鱘源魯氏耶爾森菌多位點(diǎn)序列分型及耐藥譜測定

張小麗，麻強(qiáng)生，焦世璋，宋曉育，馬小軍

( 1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省永靖縣農(nóng)牧局，甘肅 臨夏 731600； 3.河南省汝陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 洛陽 471200 )

我國自20世紀(jì)90年代開始鱘魚的商業(yè)化養(yǎng)殖，因其具有生長速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美和營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，有效地推動了我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步形成和發(fā)展，為養(yǎng)殖戶帶來了豐厚的經(jīng)濟(jì)回報(bào)[1]。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對保護(hù)和緩解漁業(yè)資源發(fā)揮了巨大作用，但是隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大和密度增加，逐漸產(chǎn)生了新問題，其中就包括細(xì)菌性疾病頻發(fā)。

魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)屬腸桿菌科、耶爾森菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌。1966年Rucker[2]從患病虹鱒體內(nèi)首次分離到魯氏耶爾森菌。魯氏耶爾森菌有生物1型和生物2型，生物1型運(yùn)動力和水解吐溫80/20呈陽性，而生物2型呈陰性[3]。有報(bào)道表明，該菌主要感染淡水魚類，但近年來也出現(xiàn)大西洋鮭(Salmosalar)感染魯氏耶爾森菌的病例，并且逐年增加[4]。魚類感染魯氏耶爾森菌主要病變特征為泄殖孔紅腫、出血，體表及內(nèi)臟器官充血、出血等。我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中已有虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthysnobilis)、斑點(diǎn)叉尾(Ietaluruspunetaus)和鰻鱺(Anguillajaponica)等感染魯氏耶爾森菌的報(bào)道[5-8]。

2019年7—8月，甘肅省劉家峽某鱘魚養(yǎng)殖場由四川引進(jìn)的雜交鱘(Acipenserschrenckii♀×A.baeri♂)出現(xiàn)采食量下降，精神沉郁，泄殖孔紅腫出血，少數(shù)魚吻部出血。發(fā)病時氣溫28 ℃、表層水溫25 ℃，體質(zhì)量(160±20) g的雜交鱘日死亡率近10%，給養(yǎng)殖者帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。為探究雜交鱘發(fā)病原因，筆者采集病魚肝臟進(jìn)行病原菌分離、鑒定、生物型檢測及多位點(diǎn)序列分型，并對其進(jìn)行耐藥譜分析，為鱘魚細(xì)菌性疾病有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚及主要試劑

患病雜交鱘60尾，體質(zhì)量(160±20) g，同一時間采自甘肅省劉家峽某鱘魚養(yǎng)殖場。

大腸桿菌(Escherichiacoli)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922為本實(shí)驗(yàn)室保存；BHI瓊脂和BHI肉湯購自青島海博生物公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、2000 DNA Marker和PCR試劑購自諾唯贊(南京)公司；藥敏紙片購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；基因擴(kuò)增引物和序列測定由金唯志(天津)公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離

無菌條件下從60尾病魚肝臟取樣劃線接種于BHI平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后挑取形態(tài)規(guī)格一致的單個優(yōu)勢菌落在BHI平板上再次劃線培養(yǎng)，獲得純培養(yǎng)菌株后觀察菌落形態(tài)特征，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌鑒定

將純化的菌株接種BHI肉湯，28 ℃、220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h后按照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rRNA，引物為：F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R，5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′；PCR反應(yīng)體系為：25 μL mix，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，ddH2O補(bǔ)足至50 μL；PCR循環(huán)為：94 ℃ 5 min，30×(94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)，72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至金唯智(天津)公司進(jìn)行測序。

測序結(jié)果在數(shù)據(jù)庫上BLAST比對分析后，根據(jù)測定的16S rRNA序列與相關(guān)屬(種)16S rRNA序列利用MEGA 7.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，各個分支的Bootstrap值選擇2000[9]。

1.2.3 生物型檢測

分離株穿刺接種半固體培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后觀察分離株生長狀況。僅沿穿刺線生長為陰性，表明無運(yùn)動力；沿穿刺線生長且穿刺線兩側(cè)出現(xiàn)明顯的羽毛狀或云霧狀為陽性，表明有運(yùn)動力[10]。分離株菌液用無菌生理鹽水適量稀釋后取0.2 mL均勻涂布于吐溫80水解培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察菌落周圍是否出現(xiàn)渾濁，不出現(xiàn)渾濁為陰性，表明不水解吐溫80；出現(xiàn)渾濁為陽性，表明水解吐溫80[11]。因?yàn)榇竽c桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922有運(yùn)動力且能夠水解吐溫80，所以接種在上述2種培養(yǎng)基與分離菌株同等環(huán)境和時間培養(yǎng)后作為對照組。

1.2.4 多位點(diǎn)序列分型

根據(jù)魯氏耶爾森菌MLST數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/yruckeri/)提供的6個管家基因和引物進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型。PCR反應(yīng)體系為：25 μL mix，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，ddH2O補(bǔ)足至50 μL；PCR循環(huán)參照魯氏耶爾森菌MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行(表1)。擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至金唯智(天津)公司進(jìn)行雙向測序。

測序結(jié)果用DNASTAR軟件進(jìn)行拼接、質(zhì)量驗(yàn)證，登錄魯氏耶爾森菌MLST數(shù)據(jù)庫，對每株菌的6個管家基因序列進(jìn)行查詢比對，得到相應(yīng)的等位基因編碼，按照glnA、gyrB、dnaJ、thrA、hsp60和recA的排列順序，確定菌株的ST型。

表1 擴(kuò)增魯氏耶爾森菌管家基因的引物和反應(yīng)條件Tab.1 Primers and reaction conditions for amplification of the housekeeping genes of Y. ruckeri strain

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

每株分離株的不同等位基因序列通過MEGA 7.0軟件Clustal W功能進(jìn)行比對分析，串聯(lián)6個管家基因采用鄰接法進(jìn)行Bootstrap值為2000次的重復(fù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 耐藥譜測定

分離株接種于BHI瓊脂，選用強(qiáng)力霉素、卡那霉素、氟苯尼考、阿莫西林、大觀霉素、多黏菌素、恩諾沙星、諾氟沙星、氨芐西林和阿米卡星等10種藥敏紙片，參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會抗生素敏感試驗(yàn)操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行紙片擴(kuò)散法抑菌試驗(yàn)[12]，總結(jié)歸納出耐藥譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

60尾患病雜交鱘泄殖孔均紅腫出血，部分病魚還出現(xiàn)吻部出血；剖檢后肝臟均有明顯出血點(diǎn)，部分病魚膽汁外溢，腎臟、心臟和脾臟無明顯變化(圖1)。60尾患病鱘魚肝臟中每尾都分離到1株優(yōu)勢菌株，在BHI平板上形成邊緣整齊、表面光滑、透明的圓形菌落；16S rRNA序列與在美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站BLAST中的魯氏耶爾森菌16S rRNA序列同源性達(dá)99%，且在系統(tǒng)發(fā)育樹中與魯氏耶爾森菌聚為一支(圖2)。所以，60尾患病鱘魚肝臟中分離到的病原菌是魯氏耶爾森菌，命名為LJX1～LJX60。

圖1 患病死亡雜交鱘外觀和病理剖檢Fig.1 Appearance and pathological examination of sick hybrid sturgeon A. schrenckii ♀ × A. baeri ♂a.外觀； b.吻部出血； c.泄殖孔紅腫出血； d.肝臟出血； e.膽汁外溢.a.the hybrid sturgeon appearance; b.bleeding in the snout of hybrid sturgeon; c.the cloacal swelling and redness of the hybrid sturgeon; d.bleeding liver in hybrid sturgeon; e.bile spill in hybrid sturgeon.

2.2 生物型檢測

60株魯氏耶爾森菌在半固體培養(yǎng)基僅沿穿刺線生長，說明無運(yùn)動力；在吐溫80水解培養(yǎng)基未出現(xiàn)明顯的渾濁，說明不水解吐溫80。綜上所述，60株魯氏耶爾森菌分離株均為生物2型(圖3)。

2.3 多位點(diǎn)序列分型

6個管家基因glnA、gyrB、dnaJ、thrA、hsp60和recA經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳均獲得清晰單一條帶(圖4)。6個管家基因序列在魯氏耶爾森菌MLST數(shù)據(jù)庫中比對，得到相應(yīng)等位基因編碼和ST型，共獲得6種ST型，未發(fā)現(xiàn)新的ST型(表2)；其中ST1有40株，ST2有8株，ST3有3株，ST5有2株，ST8有1株，ST13有6株(表3)。

圖2 60株魯氏耶爾森菌16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed from 16S rRNA gene sequences of 60 Y. ruckeri strains Group1是60株分離株，Group2是與分離株同源性高的菌株，Group3是耶爾森菌屬其他種. Group 1 is 60 isolates, Group 2 is a strain with high homology to the isolate, and Group 3 is other Yersinia species.

圖3 60株魯氏耶爾森菌的生物型檢測Fig.3 Biotype detection of 60 Y. ruckeri strainsa.穿刺試驗(yàn)空白對照； b.魯氏耶爾森菌分離株穿刺試驗(yàn)； c.大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922穿刺試驗(yàn)； d.水解吐溫80試驗(yàn)空白對照； e.魯氏耶爾森菌分離株水解吐溫80試驗(yàn)； f.大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922水解吐溫80試驗(yàn).a.blank control in a puncture test; b.piercing test of Y. ruckeri strains; c.puncture test of E.coli standard quality control strain ATCC25922; d.blank control in a hydrolysis Tween 80 test; e.Y. ruckeri strains in hydrolyzed Tween 80 test; f. E.coli standard quality control strain ATCC25922 in a hydrolysis Tween 80 test.

圖4 6個管家基因電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of six housekeeping genes

表2 60株魯氏耶爾森菌ST型

(續(xù)表2)

表3 60株魯氏耶爾森菌MLST信息表Tab.3 MLST information on 60 strains of Y. ruckeri

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

6個管家基因序列串聯(lián)后對60株魯氏耶爾森菌分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示，系統(tǒng)發(fā)育樹有2個明顯的分支Group1和Group2，在Group1中有ST3、ST5和ST8，而Group2中沒有這3種ST型，說明此次分離株在進(jìn)化關(guān)系上有較大的差異；ST1、ST2和ST13魯氏耶爾森菌分離株在Group1和Group2均有，說明此次分離株即使是同一來源地的同一ST型，在進(jìn)化關(guān)系上也有明顯的差異(圖5)。

圖5 60株魯氏耶爾森菌6個管家基因串聯(lián)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 A phylogenetic tree of six housekeeping genes of 60 strains of Y. ruckeri

2.5 耐藥譜測定

選用10種抗生素來測定60株魯氏耶爾森菌分離株的藥物敏感性，得到了9種耐藥譜(表4)。由表4可見，60株魯氏耶爾森菌分離株有19株對10種抗生素均敏感；耐1種抗生素的有18株，耐2種抗生素的有7株，耐3種抗生素的有8株，耐4種抗生素的有4株，耐5種抗生素的有4株。說明此次魯氏耶爾森菌分離株耐藥類型多樣，其中多重耐藥現(xiàn)象普遍，耐卡那霉素和恩諾沙星的比例最高，分別為43%和30%。結(jié)合耐藥譜和ST型發(fā)現(xiàn)，對10種抗生素都敏感的有6種ST型，即ST1、ST2、ST3、ST5、ST8和ST13；耐1種抗生素的有ST1、ST2和ST13；耐2種抗生素的有ST1、ST2和ST13；耐3種、4種和5種抗生素的有ST1。3種耐藥譜中有ST13，4種耐藥譜中有ST2，9種耐藥譜中全部都有ST1。綜上，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，此次60株魯氏耶爾森菌ST型可能與耐藥性無顯著相關(guān)性。

表4 60株魯氏耶爾森耐藥譜Tab.4 Drug resistance range of 60 strains of Y. ruckeri

3 討 論

3.1 我國鱘魚細(xì)菌性疾病研究

近年來我國鱘魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，雖然給養(yǎng)殖者帶來可觀的經(jīng)濟(jì)收入，但也逐漸出現(xiàn)了養(yǎng)殖密度增加和環(huán)境破壞等現(xiàn)象，隨之而來的是水質(zhì)下降和細(xì)菌性疾病頻發(fā)。目前，我國報(bào)道鱘魚感染的細(xì)菌主要有停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)、海豚鏈球菌(S.iniae)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和魯氏耶爾森菌等[13-16]，細(xì)菌性疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到我國鱘魚的養(yǎng)殖。

3.2 生物型和ST型相關(guān)性分析

魯氏耶爾森菌目前有生物1型和2型，最近的研究顯示，生物1型的菌體長度大于生物2型，并且生物2型常暴發(fā)于接種過疫苗的魚類[3]。魯氏耶爾森菌出現(xiàn)2種生物型是由生物2型flhA或flhE基因缺失或flhA基因突變[17]所致。決定魯氏耶爾森菌ST型的6個管家基因不包括flhA和flhE基因，所以生物型與ST型沒有相關(guān)性。

3.3 相同ST型的進(jìn)化關(guān)系分析

魯氏耶爾森菌MLST數(shù)據(jù)庫目前收錄了30種ST型，本試驗(yàn)分離到6種ST型，占比為20%，說明此次鱘魚感染的魯氏耶爾森菌ST型較復(fù)雜。本試驗(yàn)串聯(lián)6個管家基因系統(tǒng)發(fā)育樹表明此次魯氏耶爾森菌分離株即使是同一時間、同一來源地的相同ST型，在進(jìn)化關(guān)系上也有明顯的差異，這可能是魯氏耶爾森菌在侵染宿主時或者在宿主體內(nèi)隨著時間的推移，個別管家基因的某些位點(diǎn)發(fā)生了突變，導(dǎo)致同一ST型的不同個體出現(xiàn)差異。

3.4 耐藥性和ST型相關(guān)性分析

本研究選用10種抗生素對60株魯氏耶爾森菌進(jìn)行藥敏性分析，共發(fā)現(xiàn)9種耐藥譜，其中耐卡那霉素和恩諾沙星的比例最高，分別為43%和30%。此次試驗(yàn)結(jié)果顯示，魯氏耶爾森菌分離株的耐藥譜有所增加，楊昆明等[1]研究顯示，鱘源魯氏耶爾森菌對卡那霉素和恩諾沙星敏感，而本研究結(jié)果顯示，有36株魯氏耶爾森菌對卡那霉素和恩諾沙星明顯耐藥；方蘋等[6]研究顯示，鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthysnobilis)源魯氏耶爾森菌對恩諾沙星敏感，而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，有18株魯氏耶爾森菌對恩諾沙星明顯耐藥；本試驗(yàn)中也有24株魯氏耶爾森菌分離株對卡那霉素和恩諾沙星敏感，這與楊昆明等[1,6]的研究結(jié)果相同。以上結(jié)果說明不同分離地區(qū)、不同水域、不同宿主和不同用藥情況均可導(dǎo)致魯氏耶爾森菌的耐藥性出現(xiàn)不同。

耐藥譜和ST型的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，3種耐藥譜中有ST13，4種耐藥譜中有ST2，9種耐藥譜中均有ST1，即使是同一ST型的不同個體耐藥情況也不相同。因此筆者認(rèn)為ST型可能和耐藥性之間沒有聯(lián)系，這可能是由同一ST型分離株的耐藥基因的某個位點(diǎn)發(fā)生突變或者是不同ST型分離株的耐藥基因相同所致。

3.5 臨床癥狀和病理變化與ST型相關(guān)性分析

本試驗(yàn)中60尾患病雜交鱘除了出現(xiàn)共同的臨床癥狀(泄殖孔紅腫出血)和病理變化(肝臟出血)之外，其中5尾吻部出血，肝臟處分離到5株ST1型魯氏耶爾森菌，即菌株LJX1、LJX8、LJX32、LJX34和LJX38；3尾膽汁外溢，肝臟處分離到3株ST1型魯氏耶爾森菌，即菌株LJX21、LJX31和LJX36；1尾既出現(xiàn)吻部出血又出現(xiàn)膽汁外溢，肝臟處分離到1株ST1型魯氏耶爾森菌，即LJX60。所以，筆者認(rèn)為，鱘魚感染同一ST型魯氏耶爾森菌可能會有不同的臨床癥狀和病理變化，感染不同ST型魯氏耶爾森菌可能出現(xiàn)相同的臨床癥狀和病理變化。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是同一ST型魯氏耶爾森菌的某些致病基因發(fā)生突變或者是不同ST型魯氏耶爾森菌的致病基因相同，還可能與鱘魚不同個體間的免疫系統(tǒng)出現(xiàn)差異有關(guān)。國內(nèi)報(bào)道鱘魚感染魯氏耶爾森菌的主要癥狀為泄殖孔紅腫外突，偶見腹部、胸鰭部和嘴部出血；剖檢變化主要是肝臟出血甚至壞死，心臟、腎臟和脾臟等臟器的病變[1,16,18-19]；而本試驗(yàn)結(jié)果表明，魯氏耶爾森菌還可導(dǎo)致鱘魚吻部出血和膽汁外溢。

3.6 國內(nèi)外研究及防治策略分析

目前國內(nèi)外魯氏耶爾森菌致病性的研究還不夠完善，大多是依賴基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法來識別基于序列的毒力基因[20-22]。針對這種重要的經(jīng)濟(jì)魚類病原菌，未來的研究應(yīng)該通過試驗(yàn)來解決毒力基因、耐藥性、耐藥基因、ST型、生物型和血清型相互之間的關(guān)系，這些都將是防治魚類魯氏耶爾森菌病的重要理論基礎(chǔ)。接種商品化疫苗已成為預(yù)防魚類魯氏耶爾森菌病暴發(fā)的重要途徑[23]；幾乎各國在治療魚類魯氏耶爾森氏菌病時都使用抗生素，雖然短期效果明顯，但是長期使用抗生素容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，造成水體環(huán)境污染，引起食品安全等諸多問題。陶健等[24]發(fā)現(xiàn)，中草藥黃芩和訶子對鱘源魯氏耶爾森菌有明顯的抑菌作用，為魚類魯氏耶爾森菌病的防治提供了新方向。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中雜交鱘出現(xiàn)大批死亡是感染6種不同ST型(ST1、ST2、ST3、ST5、ST8和ST13)的生物2型魯氏耶爾森菌所致。