不同表型艾葉中礦物元素和主要藥用成分差異分析

李 超，楊成敏，高 麗，崔占虎，張超云，黃顯章

(1.南陽(yáng)理工學(xué)院 河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473000；2.河南省伏牛山再生資源研究院，河南 南陽(yáng) 473000； 3.福建農(nóng)林大學(xué)，福建 福州 350002)

艾(ArtemisiaargyiLevl.et Vant.)為北溫帶地區(qū)特有的菊科蒿屬植物，既可食用也可藥用，在《名醫(yī)別錄》《食療本草》《本草圖經(jīng)》等歷代本草專著中均有收載[1-3]。食用方面，艾葉在中國(guó)、日本、韓國(guó)等東亞地區(qū)被廣泛用作膳食功能材料、食品調(diào)味劑、食品著色劑等；藥用方面，艾葉既可內(nèi)服，也可外用，以其所含艾絨為原料制成的灸條是中醫(yī)灸法的原材料，具有溫經(jīng)止血、散寒止痛等功效，在中醫(yī)臨床應(yīng)用上效果顯著[4-6]。

隨著中醫(yī)藥健康體系的快速發(fā)展，艾產(chǎn)業(yè)的市場(chǎng)需求與日俱增。據(jù)本實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)的第四次全國(guó)中藥資源普查(南陽(yáng)市)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，河南省南陽(yáng)市2019年艾草種植面積達(dá)1.4萬(wàn)hm2，艾草企業(yè)1 500余家，年銷售額達(dá)80余億元，產(chǎn)業(yè)規(guī)模居全國(guó)之首[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)艾草的分類學(xué)地位進(jìn)行了梳理[8]，發(fā)現(xiàn)艾草的分布地區(qū)廣泛，栽培類型較多，其原始種極有可能是由蒿屬向南遷徙后，在溫帶南部至亞熱帶地區(qū)分化、衍生出的適于溫暖濕潤(rùn)環(huán)境的類群。由于生長(zhǎng)環(huán)境的特異化，艾草種質(zhì)資源擁有豐富的變異，尤其是藥用部位葉片的表型特征存在較大差異，導(dǎo)致艾草在人工栽培過(guò)程中出現(xiàn)種質(zhì)不清、品種混雜等問(wèn)題。在實(shí)際生產(chǎn)中，種植于同一地區(qū)的艾草也存在著若干變種混雜的現(xiàn)象，甚至同時(shí)夾雜有五月艾(Artemisiaindica)、水蒿(Artemisiaatrovirens)、野艾蒿(Artemisialavandulaefolia)等混、偽品，嚴(yán)重影響了艾葉的品質(zhì)和產(chǎn)量，也限制了艾產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和種植效益的提高[9]。

南陽(yáng)市艾草以人工栽培為主，常見(jiàn)的葉片表型有4種。由于長(zhǎng)期重茬耕作、病蟲害蔓延、種質(zhì)混雜及管理不規(guī)范等原因，部分種植基地已出現(xiàn)艾葉產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低等問(wèn)題，優(yōu)良艾草栽培品種的選育工作亟待開(kāi)展。到目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)艾葉的研究多見(jiàn)于其化學(xué)成分和藥理作用方面[10-17]，不同表型艾葉的差異分析研究較少，這對(duì)艾草優(yōu)良品種的選育極為不利。因此，開(kāi)展不同表型艾葉的差異研究對(duì)后期艾草品種選育、產(chǎn)量提高及質(zhì)量提升具有重要意義。除常用的藥用成分(如異澤蘭黃素、綠原酸及異綠原酸B)外，艾葉中的礦物元素構(gòu)成及分布特征也不容忽視。礦物元素含量與植物生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)形成以及臨床療效發(fā)揮密切相關(guān)，是食品和中藥材中有效成分不可或缺的構(gòu)成因子[18-27]。鑒于此，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)和高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定并分析不同表型艾葉中礦物元素和主要藥用成分的差異，為艾葉的品質(zhì)評(píng)價(jià)和品種選育工作提供有益補(bǔ)充。

1 材料和方法

1.1 供試材料

南陽(yáng)市艾草常見(jiàn)的葉片表型有4種，具體見(jiàn)圖1，分別表示為表型1、2、3、4。其中，表型1艾葉葉片紙質(zhì)，呈卵形，上表面被灰白色短柔毛，具白色腺點(diǎn)與小凹點(diǎn)，下表面淺綠色，密被蛛絲狀柔毛，羽狀半裂，裂片卵狀橢圓形，葉邊緣有疏齒或無(wú)，氣清香，味苦；表型2艾葉葉片紙質(zhì)，上表面深綠色，具灰白色短柔毛，具白色腺點(diǎn)，下表面灰綠色，密被柔絨毛，羽狀深裂至半裂，裂片橢圓形，氣較清淡，味苦澀；表型3艾葉葉片厚紙質(zhì)，上表面深綠色，具淺灰色柔毛，下表面綠棕色至灰色，短柔毛密而厚，葉片一(至二)回深裂，裂片細(xì)長(zhǎng)，條狀披針形，裂片全緣，氣清香特異，味苦澀；表型4艾葉葉片大而厚，呈闊卵形，葉片厚紙質(zhì)，被厚蛛絲狀密絨毛層，羽狀深裂，裂片菱狀卵形，有2～3枚小裂齒，香氣濃烈，味苦微澀。前期研究發(fā)現(xiàn)，以上4種表型艾葉的遺傳背景相同(經(jīng)rbcL序列和ITS-2序列鑒定)、遺傳性狀穩(wěn)定(已連續(xù)觀察3代)、農(nóng)藝參數(shù)差異較大，有望進(jìn)一步選擇后申報(bào)為不同品種。

1—4：4種不同表型艾草的葉片性狀； A：正面性狀； a：背面性狀

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

主要試劑：65%硝酸(優(yōu)級(jí)純，德國(guó)Merk公司)，乙腈、甲醇(均為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(單標(biāo)/混標(biāo)，美國(guó)Spex公司)，異澤蘭黃素對(duì)照品(150120)、異綠原酸B(14534613)(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)，綠原酸對(duì)照品(110753，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，超純水(自制)。

主要儀器設(shè)備：Thermo X Series-Ⅱ型ICP-MS儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、Mars-5微波消解系統(tǒng)(美國(guó)CEM公司)、Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)、ZY-1006超聲波清洗機(jī)(上海早盈精密清洗機(jī)械有限公司)、MS-TS電子分析天平(德國(guó)梅特勒公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

供試4種不同表型艾草株系群于2017年5—6月在南陽(yáng)市唐艾生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司、國(guó)醫(yī)仲景艾草產(chǎn)業(yè)園、大艾生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司等艾草種植基地收集，經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院黃顯章教授鑒定，均為菊科蒿屬植物艾(Artemisiaargyilevl.et Vant.)。同年7月，分別將其地下匍匐莖種植于南陽(yáng)理工學(xué)院藥用植物園艾草種質(zhì)圃中，即挖取不同表型艾草種質(zhì)地下未出苗根狀莖，截成15～20 cm小段后種植，每種表型株系群種植60～80份，設(shè)置3個(gè)小區(qū)，各試驗(yàn)小區(qū)長(zhǎng)2.0 m、寬1.5 m，株行距為30 cm×30 cm，小區(qū)之間開(kāi)深溝做高畦，并用深入地面的木板隔開(kāi)防止艾地下根狀莖混雜，試驗(yàn)材料的立地條件及田間管理一致。2019年6月上旬，于艾草等高90 cm時(shí)分別采收艾葉樣品，不同表型艾草的艾葉樣品均采自第2或第3莖節(jié)處，重復(fù)3次，并進(jìn)行去雜、干燥、剪碎、混勻后備用。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 35種礦物元素含量 樣品消解：準(zhǔn)確稱取艾葉樣品約0.4 g(精確至0.000 1 g)于消解內(nèi)罐，加5 mL 65% HNO3浸泡過(guò)夜，160 ℃保持6 h，冷卻，趕酸，移入25 mL容量瓶中，合并洗液，1% HNO3定容，混勻備用，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。 ICP-MS工作參數(shù)：霧化器壓力為1.0 Bar，輔助氣流量為0.7 L/min，RF功率為1 200 W，等離子氣(氬氣)流量為13 L/min，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為分析30 r/min+沖洗70 r/min。

1.4.2 異澤蘭黃素、綠原酸、異綠原酸B含量 供試品制備：精密稱取過(guò)篩(孔徑為0.25 mm)后的不同表型艾葉粉末約0.5 g于具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，放涼，緩慢滴加60%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混合均勻，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

色譜條件：流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫為0～15 min 10%～20%B,15～30 min 20%B,30～40 min 20%～40%B,40～50 min 40%～50%B,50～55 min 50%～90%B,56～60 min 90%B；流速為0.8 mL/min；柱溫為20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件和SIMCA-p 12.0軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、主成分分析、因子分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同表型艾葉中礦物元素含量的差異分析

2.1.1 礦物元素含量特征 分別對(duì)4種表型艾葉的礦物元素含量進(jìn)行測(cè)定和分析，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，不同表型艾葉礦物元素含量差異較大，總體上各元素含量表現(xiàn)為K>Ca>Mg>Al>Fe>Mn>Na>Cu>Sr>Zn>Ba>Ti>Cr>Ni>V>Mo>La>Pb>Zr>As>Y>Co>Cd>Sc>Sn>Ga>Nb>Tl>Sb>Bi>Be>Ge>Ag>Hg>Se，元素含量的數(shù)量級(jí)介于10-6～102g/kg，變異系數(shù)介于10.06%～51.50%，屬于弱至中變異性。

其中，Na、Mg、K、Ca、Mn、Fe、Ni、Zn及Mo等元素是植物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的元素，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活動(dòng)、參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。表型2艾葉Ca含量最高，為15.503 g/kg，顯著高于表型3艾葉(8.661 g/kg)，但與表型1和表型4差異不顯著；表型1艾葉Mn含量最高，為138.213 mg/kg，顯著高于表型3艾葉(91.611 mg/kg)；表型4艾葉Zn、Mg含量最高，分別為43.578 mg/kg、5.035 g/kg，均顯著高于表型3艾葉；表型2艾葉Fe含量最高，為0.833 g/kg，顯著高于其他表型艾葉；Na、Ni含量以表型1艾葉最高，分別為73.642、2.899 mg/kg，均顯著高于其他表型艾葉；而K、Mo含量以表型2艾葉最高，平均含量分別為39.519 g/kg、1.151 mg/kg，但表型間差異均未達(dá)到顯著水平。

As、Cd、Hg、Cu、Pb是重金屬和有害元素，不同表型艾葉以表型2艾葉Pb含量最高，為1.073 mg/kg，顯著高于表型3艾葉(0.593 mg/kg)，但與表型1和表型4差異未達(dá)到顯著水平；Cu、Cd含量以表型4艾葉最高，分別為47.218、0.218 mg/kg，均顯著高于表型3；As和Hg含量以表型2艾葉最高，分別為0.663 mg/kg和13.544 μg/kg，顯著高于其他表型艾葉。參照國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)[28]，Pb、Cd、As、Hg含量均在安全水平，而Cu含量超出限度2倍以上，這可能與艾葉對(duì)Cu元素的富集能力較強(qiáng)有關(guān)。通過(guò)上述分析可以看出，表型2和表型4艾葉的有害元素含量均較高，應(yīng)予以關(guān)注。另外，本試驗(yàn)還測(cè)定了其他多種礦物元素，尤其是過(guò)渡元素和稀土元素，既可為不同表型艾葉的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，也可為艾葉表型間的差異化鑒別提供有益參考。

2.1.2 礦物元素含量的主成分分析 主成分分析是采用降維的方式將原始多個(gè)變量重新組合成一組新的相互無(wú)關(guān)的少數(shù)幾個(gè)綜合變量，但能夠盡可能多地反映原始變量的信息。為探索不同表型艾葉礦物元素間的因子關(guān)系，采用SPSS 19.0軟件和SIMCA-p 12.0軟件進(jìn)行特征值的提取及累計(jì)方差貢獻(xiàn)率的計(jì)算，分析結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，對(duì)不同表型艾葉礦物元素含量共提取4個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率高達(dá)94.375%，說(shuō)明所提取的4個(gè)主成分能夠較為全面地反映礦物元素的整體特征。其中，第1主成分的特征值為24.532，解釋原始數(shù)據(jù)變量信息的70.092%，K、Ca、Mg、Al、Fe、Mn、Na、Cu、Sr、Zn、Ba、Ti、V、La、Pb、Zr、As、Y、Co、Cd、Sc、Sn、Nb、Ga、Tl、Be、Bi、Ge、Ag、Hg及Se等31種元素具有較高的載荷值(均大于0.6，且在不同因子間最高)，說(shuō)明以上元素對(duì)第1主成分的貢獻(xiàn)率較大；第2主成分的特征值為3.869，方差貢獻(xiàn)率為11.055%，Mo和Sb元素具有較高的載荷；第3主成分貢獻(xiàn)率為9.485%，特征值為3.320，Cr和Ni元素的載荷值較高；而元素在第4主成分中的載荷普遍較低，可視為前3個(gè)主成分變量信息的補(bǔ)充，方差貢獻(xiàn)率為3.743%。

2.1.3 礦物元素含量的因子分析與評(píng)價(jià) 以各主成分因子載荷(F1—F4)與方差貢獻(xiàn)率乘積之和相加，得出不同表型艾葉總因子評(píng)價(jià)函數(shù)F=0.700 9F1+0.110 6F2+0.094 9F3+0.037 4F4，因子綜合得分及排名詳見(jiàn)表3。從表3可以看出，表型2和表型1艾葉樣品得分相對(duì)較高，排名較為靠前，分別在第1、3、5位和2、4、6位，2種表型艾葉排名存在交叉；表型4和表型3艾葉樣品得分相對(duì)較低，排名較為靠后，分別在第7、8、9位和10、11、12位。以上結(jié)果表明，基于礦物元素積累與分布的角度考慮，表型1和表型2艾葉的品質(zhì)優(yōu)于表型3和表型4艾葉。

表3 主成分因子載荷及評(píng)價(jià)Tab.3 Loading and evaluation of principal component factors

續(xù)表3 主成分因子載荷及評(píng)價(jià)Tab.3(Continued) Loading and evaluation of principal component factors

2.2 不同表型艾葉中主要藥用成分含量的差異分析

采用HPLC法測(cè)定4種不同表型艾葉的異澤蘭黃素、綠原酸及異綠原酸B含量，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，3種藥用成分含量在不同表型艾葉間差異顯著，其中，表型1艾葉異澤蘭黃素含量最高，為3.01 mg/g，與表型4艾葉差異不顯著，但顯著高于表型2、表型3艾葉；表型1、表型3艾葉綠原酸含量相對(duì)較高，分別為3.56、4.59 mg/g，顯著高于表型2和表型4艾葉；異綠原酸B含量以表型1、表型3艾葉相對(duì)較高，分別達(dá)到4.91、5.10 mg/g，兩者差異不顯著水平，但均顯著高于表型2艾葉。基于以上3種藥用成分綜合考慮，表型1艾葉優(yōu)于其他表型艾葉。

表4 不同表型艾葉中異澤蘭黃素、綠原酸及異綠原酸B的含量Tab.4 Contents of eupatilin,chlorogenic acid and isochlorogenic acid B in different phenotypes of A.argyi

3 結(jié)論與討論

本研究采用ICP-MS法和HPLC法分別測(cè)定南陽(yáng)不同表型艾葉中Be、Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、Cd、Sn、Sb、Ba、La、Hg、Tl、Pb、Bi 等35種礦物元素含量及異澤蘭黃素、綠原酸、異綠原酸B的含量，并進(jìn)行多元分析和綜合評(píng)價(jià)，為南陽(yáng)艾葉的品質(zhì)評(píng)價(jià)和品種選育提供有益參考，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究結(jié)果表明，所建立的35種礦物元素測(cè)定方法和3種主要藥用成分測(cè)定方法線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均較高。不同表型艾葉中礦物元素含量差異較大，元素變異系數(shù)在10.06%～51.50%，屬于弱至中變異性。在植物生長(zhǎng)的必需元素中，表型2艾葉Ca含量最高，顯著高于表型3；表型1艾葉Mn含量最高，顯著高于表型3；表型4艾葉Zn和Mg含量最高，均顯著高于表型3；表型2艾葉Fe含量最高，顯著高于其他表型；表型1艾葉Na和Ni含量最高，均顯著高于其他表型；而表型2艾葉K和Mo含量最高，但在表型間差異均不顯著。在重金屬和有害元素中，表型2艾葉Pb含量最高，顯著高于表型3；表型4艾葉Cu和Cd含量均最高，均顯著高于表型3艾葉；As和Hg含量均以表型2艾葉最高，顯著高于其他表型艾葉。在國(guó)家藥典委發(fā)布的《藥材和飲片檢定通則公示稿(2019)》中明確規(guī)定了以上5種元素的限度要求，即As含量≤2 mg/kg，Cd含量≤1 mg/kg，Hg含量≤0.2 mg/kg，Cu含量≤20 mg/kg，Pb含量≤5 mg/kg，參照國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)，Pb、Cd、As、Hg 4種元素含量均在安全水平，而Cu元素含量超出限度。不同表型艾葉礦物元素評(píng)價(jià)函數(shù)為F=0.700 9F1+0.110 6F2+0.094 9F3+0.037 4F4，計(jì)算結(jié)果表明，表型1和表型2艾葉得分相對(duì)較高，表明基于礦物元素角度考慮，表型1和表型2艾葉品質(zhì)較好。

在主要藥用成分分析中，異澤蘭黃素、綠原酸、異綠原酸B 3種藥用成分含量在不同表型艾葉間差異顯著。表型1艾葉中異澤蘭黃素含量最高，表型1和表型3艾葉中綠原酸和異綠原酸B含量相對(duì)較高，且與其他表型艾葉的差異顯著?；诘V物元素和藥用成分綜合考慮，在今后艾草栽培選擇上，可優(yōu)先考慮表型1艾草。

本研究為探索不同表型艾葉中礦物元素及藥用成分的分布特征提供了數(shù)據(jù)支撐，也為艾葉的品質(zhì)評(píng)價(jià)和品種選育提供了有益參考。下一步考慮將礦質(zhì)元素與更多有機(jī)成分結(jié)合進(jìn)行更為深入的研究。