XFP-04同樣能夠適應高滲透壓環(huán)境，在高鹽含量下仍能正常生長。

據(jù)報道，抗重金屬內(nèi)生菌株除了可以增強植物體對重金屬的富集、轉(zhuǎn)運及轉(zhuǎn)化能力，還可以利用自身產(chǎn)生的IAA、鐵載體等物質(zhì)來幫助植物更快更好地生長，從而提高植物修復效率。目前國內(nèi)外關于植物-微生物聯(lián)合修復的功能性菌株及其增強植物抗性機制等方面已有較多報道，但實踐應用的菌株仍較少[23-30]，因此功能性菌株的分離篩選、定殖、作用機制方面仍值得研究與探索。本研究中菌株XFP-04不僅可以耐受多種重金屬，對環(huán)境適應能力好，同時還具備了固氮、溶磷、產(chǎn)IAA等促植物生長特性，可以提高植物的抗逆性，是生物修復的潛在優(yōu)勢菌株。

本研究從小飛蓬中分離得到對Mn、Pb和Cr均具有較高耐受性的內(nèi)生細菌XFP-04，該菌株不僅可以固氮、溶磷，還可以產(chǎn)IAA、鐵載體、淀粉酶、明膠酶等，具有良好的促生長效應。菌株的延滯期為2 h，對數(shù)生長期為10 h，經(jīng)過4 h的穩(wěn)定期之后便進入衰亡期。菌株最適生長pH值為7.0，處在高滲透壓環(huán)境下仍能正常生長。XFP-04菌株不僅對重金屬具有較高耐受性，還具有固氮、溶磷、產(chǎn)IAA等促進植物生長的特性，可作為生物修復的潛在菌株。16S rDNA序列分析結果表明，菌株XFP-04與已報道的Bacilluscereus16S rDNA序列同源性高達100%，結合菌株形態(tài)學觀察和生化特性測定結果，確定該菌株為Bacilluscereus。本研究的開展豐富了功能菌種質(zhì)資源庫，同時為植物-微生物聯(lián)合修復提供科學基礎。