翎電鰻卵巢發(fā)育組織學(xué)研究

哈承旭，楊翠華，王 瑋，王云忠，劉 萍

( 1.青島海洋科技館，山東 青島 266003； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所， 山東 青島 266071 )

翎電鰻(Apteronotusalbifrons)，俗稱黑魔鬼魚、黑羽毛，屬裸背鰻目、翎電鰻科[1]，原產(chǎn)于南美洲的巴西及亞馬遜河流域。翎電鰻性格溫和，游姿輕盈美妙，是深受廣大水族愛好者喜愛的熱帶觀賞魚。翎電鰻對人工繁殖的飼養(yǎng)條件要求極為苛刻，目前我國翎電鰻的繁殖技術(shù)還不夠成熟，大多需要依賴進(jìn)口以滿足市場需求。

現(xiàn)存的25 000多種魚類中，作為觀賞魚的種類有3200多種。目前對觀賞魚類的種質(zhì)資源分布、養(yǎng)殖技術(shù)、遺傳結(jié)構(gòu)分析、人工繁育、病害防治等研究均已全面展開。然而作為水族館展示的重要品種，國內(nèi)外尚未見有關(guān)翎電鰻生物學(xué)研究的報道。筆者對人工養(yǎng)殖條件下翎電鰻卵巢的發(fā)育進(jìn)行形態(tài)學(xué)和組織學(xué)觀察，旨在了解該魚的卵巢發(fā)育規(guī)律及特點，為今后翎電鰻人工繁育奠定基礎(chǔ)，同時完善該魚的生物學(xué)資料，填補(bǔ)國內(nèi)外水產(chǎn)種質(zhì)資源空白。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

2019年1月購買3月齡翎電鰻，總計202尾。

飼養(yǎng)于2.0 m×0.6 m×0.6 m水族箱內(nèi)。飼養(yǎng)水溫(28±0.5) ℃，pH 7.5±0.5，光照時長16 h∶8 h(光照∶黑暗)。每日投喂線蟲及紅蟲各1次，每日按時清餌排污，日換水率5%。

1.2 樣本的數(shù)量特征測量與性腺形態(tài)觀察

取3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月齡雌性個體各10尾，測量體質(zhì)量(m)、全長(LO)、體長(LB)、體高(hB)、性腺質(zhì)量(mG)，進(jìn)行性腺的形態(tài)學(xué)觀察并拍照。取性腺于波恩氏液中固定，固定時間24 h，后轉(zhuǎn)移至70%乙醇中保存。性腺指數(shù)(wGSI)按下式計算：

wGSI/%=mG/m×100%

1.3 組織切片的制作和觀察

采用常規(guī)石蠟組織切片方法，蘇木精—伊紅染色。在顯微鏡(Olympus BX53)下觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測量數(shù)據(jù)及性腺指數(shù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0軟件對以上數(shù)值進(jìn)行單因素方差分析，檢測變化差異的顯著性。取差異顯著性水平為0.05，P≤0.05視為差異顯著，反之差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵巢的基本形態(tài)

翎電鰻的卵巢分為左、右兩葉，位于體腔的腹中線，緊貼于腎臟腹面兩側(cè)，卵巢發(fā)育成熟后呈囊狀。卵巢前端具有一段較短的生殖道，經(jīng)泄殖孔通向體外，泄殖孔位于體前端、下頜后方(圖1)。

圖1 翎電鰻卵巢發(fā)育各期外觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Appearance and structure of ovary in different developmental stages of apteronotid eel A. albifronsa.Ⅰ期卵巢； b.Ⅱ期卵巢； c.Ⅲ期卵巢； d.Ⅳ期卵巢； e.Ⅴ期卵巢； f.Ⅵ期卵巢.a.ovary in stage Ⅰ; b.ovary in stage Ⅱ; c.ovary in stage Ⅲ; d.ovary in stage Ⅳ; e.ovary in stage Ⅴ; f.ovary in stage Ⅵ.

2.2 卵母細(xì)胞發(fā)育分期的組織學(xué)特征

Ⅰ時相：卵原細(xì)胞進(jìn)行多次有絲分裂，之后向初級卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)變。此階段細(xì)胞體積小，細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞核大，呈橢圓形，核內(nèi)細(xì)絲狀的染色質(zhì)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，特點為細(xì)胞核較大，細(xì)胞界限不明顯(圖2a)。

Ⅱ時相：初級卵母細(xì)胞小生長期階段，呈圓形、橢圓形或多角形，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)增加，細(xì)胞增大，多個細(xì)胞核分散排列，略近中央，核膜明顯，核質(zhì)著色淺，早期核中可見極細(xì)棒狀染色體。核仁多個，分布于核膜內(nèi)緣。濾泡細(xì)胞在卵母細(xì)胞外先是形成稀疏的濾泡膜，之后隨著濾泡細(xì)胞的增多，濾泡膜逐漸完整(圖2b)。

Ⅲ時相：初級卵母細(xì)胞體積增長顯著，由小生長期進(jìn)入大生長期。其形態(tài)細(xì)胞基本呈圓球形，細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)弱嗜堿性。在質(zhì)膜的外側(cè)，濾泡膜由單層增為雙層，在濾泡膜和卵細(xì)胞膜之間形成放射膜。核膜呈波狀形，十幾個到數(shù)十個不等的細(xì)小核仁附在核膜上，一般未見粗大核仁存在。出現(xiàn)卵黃顆粒及卵黃斑。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靠近細(xì)胞膜處出現(xiàn)液泡，液泡隨著卵細(xì)胞的生長不斷發(fā)育，數(shù)目增加(圖2c～e)。

Ⅳ時相：初級卵母細(xì)胞進(jìn)入發(fā)育鼎盛期即卵黃充滿期。細(xì)胞及細(xì)胞核直徑均有所增大。細(xì)胞核被卵黃擠到周圍以及細(xì)胞膜邊緣；核膜形狀不規(guī)則。卵黃球逐漸增多，直至幾乎充滿核外空間。只有在核周圍及靠近卵膜邊緣有較多的細(xì)胞質(zhì)，呈弱嗜堿性。濾泡膜和放射膜變得更加明顯，放射帶上的條紋清晰可見。胞外膜可見濾泡細(xì)胞構(gòu)成的顆粒細(xì)胞層(圖2f～g)。

Ⅴ時相：初級卵母細(xì)胞減數(shù)分裂為次級卵母細(xì)胞，核膜溶解，細(xì)胞核變形，細(xì)胞質(zhì)中的卵黃顆粒逐漸融合成塊狀，呈均質(zhì)紅染。成熟卵母細(xì)胞脫離濾泡膜，進(jìn)入卵巢腔，成為游離卵(圖2h～i)。

2.3 卵巢的發(fā)育分期

參考文獻(xiàn)[2-4]的卵巢分期標(biāo)準(zhǔn)，將翎電鰻的卵巢分為6個時期，各期主要特征如下：

Ⅰ期卵巢：呈淡肉色、透明線狀，血管較少，外觀無法分辨雌雄。性腺中主要以卵原細(xì)胞為主(圖1a)。

圖2 翎電鰻的卵巢及卵母細(xì)胞發(fā)育Fig.2 Development of ovarian and oocytes of apteronotid eel A. albifronsa.4月齡雌魚卵巢橫切，示Ⅱ期卵巢； b.第Ⅱ時相卵母細(xì)胞； c.6月齡雌魚卵巢橫切； d.8月齡雌魚卵巢橫切，示Ⅲ期卵巢； e.第Ⅲ時相卵母細(xì)胞； f.10月齡雌魚卵巢橫切，示Ⅳ期卵巢早期； g.第Ⅳ時相卵母細(xì)胞； h.產(chǎn)卵后雌魚卵巢橫切，示萎縮的卵巢； i.產(chǎn)卵后留下的空濾泡； Ⅰ.第Ⅰ時相卵母細(xì)胞； Ⅱ.第Ⅱ時相卵母細(xì)胞； Ⅲ.第Ⅲ時相卵母細(xì)胞； Ⅳ.第Ⅳ時相卵母細(xì)胞； Og.卵原細(xì)胞； SP.產(chǎn)卵板； N.細(xì)胞核； Nu.核仁； CY.細(xì)胞質(zhì)； NM.核膜； FC.濾泡細(xì)胞； Va.液泡； YG.卵黃顆粒； G.顆粒細(xì)胞； PM.細(xì)胞質(zhì)膜； ZR.放射膜； EF.空濾泡a.transverse section of ovary of 4-month-old fish, ovary in stage Ⅱ; b.oocyte in phase Ⅱ; c.transverse section of ovary of 6-month-old fish; d. transverse section of ovary of 8-month-old fish, ovary in stage Ⅲ; e.oocyte in phase Ⅲ; f.transverse section of ovary of 10-month-old fish, ovary in early stage Ⅳ; g.oocyte in phase Ⅳ; h.transection of ovary after spawning, atrophied ovary; i.empty follicles remains after spawning； Ⅰ.oocyte in phase Ⅰ； Ⅱ.oocyte in phase Ⅱ； Ⅲ.oocyte in phase Ⅲ； Ⅳ.oocyte in phase Ⅳ； Og.oogonium； SP.spawning plate； N.nucleus； Nu.nucleus； CY.cytoplasm； NM.nuclear membrane； FC.follicle cell； Va.vacuoles； YG.yolk globules； G.granule cell； PM.plasma membrane； ZR.zone radiate； EF.empty follicle.

Ⅱ期卵巢：呈肉紅色，卵巢加粗，仍有透明質(zhì)感，雌雄亦不易分辨，卵巢表面及組織內(nèi)部密布微血管，卵巢中較多Ⅱ時相初級卵母細(xì)胞，仍有少量卵原細(xì)胞(圖1b、圖2a)。

Ⅲ期卵巢：呈淡黃色，為膨脹的長囊狀，肉眼可見卵粒，但不能分離。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，此時主要為Ⅲ時相的初級卵母細(xì)胞，少量的Ⅱ時相初級卵母細(xì)胞，后期出現(xiàn)少量Ⅳ時相卵母細(xì)胞(圖1c、圖2d)。

Ⅳ期卵巢：呈鮮黃色，膨脹厚實，肉眼可見黃色卵粒充滿整個卵巢。血管發(fā)達(dá)，變粗，在卵巢膜上呈網(wǎng)狀分布。卵巢中同時含卵原細(xì)胞、第Ⅱ時相、第Ⅲ時相和第Ⅳ時相卵母細(xì)胞，以第Ⅳ時相卵母細(xì)胞為主(圖1d、圖2f)。

Ⅴ期卵巢：呈橙黃色，體積達(dá)到最大，卵巢中主要為第Ⅴ時相卵母細(xì)胞，第Ⅱ時相、第Ⅲ時相及第Ⅳ時相卵母細(xì)胞含量較少，卵巢壁變薄，濾泡膜破裂，卵母細(xì)胞釋放到腹腔，卵子成熟(圖1e、圖2g)。

Ⅵ期卵巢：體呈暗紅色，體積較Ⅴ期卵巢縮小。卵巢中含少量卵原細(xì)胞、第Ⅱ時相、第Ⅲ時相初級卵母細(xì)胞以及卵子排出后留下的空濾泡(圖1f、圖2i)。

2.4 翎電鰻卵巢發(fā)育過程中生物學(xué)數(shù)據(jù)的變化

翎電鰻性腺發(fā)育情況與月齡的關(guān)系見表1。4月齡雌魚卵巢中仍含有較多的卵原細(xì)胞，發(fā)育至Ⅱ期；8月齡雌魚的卵巢中含有卵原細(xì)胞、第Ⅱ時相和第Ⅲ時相卵母細(xì)胞，發(fā)育至第Ⅲ期；10月齡雌魚的卵巢則同時存在卵原細(xì)胞、第Ⅱ時相、第Ⅲ時相和第Ⅳ時相卵母細(xì)胞，發(fā)育至第Ⅳ期，達(dá)性成熟；11月齡雌魚卵巢中第Ⅴ時相卵母細(xì)胞占主要成分，為Ⅴ期卵巢。測量得Ⅴ期卵巢中成熟卵徑的大小分布在1.08～1.15 mm和1.78～1.84 mm內(nèi)。

翎電鰻雌魚性腺指數(shù)的變化見圖3。隨著翎電鰻性腺開始發(fā)育卵巢質(zhì)量增加，親魚性腺指數(shù)開始升高，Ⅲ期時發(fā)育加速，在產(chǎn)卵期(卵巢Ⅴ期)時達(dá)到頂峰，為(17.9±1.3)%，顯著高于卵巢Ⅲ期時的(4.30±0.35)%。

表1 翎電鰻性腺發(fā)育與月齡的關(guān)系Tab.1 Relationship between ovarian development and months of age in apteronotid eel A. albifrons

圖3 翎電鰻雌魚性腺指數(shù)的月變化Fig.3 Monthly variations in GSI of female apteronotid eel A. albifrons

3 討 論

3.1 翎電鰻的卵巢發(fā)育特點

翎電鰻腹膜形成的卵巢囊包圍在卵巢周圍，卵巢在體腔前端相遇，形成與泄殖孔相連的輸卵管，為封閉卵巢。研究發(fā)現(xiàn)，翎電鰻卵母細(xì)胞發(fā)育至第Ⅱ時相晚期時形成單層濾泡膜，在第Ⅲ時相卵母細(xì)胞中濾泡膜經(jīng)分化成為內(nèi)、外兩層，外層為鞘膜細(xì)胞層，內(nèi)層為顆粒細(xì)胞層，這與鲇魚(Silurusasotus)[5]的濾泡發(fā)育過程相似。在翎電鰻的卵黃發(fā)生過程中，卵黃物質(zhì)有液泡(又被稱為卵黃泡)和卵黃顆粒兩種類型。第Ⅲ時相卵母細(xì)胞內(nèi)首先在胞質(zhì)較外側(cè)出現(xiàn)液泡，由一個發(fā)展成為一層，再逐步由胞質(zhì)外側(cè)向胞質(zhì)中央不斷擴(kuò)展；卵黃顆粒晚于液泡出現(xiàn)，逐漸融合增大成為球狀和板狀卵黃，長薄鰍(Leptobotiaelongate)[6]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[7]等的卵黃發(fā)育過程與此相同。此外還發(fā)現(xiàn)，第Ⅲ時相卵母細(xì)胞開始出現(xiàn)放射膜，后期伴隨著翎電鰻卵母細(xì)胞的發(fā)育，由于微絨毛相互從卵膜上縮回，導(dǎo)致放射膜厚度逐漸減小，在國內(nèi)外不少專家學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn)了此類現(xiàn)象[8]，如東海鰳魚(Ilishaelongata)[9]，甚至有些魚類在卵母細(xì)胞成熟過程中放射帶會基本消失，如東海銀鯧(Pampusargenteus)[10]。

3.2 翎電鰻的產(chǎn)卵類型分析

根據(jù)卵母細(xì)胞的發(fā)育情況，大多數(shù)硬骨魚類的卵巢發(fā)育模式可分為同步型和非同步型，同步型產(chǎn)卵模式又分為完全同步型和分批同步型2種類型[11-12]。完全同步型，卵巢內(nèi)的卵母細(xì)胞都處于同一發(fā)育時期，通常一生只產(chǎn)卵一次就死亡，如大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[13]、黃尾密鲴(Xenocyprisdavidi)[14]。分批同步型，卵巢內(nèi)存在兩種或兩種以上的卵母細(xì)胞類型，通常每年只產(chǎn)卵一次，如黃海高眼鰈(Cleisthenesherzensteini)[15]、圓斑星鰈(Veraspervariegates)[16]、美洲鰣(Alosasapidissima)[17]和雙須骨舌魚(Osteoglossumbicirrhosum)[18]等。分批非同步型，卵巢內(nèi)存在各種時相的卵母細(xì)胞類型，通常一年內(nèi)產(chǎn)卵多次，如斑馬魚(Daniorerio)[19]、青鳉(Oryziaslatipes)[20]、七彩神仙魚(Symphysodonsp.)[21]等。觀察顯示，翎電鰻在形成多個Ⅳ時相卵母細(xì)胞的同時仍保持有Ⅲ時相和Ⅱ時相卵母細(xì)胞,也保留了一定數(shù)目的卵原細(xì)胞，各時相的細(xì)胞都占有一定的比例。Ⅴ期卵巢中成熟卵徑的大小分布在1.08～1.15 mm和1.78～1.84 mm內(nèi)，呈現(xiàn)出明顯的分批產(chǎn)卵特征。即當(dāng)翎電鰻親魚在營養(yǎng)積累充足且養(yǎng)殖環(huán)境理想的狀態(tài)下，短時間內(nèi)存在一批卵排出后新一批次的卵成熟并被釋放的可能，因此翎電鰻卵巢發(fā)育規(guī)律應(yīng)判定為分批同步型。魚類的分批產(chǎn)卵主要是卵巢發(fā)育的不同步造成的，自然界中，分批產(chǎn)卵魚對環(huán)境的適應(yīng)能力更好，子代不會因為一次突發(fā)性的環(huán)境災(zāi)難就全軍覆沒；然而在生產(chǎn)環(huán)節(jié)，魚類的分批產(chǎn)卵屬性會對卵的收集增加一定難度，為人工繁殖制造了障礙。

3.3 翎電鰻的性腺發(fā)育指數(shù)

本試驗中，翎電鰻達(dá)性成熟時，雌魚平均性腺指數(shù)為17.9%。多數(shù)同步型卵巢發(fā)育模式性腺指數(shù)比非同步型性腺指數(shù)要高，美洲鰣魚雌魚成熟性腺指數(shù)為18.47%[17]，黃尾密鲴雌魚性成熟的性腺指數(shù)為18.6%[14]。而分批非同步產(chǎn)卵類型的七彩神仙魚達(dá)性成熟時雌魚的平均性腺指數(shù)僅為0.712%[21]。

魚類的性腺發(fā)育受到自身激素水平的調(diào)節(jié)，此外環(huán)境因子也對魚類的生殖活動產(chǎn)生影響[22]。諸多環(huán)境因子如氣象水文因子(水溫、光照)、水體理化因子(鹽度、pH)、餌料及產(chǎn)卵基質(zhì)等均能對魚類的生殖過程產(chǎn)生影響[23-24]。Bonnet等[25]發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)卵時改變光照周期會阻礙虹鱒卵母細(xì)胞發(fā)育，顯著降低卵子的質(zhì)量。人工飼養(yǎng)條件下，因餌料充沛且水質(zhì)條件較好，翎電鰻性腺發(fā)育的速度較快，但翎電鰻產(chǎn)卵時對環(huán)境因子要求極高，當(dāng)受到環(huán)境脅迫或成熟的卵子未能成功排出時，肉眼明顯可見解剖后卵巢有褐色閉鎖卵母細(xì)胞。目前，人工養(yǎng)殖下翎電鰻繁殖率較低，如何改善影響其性成熟及順利排卵的環(huán)境因子是目前研究的主要內(nèi)容。

4 結(jié) 論

通過常規(guī)石蠟切片方法對人工飼養(yǎng)條件下雌性翎電鰻卵巢的發(fā)育情況進(jìn)行分析，根據(jù)其外部形態(tài)并結(jié)合切片顯微觀察，將翎電鰻卵巢發(fā)育分為6個時期，卵子發(fā)育分為5個時相。隨著翎電鰻性腺開始發(fā)育卵巢逐漸增大，Ⅲ期時發(fā)育加速，在產(chǎn)卵期(卵巢Ⅴ期)時達(dá)到頂峰，顯著高于發(fā)育前水平。翎電鰻卵巢在發(fā)育形成多個Ⅳ時相卵母細(xì)胞的同時仍保持有Ⅲ時相和Ⅱ時相卵母細(xì)胞，也保留了一定數(shù)目的卵原細(xì)胞，各時相的細(xì)胞都占有一定的比例。翎電鰻Ⅴ期卵巢中成熟卵徑的大小分布于兩個區(qū)間，卵巢發(fā)育規(guī)律為分批同步型。