河南煙區(qū)烤煙主要次生代謝產(chǎn)物含量的比較分析

張 希，王慧芳，徐世曉，薛 剛，楊鐵釗

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002)

次生代謝物是植物與環(huán)境長期作用的結(jié)果[1]，多為小分子有機(jī)物，一般包括有機(jī)酸、生物堿、酚類和甾醇類等化合物[2]。煙草次生代謝物質(zhì)具有防御能力，同時(shí)還與煙草致香物質(zhì)密切相關(guān)，是大多數(shù)致香物質(zhì)的前體物。煙葉中有機(jī)酸含量為12%～16%，非揮發(fā)性有機(jī)酸對煙葉香吃味有重要影響，并且有機(jī)酸分解產(chǎn)生的酸性片段可調(diào)節(jié)煙氣中質(zhì)子化和游離態(tài)煙堿的比例[3]，從而直接影響煙葉的勁頭和吃味[4]。李炎強(qiáng)等[5]研究得出，云南烤煙游離態(tài)和結(jié)合態(tài)脂肪酸總和是河南烤煙的1.42倍，不同地區(qū)的酸性脂肪酸成分含量不同。楊虹琦等[6]研究表明，低緯度煙區(qū)烤煙蘋果酸、檸檬酸和總有機(jī)酸含量均低于中緯度和高緯度產(chǎn)區(qū)，煙葉有機(jī)酸含量因緯度高低不同而變化。生物堿在煙株體內(nèi)的存在方式是與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽，主要包括煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿4種[7]。生物堿的組成和含量是煙葉的重要質(zhì)量要素，直接影響煙草制品的生理強(qiáng)度、煙氣特征和安全性[8]。王鵬澤等[9]通過對比八大濃香型烤煙產(chǎn)區(qū)煙葉生物堿含量發(fā)現(xiàn)，河南豫中南產(chǎn)區(qū)和江西產(chǎn)區(qū)烤煙生物堿含量差異顯著，其余產(chǎn)區(qū)差異不大。廉蕓蕓等[10]和梁盟等[11]研究表明，不同產(chǎn)區(qū)烤煙主要生物堿含量差異顯著?？緹熤蟹宇愇镔|(zhì)含量為3.58%～4.25%，主要有綠原酸、蕓香苷和莨菪亭[12]。煙草中的酚類化合物與煙草香味有關(guān)，并且與煙草及其制品的等級呈正相關(guān)[13]。武麗等[14]研究表明，云南、貴州等高海拔煙區(qū)煙葉多酚含量高于遼寧、安徽等低海拔煙區(qū)。鐘維勇等[15]和冉霞等[16]通過對比西南煙區(qū)和貴州不同產(chǎn)區(qū)烤煙的主要多酚含量，獲得多酚物質(zhì)總量、分布及水平的顯著差異信息。甾醇是煙葉中的一類甾族化合物，大約占煙葉質(zhì)量的0.1%～0.3%，主要包括膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇等，濃香型烤煙豆甾醇含量高于β-谷甾醇含量[17]，不同烤煙品種游離態(tài)甾醇總量及各游離態(tài)甾醇含量存在差異[18]。

河南烤煙在卷煙原料配方中多作為主料煙和調(diào)味料使用，近幾年，河南濃香型煙葉質(zhì)量有下降的趨勢，而煙葉次生代謝物質(zhì)與煙葉品質(zhì)息息相關(guān)，關(guān)于河南煙區(qū)煙草次生代謝物質(zhì)的研究僅有關(guān)于生物堿[9]和有機(jī)酸[19]的報(bào)道，河南不同煙區(qū)煙葉有機(jī)酸、生物堿、多酚和甾醇含量的差異卻鮮見系統(tǒng)報(bào)道。因此，選取2019年河南主要煙區(qū)主栽烤煙品種烤后煙葉，采用氣相色譜-質(zhì)譜監(jiān)測法(GC/MS-SIM)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GS-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS)分別檢測12種有機(jī)酸、9種生物堿、4種游離態(tài)甾醇和3種多酚類物質(zhì)，分析各個(gè)成分含量在不同產(chǎn)區(qū)的差異，為河南優(yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)和煙葉合理利用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)于2019年在河南省南陽方城、平頂山郟縣、三門峽盧氏、駐馬店泌陽、洛陽洛寧、許昌襄縣和漯河臨潁7個(gè)烤煙產(chǎn)區(qū)進(jìn)行，各產(chǎn)區(qū)試驗(yàn)點(diǎn)均采用小區(qū)試驗(yàn)，小區(qū)面積200 m2，行株距1.2 m×0.5 m。包括云煙87、秦?zé)?6、貴煙2號、豫煙6號、中煙100等品種，分B2F和C3F兩個(gè)等級。將煙葉于60 ℃下烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過孔徑為0.02 mm篩后保存。

主要儀器：BSA224S電子天平(感量0.000 1 g,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、Thermo Scientific Barnstead Pacific TⅡ級純水儀(美國Thermo Scientific公司)、SB25-12 DTD超聲波清洗器(寧波新芝生物科技有限公司)、Agilent 1100型液相色譜儀(美國Agilent公司)、Agilent 6890型氣相色譜儀(美國Agilent公司)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)。

1.2 測定項(xiàng)目和方法

采用GC/MS-SIM[20]定量分析煙葉有機(jī)酸類物質(zhì)含量；采用GC-MS測定煙葉生物堿含量，具體操作及參數(shù)設(shè)計(jì)參照LI等[21]的方法進(jìn)行；參照YC/T 202—2006測定煙草多酚類物質(zhì)含量[22]；采用UPLC-MS法測定煙草游離態(tài)甾醇含量[23]。

各等級樣品重復(fù)測定3次，B2F和C3F兩個(gè)等級煙葉測定結(jié)果的平均值即為樣品測定結(jié)果。各個(gè)地區(qū)測定結(jié)果為相應(yīng)樣品測定結(jié)果的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0和Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙次生代謝物質(zhì)含量分析

如表1所示，河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙有機(jī)酸含量為120.01～216.01 mg/g；生物堿含量為18.85～27.97 mg/g；多酚含量為16.85～27.92 mg/g；甾醇含量為2.11～2.87 mg/g。其中，有機(jī)酸含量的變異系數(shù)最大，其次為多酚和生物堿含量，甾醇含量的變異系數(shù)最小。不同類型次生代謝產(chǎn)物占次生代謝物質(zhì)總量的比例不同，有機(jī)酸為煙葉次生代謝產(chǎn)物的主要成分，其含量占總量的76.20%；生物堿和多酚含量分別占總量的11.61%和10.91%；甾醇含量最低，僅占1.28%。從偏度系數(shù)來看，烤煙有機(jī)酸、生物堿和多酚含量的偏度系數(shù)均大于0，數(shù)據(jù)呈正偏態(tài)；甾醇的偏度系數(shù)小于0，數(shù)據(jù)呈負(fù)偏態(tài)。從峰度系數(shù)來看，有機(jī)酸和甾醇含量的峰度系數(shù)大于0，為尖峭峰，數(shù)據(jù)分布較為集中；生物堿和多酚的偏度系數(shù)小于0，為平闊峰。

表1 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙次生代謝產(chǎn)物含量的描述統(tǒng)計(jì)Tab.1 Descriptive statistics of the content of secondary metabolites of flue-cured tobacco in different production areas in Henan

如圖1所示，河南不同產(chǎn)區(qū)煙葉次生代謝產(chǎn)物總量平均值表現(xiàn)為方城>洛寧>泌陽>盧氏>郟縣>襄縣>臨潁；烤煙有機(jī)酸總量在不同產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)為方城>洛寧>泌陽>盧氏>郟縣>襄縣>臨潁；烤煙生物堿總量在不同產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)為方城>郟縣>泌陽>盧氏>襄縣>臨潁>洛寧；烤煙多酚物質(zhì)總量在不同產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)為襄縣>郟縣>方城>盧氏>洛寧>臨潁>泌陽；烤煙甾醇總量在不同產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)為洛寧>盧氏>泌陽>方城>襄縣>臨潁>郟縣。

圖1 河南不同產(chǎn)區(qū)煙葉中的次生代謝物質(zhì)含量Fig.1 Contents of secondary metabolites in tobacco leaves from different producing areas in Henan

2.2 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙有機(jī)酸含量

如表2所示，河南產(chǎn)區(qū)烤煙有機(jī)酸各組分含量表現(xiàn)為蘋果酸>檸檬酸>草酸>2,4-庚二烯酸>丙二酸>γ-戊酮酸>十六酸>富馬酸>亞油酸>丁二酸>油酸>十八酸。其中，蘋果酸、檸檬酸和草酸含量相對較高，是有機(jī)酸的主要成分，占有機(jī)酸總量的84.27%；丁二酸、油酸和十八酸含量較低。草酸、蘋果酸和亞油酸含量的變異系數(shù)較大，其他有機(jī)酸含量差異不大。從峰度系數(shù)來看，丙二酸、γ-戊酮酸、蘋果酸、2,4-庚二烯酸、檸檬酸、十六酸、亞油酸、油酸含量的峰度系數(shù)小于0，為平闊峰，數(shù)據(jù)比較分散；其他有機(jī)酸含量的峰度系數(shù)大于0，為尖峭峰，數(shù)據(jù)大多數(shù)集中在平均值附近。從偏度系數(shù)來看，丙二酸、γ-戊酮酸、富馬酸、丁二酸和十八酸含量的偏度系數(shù)小于0，數(shù)據(jù)呈負(fù)偏態(tài)；其他有機(jī)酸含量均大于0，呈正偏態(tài)。

表2 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙有機(jī)酸含量的描述統(tǒng)計(jì)Tab.2 Descriptive statistics of organic acids content of flue-cured tobacco in different production areas in Henan

由表3可知，河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙中有機(jī)酸含量差異明顯，方城烤煙有機(jī)酸含量最高，分別是臨潁、襄縣、郟縣、盧氏、泌陽、洛寧的1.80、1.73、1.69、1.56、1.39、1.19倍；洛寧和泌陽煙葉主要有機(jī)酸含量居中，平均為180.83、155.06 mg/g；盧氏、郟縣、襄縣和臨潁烤煙有機(jī)酸含量較低，平均為138.47、127.27、124.76、120.01 mg/g。河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙蘋果酸含量相對較高,表現(xiàn)為方城>洛寧>泌陽>盧氏>郟縣>臨潁>襄縣，檸檬酸含量表現(xiàn)為方城>泌陽>盧氏>襄縣>臨潁>洛寧>郟縣，草酸含量表現(xiàn)為方城>洛寧>泌陽>襄縣>臨潁>郟縣>盧氏。

表3 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙有機(jī)酸含量

2.3 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙生物堿含量

由表4可知，河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙生物堿各組分含量之間存在較大變異，異煙堿含量的變異系數(shù)最大，N-甲基煙堿含量的變異系數(shù)最小。煙草生物堿的主要成分是煙堿、降煙堿、假木賊堿和新煙草堿，占生物堿總量的99.22%。生物堿各組分平均含量表現(xiàn)為煙堿>新煙草堿>降煙堿>假木賊堿>麥斯明>異煙堿>可替寧>二烯煙堿>N-甲基煙堿。從偏度系數(shù)來看，假木賊堿和可替寧含量的偏度系數(shù)小于0，數(shù)據(jù)分布呈負(fù)偏態(tài)，其他生物堿組分含量和生物堿總量的偏度系數(shù)均大于0，數(shù)據(jù)分布呈正偏態(tài)；從峰度系數(shù)來看，煙堿、降煙堿、麥斯明、N-甲基煙堿、可替寧和生物堿總量的峰度系數(shù)均小于0，為平闊峰，數(shù)據(jù)比較分散；其余生物堿組分含量的峰度系數(shù)均大于0，為尖峭峰，數(shù)據(jù)分布比較集中。

由表5可知，河南不同產(chǎn)區(qū)煙葉生物堿含量差異明顯，就不同產(chǎn)區(qū)煙葉生物堿含量的平均值來看，以方城和郟縣的生物堿總量最高，分別為27.97 mg/g和27.84 mg/g；臨潁和洛寧的生物堿總量較低，分別為20.60 mg/g和18.85 mg/g；其他產(chǎn)區(qū)生物堿含量居中，為21.05～23.07 mg/g。不同地區(qū)煙葉樣品煙堿含量同生物堿總量趨勢一致，方城和郟縣煙堿含量最高，分別為27.07 mg/g和26.71 mg/g，臨潁和洛寧的煙堿含量較低，分別為19.92 mg/g和18.07 mg/g，其他產(chǎn)區(qū)煙堿含量居中。

表4 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙生物堿含量的描述統(tǒng)計(jì)Tab.4 Descriptive statistics of flue-cured tobacco alkaloid content in different production areas in Henan

2.4 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙多酚類物質(zhì)含量

由表6可知，河南主產(chǎn)煙區(qū)烤煙多酚物質(zhì)總量為16.85～27.92 mg/g，平均含量為21.74 mg/g。其中，綠原酸平均含量為12.33 mg/g，占多酚類物質(zhì)總量的56.72%；其次是蕓香苷含量，為9.28 mg/g，占多酚類物質(zhì)總量的42.69%；莨菪亭含量最低，僅為0.13 mg/g，僅占0.59%?？緹煻喾宇愇镔|(zhì)各組分含量之間存在較大變異，其中，莨菪亭含量的變異系數(shù)最大，綠原酸含量的變異系數(shù)最小?？緹煻喾宇愇镔|(zhì)各組分含量和總量的偏度系數(shù)均大于0，數(shù)據(jù)分布呈正偏態(tài)。蕓香苷含量的峰度系數(shù)大于0，為尖峭峰，數(shù)據(jù)分布比較集中；多酚其他組分含量和總量的峰度系數(shù)小于0，為平闊峰，數(shù)據(jù)比較分散。

表6 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙多酚類物質(zhì)含量的描述統(tǒng)計(jì)Tab.6 Descriptive statistics of polyphenols content in flue-cured tobacco in different production areas in Henan

由表7可知，河南不同煙區(qū)烤煙綠原酸含量表現(xiàn)為郟縣>襄縣>方城>盧氏>泌陽>洛寧>臨潁，蕓香苷含量表現(xiàn)為襄縣>盧氏>方城>臨潁>郟縣>洛寧>泌陽，莨菪亭含量表現(xiàn)為泌陽>方城>臨潁>洛寧>盧氏，襄縣和郟縣烤煙莨菪亭含量較低且無差異。

表7 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙多酚類物質(zhì)含量Tab.7 The content of polyphenols in flue-cured tobacco in different producing areas in Henan mg/g

2.5 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙甾醇含量

由表8可知，河南主產(chǎn)煙區(qū)烤煙甾醇總含量為2.11～2.87 mg/g，平均含量為2.54 mg/g。從具體成分來看，豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和膽甾醇含量分別占甾醇總含量的33.86%、33.07%、18.50%和14.57%?？緹熺薮几鹘M分含量之間存在較大的變異，其中β-谷甾醇含量的變異系數(shù)最大，豆甾醇含量的變異系數(shù)最小。從偏度系數(shù)來看，豆甾醇和β-谷甾醇含量的偏度系數(shù)大于0，數(shù)據(jù)分布呈正偏態(tài)；其他甾醇組分含量和甾醇總量的偏度系數(shù)小于0，數(shù)據(jù)分布呈負(fù)偏態(tài)。從峰度系數(shù)來看，豆甾醇和膽甾醇含量的峰度系數(shù)小于0，為平闊峰，數(shù)據(jù)比較分散；其他組分含量和甾醇總量的峰度系數(shù)大于0，為尖峭峰，數(shù)據(jù)比較集中。

表8 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙甾醇含量的描述統(tǒng)計(jì)Tab.8 Descriptive statistics of sterol content in flue-cured tobacco in different producing areas in Henan

烤煙甾醇含量如表9所示。由表9可知，河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙甾醇含量以洛寧最高，為2.871 0 mg/g，其次是盧氏、泌陽、方城和襄縣，其煙葉甾醇含量分別為2.666 9、2.644 1、2.608 1、2.598 9 mg/g，臨潁和郟縣煙葉甾醇含量較低，分別為2.284 9 mg/g和2.105 1 mg/g。

表9 河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙甾醇含量Tab.9 The content of sterol in flue-cured tobacco in different producing areas in Henan mg/g

3 結(jié)論與討論

通過對河南省南陽方城、平頂山郟縣、三門峽盧氏、駐馬店泌陽、洛陽洛寧、許昌襄縣和漯河臨潁7個(gè)不同煙葉產(chǎn)區(qū)的多點(diǎn)取樣分析，結(jié)果表明，各個(gè)煙葉產(chǎn)區(qū)烤煙有機(jī)酸、生物堿、多酚和甾醇含量存在較大差異，其中，方城產(chǎn)區(qū)的煙葉次生代謝物質(zhì)總量最高，臨潁產(chǎn)區(qū)最低。劉春奎等[19]研究表明，河南烤煙非揮發(fā)有機(jī)酸含量平均值為134.10 mg/g，低于本研究中有機(jī)酸含量(151.77 mg/g)，這可能是由于研究年份較為久遠(yuǎn)，與現(xiàn)行栽培措施存在差異所致。河南烤煙有機(jī)酸和甾醇含量高于耿召良等[24]對貴州烤煙的測定結(jié)果(分別為112.47 mg/g和2.54 mg/g)，但多酚和生物堿含量低于貴州烤煙(分別為33.65 mg/g和29.79 mg/g)。沈劍波[25]對比濃香型與清香型烤煙發(fā)現(xiàn)，河南與貴州由于南北方煙區(qū)生態(tài)條件不同造成次生代謝產(chǎn)物含量方面的差異。

河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙中有機(jī)酸、生物堿、多酚和甾醇4類次生代謝產(chǎn)物主要成分含量組成各不相同。方城縣烤煙有機(jī)酸含量和生物堿含量明顯高于其他縣，其他成分均居中且都高于平均值；襄縣烤煙多酚含量最高，甾醇含量高于平均值；洛寧縣烤煙甾醇含量最高，有機(jī)酸和生物堿含量均低于平均值；盧氏縣烤煙多酚和甾醇含量高于平均值，有機(jī)酸和生物堿含量均低于平均值；泌陽縣烤煙有機(jī)酸和甾醇含量高于平均值，生物堿和多酚含量低于平均值；郟縣烤煙生物堿和多酚含量高于平均值，有機(jī)酸和甾醇含量低于平均值；臨潁烤煙有機(jī)酸、生物堿、多酚和甾醇含量均低于平均值。

河南不同煙區(qū)的地形地貌、土壤條件和生態(tài)氣候均不相同，這些原因?qū)е赂鳟a(chǎn)區(qū)煙葉特性的差異[26-28]。郟縣、襄縣和臨潁均處于豫中平原烤煙區(qū)，烤煙生長季節(jié)的溫度和降雨與烤煙生長需要配合不適宜，影響烤煙旺長。從研究結(jié)果看，郟縣、襄縣和臨潁烤煙的次生代謝產(chǎn)物含量較低，導(dǎo)致近年來煙葉品質(zhì)下降，煙葉特征香氣減弱。洛寧和盧氏地處豫西丘陵山地烤煙區(qū)，烤煙多生長在海拔300～1 000 m的低山丘陵區(qū)，土壤熟化度低，通透性差，肥力低。從研究結(jié)果看，洛寧、盧氏地區(qū)的甾醇含量最高，導(dǎo)致這2個(gè)產(chǎn)區(qū)煙葉雜氣、勁頭和刺激性較大，這可能在一定程度上影響了煙葉品質(zhì)。方城和泌陽地處豫南鄂北盆地崗地烤煙區(qū)，陽光充足、雨量適中，土壤保水保肥、耕性良好。從研究結(jié)果看，方城和泌陽烤煙的次生代謝產(chǎn)物含量較高，說明充足的光照和降雨有利于煙葉內(nèi)含物的積累，一定程度上保證了煙葉質(zhì)量。

本研究結(jié)果表明，河南不同產(chǎn)區(qū)所產(chǎn)的煙葉次生代謝物質(zhì)總量不同，這很大程度上是土壤、氣候等生態(tài)條件的原因，也與煙草水肥條件、栽培措施、烘烤條件有很大關(guān)系[29]。河南不同煙區(qū)烤煙次生代謝產(chǎn)物含量的特點(diǎn)可為煙草高香氣育種研究和優(yōu)質(zhì)煙栽培提供理論依據(jù)，另外，卷煙工業(yè)可以根據(jù)不同煙區(qū)原料資源特征，擇優(yōu)選用，科學(xué)配方。