十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉急性毒性及血液生理生化指標(biāo)的影響

田海軍，劉開放，任勝杰

( 1.信陽農(nóng)林學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，河南 信陽 464000； 2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051 )

陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉(LAS或SDBS)，是一種降低兩相間界面張力和液體表面張力的物質(zhì)，具有潤濕、分散、乳化、增溶、起泡、消泡、洗滌、潤滑、防腐、殺菌等作用[1]。十二烷基苯磺酸鈉廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、建筑業(yè)、醫(yī)藥以及日常生活中[2]。我國表面活性劑洗滌用品工業(yè)協(xié)會統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年我國表面活性劑產(chǎn)品產(chǎn)量為2.1303×106t，銷量達(dá)2.1839×106t，預(yù)計未來幾年內(nèi)整體將呈現(xiàn)增長的發(fā)展態(tài)勢[3]。十二烷基苯磺酸鈉等表面活性劑大量排入水體環(huán)境，形成大量積聚不散的泡沫層，使水中溶解氧含量明顯降低、水質(zhì)惡化，嚴(yán)重影響水生生物的正常生長，破壞了水生態(tài)系統(tǒng)平衡[4-7]。它帶來的污染逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的重視，因此，研究表面活性劑對水環(huán)境污染及其對水生動物的生理生化影響顯得尤為重要。

我國海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB 3097—1997)規(guī)定：一類海水中十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≤0.03 mg/L, 二、三、四類海水中十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≤0.1 mg/L，而我國十二烷基苯磺酸鈉的工業(yè)排放標(biāo)準(zhǔn)是質(zhì)量濃度≤10 mg/L[7]。十二烷基苯磺酸鈉表面活性劑超標(biāo)排放對水生動物的生理生化代謝會構(gòu)成嚴(yán)重的影響?，F(xiàn)在國外已有專門的法律，規(guī)定各種表面活性劑必須能夠被生物降解，盡可能減少環(huán)境污染[8-13]。

黃河鯉(Cyprinuscarpiohaematopterus)，是中國“四大淡水名魚”之首，黃河鯉肉質(zhì)肥厚，細(xì)嫩鮮美，營養(yǎng)豐富。目前，十二烷基苯磺酸鈉對水生動物的毒性研究選取的對象有草魚(Ctenopharyngodonidellus)、彭澤鯽(Carassiusauratusvar.pengsesis)等，但是十二烷基苯磺酸鈉對經(jīng)濟效益高的黃河鯉的毒性研究鮮見報道，有關(guān)十二烷基苯磺酸鈉對水生動物生理生化的影響研究僅見于十二烷基苯磺酸鈉對彭澤鯽鰓及肝胰臟腺苷三磷酸酶和超氧化物歧化酶活性的影響，有關(guān)十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血液生理生化指標(biāo)的影響研究更是空白。

一方面，盡管表面活性劑污染已逐漸引起關(guān)注，但其對水生動物的生理代謝影響方面的研究工作卻十分缺乏[14-15]。另一方面，國內(nèi)外尚未形成有效減弱及治理表面活性劑水域污染的措施。因此筆者系統(tǒng)研究表面活性劑污染對黃河鯉的生理代謝影響，為有效治理表面活性劑污染提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚為黃河鯉，由河南省大宗淡水魚現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系試驗基地提供，體長為(11.7±1.2) cm，體質(zhì)量為(38.7±0.8) g。試驗前實驗室水族箱馴養(yǎng)15 d。試驗用水族箱1.2 m×0.6 m×0.8 m，試驗用水為經(jīng)過24 h曝氣的自來水，水溫(21.4±0.8) ℃，pH 7.0～7.5，溶解氧水平(6.4±0.5) mg/L，馴養(yǎng)期間每日定時喂食及換水，試驗前2 d及整個試驗期間停止喂食和換水。

十二烷基苯磺酸鈉(C18H29NaO3S)為分析純，中國醫(yī)藥河南化學(xué)試劑公司生產(chǎn)。血液自動生化分析儀(日立 7020 型)，半自動血細(xì)胞分析儀(SYSMEX F-820)。

1.2 急性毒性試驗

正式急性毒性試驗前，進行預(yù)試驗，確定十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉96 h無死亡的最高質(zhì)量濃度和24 h全部死亡的最低質(zhì)量濃度。按等對數(shù)間距設(shè)置6個質(zhì)量濃度組及1個空白對照組，共設(shè)置7個質(zhì)量濃度(0、5.00、6.05、7.32、8.87、10.73、13.00 mg/L)[16]。每個梯度設(shè)4個平行組和1個空白對照組，每個平行15尾魚。試驗時間為96 h，詳細(xì)觀察和記錄黃河鯉的活動和中毒時的癥狀，分別在24、48、72、96 h記錄試驗魚的死亡情況，用寇氏法[17]計算出半致死質(zhì)量濃度。

1.3 十二烷基苯磺酸鈉對血液生化指標(biāo)影響試驗

采用半靜態(tài)試驗方法[18]，十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度根據(jù)96 h半致死質(zhì)量濃度，設(shè)置為0、1.0、2.0、3.0，4.0、6.0、8.0 mg/L共7個梯度，每個梯度設(shè)3個平行，每個平行隨機放魚15尾，暴露時間為96 h。

1.3.1 血漿生化指標(biāo)的測定

在96 h取樣，從各組各平行中隨機抽取6尾，每組18尾，用加入了抗凝劑的5 mL注射器尾靜脈取血2～3 mL，于4 ℃下放置2 h，經(jīng)3000 r/min離心，收集血漿，測定血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白、血漿堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐、肌酸磷酸激酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、Na+、K+、Ca2+等生化指標(biāo)，在自動生化分析儀上當(dāng)日測定完成。

1.3.2 血液生理指標(biāo)的測定

在96 h取樣，從各組各平行中隨機抽取6尾，每組18尾，用加入了抗凝劑的5 mL注射器尾靜脈取血2～3 mL，用半自動血細(xì)胞分析儀測定紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗結(jié)果

急性毒性試驗開始時，部分黃河鯉上下亂竄。隨著十二烷基苯磺酸鈉暴露時間的延長，部分黃河鯉傾斜，受外界觸碰刺激也不躲避；部分魚游動過程中身體搖動不止。高質(zhì)量濃度十二烷基苯磺酸鈉暴露的黃河鯉慢慢停止活動，直至死亡。十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別是10.27、9.51、9.16、8.59 mg/L，95%置信區(qū)間分別為9.59～10.98、8.85～10.22、8.50～9.85、7.96～9.27 mg/L(表1)，十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉為中等毒性。

表1 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉的半致死質(zhì)量濃度Tab.1 Median lethal concentration of LAS to Yellow River carp C. carpio haematopterus

2.2 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血液生化指標(biāo)的影響結(jié)果

2.2.1 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血漿免疫蛋白指標(biāo)的影響

十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白等免疫蛋白指標(biāo)的影響結(jié)果見表2。其中十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為2.0、3.0、4.0、6.0 mg/L時，血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白質(zhì)量濃度顯著低于對照組(P<0.05)；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為8.0 mg/L時，血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白質(zhì)量濃度極顯著低于對照組(P<0.01)；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，血漿免疫蛋白低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。由此表明，十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L可引起黃河鯉血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白顯著降低。

表2 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血漿免疫蛋白指標(biāo)的影響 g/LTab.2 Effect of LAS on plasma immune protein index inYellow River carp C. carpio haematopterus

2.2.2 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血漿酶的影響

十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶和堿性磷酸酶等血漿酶指標(biāo)的影響結(jié)果見表3。其中十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度2.0、3.0、4.0、6.0 mg/L時，血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶活性顯著高于對照組(P<0.05)；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為8.0 mg/L時，血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶活性極顯著高于對照組(P<0.01)；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶活性高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為2.0、3.0、4.0、6.0 mg/L時，血漿堿性磷酸酶活性顯著低于對照組(P<0.05)；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為8.0 mg/L時，血漿堿性磷酸酶活性極顯著低于對照組(P<0.01)；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，血漿堿性磷酸酶活性低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。由此可見，十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L引起黃河鯉血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶活性顯著升高，血漿堿性磷酸酶活性顯著降低。

表3 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血漿酶指標(biāo)的影響 IU/LTab.3 Effect of LAS on plasma enzyme activities of Yellow River carp C. carpio haematopterus

2.2.3 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉腎功能代謝指標(biāo)的影響

十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉尿素氮、肌酐、Na+、K+、Ca2+腎功能指標(biāo)的影響見表4。十二烷基苯磺酸鈉暴露引起黃河鯉血漿中尿素氮、肌酐濃度升高，其中2.0、3.0、4.0、6.0 mg/L組顯著高于對照組(P<0.05)，8.0 mg/L組極顯著高于對照組(P<0.01)，1.0 mg/L組高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。十二烷基苯磺酸鈉暴露引起黃河鯉血漿中Na+、K+離子濃度升高，其中3.0、4.0、6.0 mg/L組顯著高于對照組(P<0.05)，8.0 mg/L組極顯著高于對照組(P<0.01)，1.0、2.0 mg/L組高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血漿中Ca2+濃度的影響不顯著(P>0.05)。由此可見，十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L引起黃河鯉血漿中尿素氮、肌酐濃度顯著升高；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥3.0 mg/L引起黃河鯉血漿中Na+、K+濃度顯著升高；十二烷基苯磺酸鈉對Ca2+濃度的影響較小。

表4 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉腎功能指標(biāo)的影響 mmol/LTab.4 Effect of LAS on renal function indices of Yellow River carp C. carpio haematopterus

2.3 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血液生理指標(biāo)的影響

十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血液紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白生理指標(biāo)的影響見表5。十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為2.0、3.0、4.0、6.0 mg/L時，血液紅細(xì)胞密度和血紅蛋白質(zhì)量濃度顯著低于對照組(P<0.05)；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為8.0 mg/L時，血液紅細(xì)胞、白細(xì)胞密度和血紅蛋白質(zhì)量濃度極顯著低于對照組(P<0.01)；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，紅細(xì)胞、白細(xì)胞密度和血紅蛋白質(zhì)量濃度低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。由此表明，十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L引起黃河鯉血液紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白降低。

表5 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血液生理指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of LAS on blood physiological indices of Yellow River carp C. carpio haematopterus

3 討 論

3.1 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉毒性作用機制

十二烷基苯磺酸鈉分子的疏水端親和污垢(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等)、親水端溶于水，污垢分散于水中，繼而被十二烷基苯磺酸鈉沖洗掉，然而十二烷基苯磺酸鈉同樣能作用于生物的脂質(zhì)細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜裂解最終致細(xì)胞死亡[19]。本試驗中，十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉的96 h半致死質(zhì)量濃度為8.59 mg/L，與十二烷基苯磺酸鈉對草魚96 h半致死質(zhì)量濃度為8.6 mg/L和十二烷基苯磺酸鈉對彭澤鯽96 h半致死質(zhì)量濃度為8.43 mg/L的結(jié)果相近[19-21]。水溫、pH、溶解氧水平和試驗對象及其發(fā)育階段的不同都可能影響十二烷基苯磺酸鈉急性毒性試驗結(jié)果。參照《生物技術(shù)檢測規(guī)范(水環(huán)境部分)》中農(nóng)藥對魚類的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉的毒性屬于中等毒性。

3.2 十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉血液生理生化指標(biāo)的影響

魚類血液生理生化狀況作為評價魚體對環(huán)境的適應(yīng)指標(biāo)被廣泛應(yīng)用，當(dāng)外界因子影響魚體而發(fā)生生理或病理變化時，血液指標(biāo)的變化必定會反映出來[22]。動物環(huán)境應(yīng)激時血液生理與生化指標(biāo)是反映體內(nèi)物質(zhì)代謝和組織器官機能狀態(tài)變化的一個重要特征[23]。

血漿蛋白可以用來診斷魚類營養(yǎng)健康和疾病等情況，總蛋白、白蛋白、球蛋白可反映出魚體的免疫狀態(tài)及蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況。十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L引起黃河鯉血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白含量顯著降低，說明十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉的免疫蛋白及營養(yǎng)均有不利影響。

血漿中酶的變化能夠反映機體代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)化的狀況。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的酶由于細(xì)胞膜的屏障作用，不易逸出[24]。只有細(xì)胞膜遭受破壞，細(xì)胞內(nèi)的酶釋放入血液中，血漿中酶的活性才明顯升高[24]。健康狀況下動物血漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶只有微量,但當(dāng)肝胰臟和心臟等內(nèi)臟器官發(fā)生損傷時,血漿內(nèi)這種酶的活性將升高[25]。堿性磷酸酶是動物代謝過程中重要的調(diào)控酶，能催化磷酸單酯的水解及磷酸基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，堿性磷酸酶是一種結(jié)合在細(xì)胞膜上的金屬酶，金屬離子對維持其分子結(jié)構(gòu)和催化活性均具有重要意義[26]。魚類處于不利環(huán)境，如重金屬污染時,其堿性磷酸酶活性會受到影響[27]。十二烷基苯磺酸鈉對水生動物的毒性與金屬汞相似[19]，因此會影響堿性磷酸酶活性。本試驗結(jié)果顯示，十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L引起黃河鯉血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸磷酸激酶活性顯著升高,并且隨著十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度的增加，升高趨勢加劇；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L引起黃河鯉血漿堿性磷酸酶活性顯著降低,并且隨著十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度的增加，下降趨勢加劇。表明十二烷基苯磺酸鈉≥2.0 mg/L對黃河鯉肝胰臟和心肌細(xì)胞膜造成了損傷，并且隨著十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度的增加，損傷加劇。

Na+、K+維持機體正常代謝，K+調(diào)節(jié)機體酸堿平衡，Na+、K+在生物學(xué)過程中是相互作用的[28]；Ca2+對神經(jīng)肌肉的興奮、神經(jīng)信號的傳遞、細(xì)胞功能的維持、酶的活性以及激素分泌等都有重要作用[29]。血液中尿素氮和肌酐的濃度間接反映腎臟的排泄功能，當(dāng)腎功能降至一定程度時，血漿尿素氮、肌酐就會升高，所以臨床上常以血肌酐、尿素氮的水平來代表腎臟功能[30]。本試驗結(jié)果顯示，十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L引起黃河鯉血漿中尿素氮、肌酐濃度顯著升高；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥3.0 mg/L引起黃河鯉血漿中Na+、K+濃度顯著升高；十二烷基苯磺酸鈉對Ca2+濃度的影響較小?？梢酝茢嗍榛交撬徕c造成黃河鯉的腎功能受到影響，保鈉排鉀功能減弱,導(dǎo)致魚體內(nèi)電解質(zhì)平衡失調(diào)。

魚類是通過血液紅細(xì)胞運送氧氣，同時紅細(xì)胞還具有免疫功能[31]。白細(xì)胞的主要功能是防衛(wèi)作用，參與機體的防御反應(yīng)，白細(xì)胞數(shù)可反映出魚體的免疫狀態(tài)，血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)運輸氧的特殊蛋白質(zhì)，血紅蛋白攜帶和運輸氧氣[31]。本試驗結(jié)果顯示，十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L引起黃河鯉血漿紅細(xì)胞、白細(xì)胞密度和血紅蛋白質(zhì)量濃度降低，表明魚類在十二烷基苯磺酸鈉暴露后血液的氧結(jié)合力下降,代謝水平降低，免疫力減弱，可能導(dǎo)致黃河鯉中毒或引發(fā)某些疾病，魚體發(fā)生病理變化。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果表明，表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉對黃河鯉96 h半致死質(zhì)量濃度為8.59 mg/L，為中等毒性。同時，水體中十二烷基苯磺酸鈉暴露質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L引起黃河鯉血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白、血液血紅蛋白質(zhì)量濃度，血漿堿性磷酸酶活性，紅細(xì)胞、白細(xì)胞密度降低，引起黃河鯉血漿尿素氮、肌酐濃度，肌酸磷酸激酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性升高；十二烷基苯磺酸鈉質(zhì)量濃度≥3.0 mg/L引起黃河鯉血漿中Na+、K+濃度升高；十二烷基苯磺酸鈉對Ca2+濃度的影響較小。因此，建議加強十二烷基苯磺酸鈉的水環(huán)境及水生動物風(fēng)險評估，避免十二烷基苯磺酸鈉廣泛使用帶來的環(huán)境污染問題，確保水環(huán)境和水生生物安全。