鹽度馴化下許氏平鲉血清生化指標(biāo)及滲透壓的變化

成智麗，孫鵬飛，羅 珺,2，沈雙燁，張賽賽，王 偉

( 1.大連海洋大學(xué),遼寧省北方魚類應(yīng)用生物學(xué)與增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116023； 2.大連圣亞旅游控股股份有限公司，遼寧 大連 116023； 3.大連市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展服務(wù)中心， 遼寧 大連 116023 )

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)，屬脊索動(dòng)物門、輻鰭魚綱、鲉形目、平鲉屬[1]。目前，對(duì)許氏平鲉的研究主要集中在基礎(chǔ)生物學(xué)[2-4]，消化及組織化學(xué)[5]，環(huán)境脅迫[6-7]和營(yíng)養(yǎng)需求[8-9]等方面。我國(guó)在20世紀(jì)80年代后期人工育苗獲得成功[10]，目前許氏平鲉已經(jīng)成為我國(guó)及日本等周邊國(guó)家一種重要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖種類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

鹽度對(duì)魚體的影響主要在于生理生化反應(yīng)、免疫、生長(zhǎng)發(fā)育、攝食和繁殖等，不同鹽度條件下魚類會(huì)表現(xiàn)相互不同的適應(yīng)狀態(tài)[11-15]。目前鹽度脅迫相關(guān)研究主要集中在大鱗大馬哈魚(Oncorhynchustshawytscha)[16]、大西洋鮭(Salmosalar)[17]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[18]、眼斑擬石首魚(Sciaenopsocellatus)[11]、墨綠凹鼻鲀(Chelonodonnigroviridis)[19]等魚類中，而關(guān)于許氏平鲉的相關(guān)研究較少。研究發(fā)現(xiàn)，廣鹽性魚類通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性[19]、營(yíng)養(yǎng)代謝途徑[20]和機(jī)體離子濃度[21]等多種方式來調(diào)節(jié)滲透壓，以適應(yīng)水體中鹽度的變化。當(dāng)環(huán)境中鹽度發(fā)生變化時(shí)，魚類的鰓、腸道和腎臟等器官的滲透壓轉(zhuǎn)移因子[22-23]、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶[24]、Na+/K+-ATP酶離子轉(zhuǎn)移酶[25-26]等物質(zhì)首先參與調(diào)節(jié)滲透壓和電解質(zhì)濃度，使機(jī)體形成新的滲透壓平衡以適應(yīng)環(huán)境中鹽度變化。筆者主要對(duì)許氏平鲉在鹽度馴化后血清的生化指標(biāo)及滲透壓變化進(jìn)行研究，進(jìn)而為許氏平鲉的養(yǎng)殖生產(chǎn)和海水魚淡化養(yǎng)殖提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用魚捕撈自大連旅順及黑石礁海域，共140尾，均為健康個(gè)體。其體質(zhì)量(94.32±6.41) g，體長(zhǎng)(19.13±1.32) cm。

將采集后的試驗(yàn)魚帶水充氧運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，先放在室內(nèi)(24 ℃左右)暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)期間，鹽度32，每日8:00投喂1次，飼料日投喂量約為魚體質(zhì)量的3%，日換水率不少于50%。

1.2 主要儀器和設(shè)備

離心機(jī)(CT15RE，Hitachi Koki Co.,Ltd.)，電子天平[PL203，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司]，鹽度計(jì)(WZ-211，北京萬成北增精密儀器有限公司)，滲透壓儀(OSMOMAT030)，全自動(dòng)生化分析儀(BS-400，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

臨床毒理病理變化將生物體反應(yīng)分為急性期、慢性期和恢復(fù)期。因此，根據(jù)感染、炎癥、組織損傷等應(yīng)激原作用于機(jī)體后的時(shí)間長(zhǎng)短，將馴化試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為在數(shù)小時(shí)至數(shù)日內(nèi)(急性)和數(shù)十日以上(慢性)兩個(gè)階段。

1.3.1 急性鹽度馴化試驗(yàn)

許氏平鲉急性鹽度馴化試驗(yàn)設(shè)置鹽度為30、25、20、15、10、5、4、3、2、0共10個(gè)鹽度梯度組，試驗(yàn)組水體鹽度分別加入生化海水晶進(jìn)行調(diào)節(jié)，并使用鹽度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)試驗(yàn)組另設(shè)2個(gè)平行，每個(gè)平行放魚4尾。此外設(shè)置3組陰性海水對(duì)照組(鹽度為32)，用以確定試驗(yàn)用魚健康，對(duì)照組不計(jì)入死亡率統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)開始將暫養(yǎng)于鹽度為32的海水中的試驗(yàn)用魚分別放入各試驗(yàn)組中，觀察并記錄各組在3、6、9、12、24、48、72、96 h許氏平鲉的死亡尾數(shù)。急性鹽度馴化試驗(yàn)階段不進(jìn)行投喂。

根據(jù)Karber氏法的原理，對(duì)3、6、9、12、24、48、72、96 h半致死鹽度(LD50)及其安全鹽度(SC)[27]用Excel進(jìn)行運(yùn)算。其運(yùn)算公式為：

lg LD50=∑1/2(Xi+Xi+1)(Pi+1-Pi)

CI=lg-1(lg LD50±1.96×Sm)

SC=(48 h LD50×0.3)/(24 h LD50/48 h LD50)2

式中，Xi為對(duì)數(shù)劑量，Pi為死亡率，CI為半致死鹽度的95%可信限，Sm為標(biāo)準(zhǔn)誤，d為對(duì)數(shù)差，n為試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)。

1.3.2 慢性鹽度馴化試驗(yàn)

將暫養(yǎng)后的試驗(yàn)魚隨機(jī)分成4組，1組為海水對(duì)照組(鹽度為32)，另3組為試驗(yàn)平行組，每組放魚15尾。根據(jù)急性試驗(yàn)馴化所得的半致死鹽度，慢性鹽度馴化的鹽度設(shè)置9個(gè)梯度，分別為32、30、27、24、21、18、15、12、9，每次按照鹽度梯度由高到低，每隔7 d、每試驗(yàn)組每槽降低1鹽度后，在第1天的14:00取樣，并進(jìn)行血清相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.3 試驗(yàn)管理

試驗(yàn)用養(yǎng)殖水槽容積為200 L(進(jìn)行馴化試驗(yàn)時(shí)用阻攔網(wǎng)固定在每個(gè)水槽上方，用以防止試驗(yàn)魚跳出死亡)。試驗(yàn)期間保持每日換水，低鹽度海水由砂濾海水(鹽度32)和曝氣后的自來水(鹽度0)兌制而成。換水前24 h將水調(diào)至試驗(yàn)所需鹽度并充氣。

慢性鹽度馴化試驗(yàn)階段每天8:00進(jìn)行配合飼料投喂，投喂后1.5 h將殘餌及糞便吸出。試驗(yàn)期間水溫控制在約24 ℃，24 h連續(xù)充氣，每隔2 h進(jìn)行鹽度監(jiān)測(cè)。

1.4 血清制備方法和滲透壓測(cè)定

用1 mL注射器自尾靜脈取血，將抽出的血液分為兩份靜置5 h，取血清即待血液凝固后3200 r/min離心10 min，分離上清液。采取冰點(diǎn)下降法，50 μL血清用冰點(diǎn)滲透壓計(jì)對(duì)試驗(yàn)魚血清滲透壓進(jìn)行測(cè)定(單位mOsm/kg)。

將剩余制得血清當(dāng)天送至大連市體檢中心，采用邁瑞B(yǎng)S-400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、尿素、總蛋白、血糖、白蛋白、白球比等指標(biāo)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel計(jì)算許氏平鲉的半致死鹽度及安全鹽度，滲透壓結(jié)果用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析，以α=0.05作為顯著差異水平。

所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)平行試驗(yàn)組數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan多重比較進(jìn)行組間差異比較，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 許氏平鲉在急性鹽度馴化中的半致死鹽度

許氏平鲉在4～30的鹽度內(nèi)生存良好，當(dāng)鹽度降至3(包括3)以下時(shí)才出現(xiàn)死亡，在鹽度為0的條件下，6 h內(nèi)試驗(yàn)魚全部死亡。當(dāng)鹽度為2和3時(shí)試驗(yàn)魚在48 h內(nèi)全部死亡。96 h內(nèi)不同時(shí)間的半致死鹽度見表1，48 h與72 h的半致死鹽度一致，根據(jù)24 h和48 h的半致死鹽度可以計(jì)算出許氏平鲉的安全鹽度，為0.04。

2.2 鹽度馴化許氏平鲉體內(nèi)滲透壓變化

隨著鹽度不斷的降低，許氏平鲉體內(nèi)滲透壓出現(xiàn)了2個(gè)峰值，分別是鹽度9和鹽度18的條件下，滲透壓分別為(366±48.5) mOsm/kg、(366±48.38) mOsm/kg，峰值也極為接近，低谷出現(xiàn)在鹽度3、鹽度12和鹽度21的條件下，但是鹽度3以下滲透壓變化劇烈出現(xiàn)最低值，滲透壓為(173.3±4.51) mOsm/kg，明顯下降。在鹽度24～32條件下，試驗(yàn)魚體內(nèi)滲透壓比較平穩(wěn)，無明顯差異(圖1)。

表1 96 h內(nèi)不同時(shí)間的半致死鹽度Tab.1 Median-lethal salinity at different times within 96 h

圖1 不同鹽度馴化下許氏平鲉滲透壓的變化規(guī)律Fig.1 Variations in osmotic pressure in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii under different salinity acclimation

2.3 慢性鹽度馴化對(duì)許氏平鲉血清生化指標(biāo)的影響

2.3.1 谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶活性的變化規(guī)律

谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶活性的試驗(yàn)結(jié)果見圖2。許氏平鲉在鹽度降至24時(shí)谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶均呈現(xiàn)高值，其活性分別為(68.67±3.51)、(18.67±3.06) U/L和(726±27) U/L。谷草轉(zhuǎn)氨酶在鹽度降至21以下時(shí)，活性一直較低，海水對(duì)照組(鹽度32)谷草轉(zhuǎn)氨酶活性與鹽度30、24組差異不顯著(P>0.05)，但與其余鹽度組差異顯著(P<0.05)。隨著鹽度的改變，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性呈上下波動(dòng)的現(xiàn)象，鹽度27、24、21、15組與海水對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。乳酸脫氫酶活性隨著鹽度的降低呈先降后升再降再升的變化趨勢(shì)。鹽度27、24、15、9組的乳酸脫氫酶活性和海水對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。

圖2 鹽度變化對(duì)許氏平鲉血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、 乳酸脫氫酶活性的影響Fig.2 Effects of salinity on activities of glutamic-oxaloacetic transminase (GOT), glutamic-pyruvic transaminase (GPT) and lactic acid dehydrogenase in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.2 尿素的變化規(guī)律

尿素濃度隨著鹽度的不斷降低而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，各個(gè)鹽度組和海水對(duì)照組差異顯著(P<0.05)(圖3)。在鹽度為9時(shí)達(dá)到最低值，為(0.68±0.06) mmol/L。

圖3 鹽度變化對(duì)許氏平鲉血清尿素濃度的影響Fig.3 Effects of salinity change on serum urea (UREA) concentrations in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.3 總蛋白和白蛋白的變化規(guī)律

總蛋白和白蛋白質(zhì)量濃度隨著鹽度的降低，上下波動(dòng)的幅度不大(圖4)?？偟鞍踪|(zhì)量濃度在鹽度為21時(shí)達(dá)到最低值，與海水對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。而白蛋白質(zhì)量濃度在鹽度為24時(shí)達(dá)到最低值，并與海水對(duì)照組有顯著差異(P<0.05)。

圖4 鹽度變化對(duì)許氏平鲉血清總蛋白和白蛋白質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effects of salinity on serum total protein and albumin concentrations in Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.4 血糖的變化規(guī)律

許氏平鲉的血糖濃度在鹽度降到24時(shí)呈現(xiàn)峰值(圖5)，為(6.04±0.16) mmol/L，與其余各鹽度組差異顯著(P<0.05)。血糖濃度在鹽度為21時(shí)出現(xiàn)最低值，和海水對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，但是總體上隨鹽度降低而呈升高的趨勢(shì)。

圖5 鹽度變化對(duì)許氏平鲉血液中血糖濃度的影響Fig.5 Effects of salinity change on the level of plasma glucose in the blood of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

2.3.5 白球比的變化規(guī)律

各鹽度組的白球比隨著鹽度的降低上下波動(dòng)不大，各組和對(duì)照組比較均無顯著差異(P>0.05)(圖6)。

圖6 鹽度變化對(duì)許氏平鲉血液中白球比的影響Fig.6 Effects of salinity change on the ratio of A/G in the blood of Schlegel′s black rockfish S. schlegelii

3 討 論

3.1 比較急性鹽度馴化和慢性鹽度馴化

急性鹽度馴化條件下，許氏平鲉在鹽度4、5、10、15、20、25、30時(shí)96 h內(nèi)均可以存活；慢性鹽度馴化條件下，當(dāng)鹽度繼續(xù)降低到3時(shí)，出現(xiàn)多種不適應(yīng)狀態(tài)。當(dāng)鹽度超出許氏平鲉調(diào)節(jié)范圍時(shí)就會(huì)死亡。對(duì)咸?？ɡ佐~(Chalcalburnuschalcoidesaralensis)[28]的試驗(yàn)結(jié)果表明，咸海卡拉白魚在鹽度為9.38的水中60 d存活率為87.5%，鹽度低于11.32的試驗(yàn)組30 d存活率為100%，60 d為75%，而在鹽度為13.62的水體中，24 h內(nèi)魚體全部死亡，鹽度高于15，12 h死亡率高達(dá)100%。咸?？ɡ佐~屬鯉科，為淡水魚，對(duì)于鹽度變化非常敏感，自身滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制無法滿足其在高鹽度水體中正常生活。沈雙燁等[29]對(duì)鯉魚(Cyprinuscarpio)鹽度馴化的試驗(yàn)結(jié)果顯示，鹽度0～12時(shí)，魚體生存良好，3 h內(nèi)鹽度到14時(shí)開始出現(xiàn)死亡，說明鯉魚作為淡水魚對(duì)高鹽度水體敏感，而對(duì)低鹽度水體耐受。胡發(fā)文等[30]對(duì)大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)的研究表明，大瀧六線魚幼魚在低鹽度水體中出現(xiàn)明顯的不適反應(yīng)并死亡，在鹽度為30時(shí)，存活率最高。王曉雯等[31]對(duì)雜交鱘(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)幼魚的研究亦顯示，鹽度變化會(huì)引起魚體反應(yīng)。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果均說明，水體的鹽度變化對(duì)魚體的存活與生長(zhǎng)影響顯著。

3.2 許氏平鲉鹽度馴化滲透壓的變化

魚類對(duì)鹽度的適應(yīng)主要分為被動(dòng)的環(huán)境適應(yīng)和主動(dòng)的調(diào)節(jié)恢復(fù)兩個(gè)階段。在鹽度逐漸降低的條件下，試驗(yàn)魚體內(nèi)滲透壓先應(yīng)激降低適應(yīng)環(huán)境，但鹽度繼續(xù)降至18時(shí)，魚體內(nèi)滲透壓升高，進(jìn)行主動(dòng)調(diào)節(jié)適應(yīng)以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本試驗(yàn)雖未測(cè)定Na+/K+-ATP酶離子轉(zhuǎn)移酶活性，但是得到了與對(duì)日本鰻鱺(Anguillajaponica)[32]以及對(duì)花鱸(Lateolabraxmaculatus)[33]滲透壓變化相一致的數(shù)據(jù)趨勢(shì)，這表明許氏平鲉在鹽度變化條件下體內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制可能與上述研究對(duì)象相似。也顯示出許氏平鲉具有一定的滲透壓調(diào)節(jié)能力。

3.3 許氏平鲉鹽度馴化各生化指標(biāo)的變化

魚類血清生化指標(biāo)可以作為生物監(jiān)測(cè)和環(huán)境毒理學(xué)的參考標(biāo)志物。指標(biāo)觀測(cè)值的變化反映了魚類對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)程度。因此，評(píng)價(jià)魚類健康和環(huán)境監(jiān)測(cè)方面魚類血液生化指標(biāo)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[34]。

一般在水生動(dòng)物體內(nèi)正常生理狀態(tài)下谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性處于較低水平，當(dāng)機(jī)體受脅迫時(shí)從肝細(xì)胞釋放到血液中，常作為環(huán)境脅迫特別是毒性試驗(yàn)的檢測(cè)指標(biāo)[35]，可用于指示水生生物健康及脅迫程度[36]。本試驗(yàn)中，鹽度21時(shí)許氏平鲉血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量最低，說明這個(gè)鹽度下魚體內(nèi)肝細(xì)胞的細(xì)胞通透性不強(qiáng)，細(xì)胞損傷不大，而在鹽度15、24、30、32下生長(zhǎng)的許氏平鲉，魚體內(nèi)細(xì)胞損傷強(qiáng)度明顯處于最高峰。這些說明慢性鹽度馴化過程對(duì)許氏平鲉的脅迫比較大，這可能是一種適應(yīng)性生理性的變化；另外，據(jù)王曉杰等[6]研究結(jié)果，不排除內(nèi)臟組織已經(jīng)出現(xiàn)病變的可能。

乳酸脫氫酶是糖酵解酶，可催化乳酸脫氫生成丙酮酸。而乳酸是作為魚類對(duì)外界脅迫的應(yīng)激反應(yīng)的間接指標(biāo)。有研究指出，環(huán)境脅迫引起魚類的初級(jí)反應(yīng)為內(nèi)分泌變化，如兒茶酚胺和皮質(zhì)類固醇的升高，隨之刺激血液中葡萄糖和乳酸的增加[37]。本試驗(yàn)雖未檢測(cè)血清中乳酸的含量，但可以通過乳酸脫氫酶的變化規(guī)律來推測(cè)血清中乳酸的變化規(guī)律。本試驗(yàn)中，許氏平鲉的乳酸脫氫酶隨著鹽度的變化呈現(xiàn)先降后升再降的變化趨勢(shì)，因此，可以推測(cè)出許氏平鲉血清中乳酸亦是以這個(gè)趨勢(shì)顯著發(fā)生變化的(P<0.05)，在鹽度24的時(shí)候出現(xiàn)高值，可能說明，在鹽度24～32內(nèi)許氏平鲉乳酸隨著鹽度的持續(xù)升高而降低。

魚類屬于排氨動(dòng)物，尿素是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物。馮廣朋等[36]通過研究溫度對(duì)中華鱘代謝酶等的影響中指出尿素的指標(biāo)常被用來評(píng)估腎臟和鰓的功能。有研究顯示，在饑餓狀態(tài)下的不同魚類尿素的排放規(guī)律不一致，呈現(xiàn)下降或上升的趨勢(shì)[38-39]。在本試驗(yàn)中，隨鹽度的降低許氏平鲉尿素濃度呈下降趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果與江麗華等[40]對(duì)褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)的研究結(jié)果相似，由于魚的種類不同，尿素的排放規(guī)律也不同。

研究顯示，血糖和總蛋白水平受蛋白質(zhì)分解代謝和肝糖原分解的影響[41-42]，當(dāng)生物體處于慢性鹽度馴化時(shí)，糖類首先迅速被用于供能，碳水化合物以單糖形式進(jìn)入血液，從而使血糖濃度升高[40]。除了受胰島素和腎上腺素控制外，血糖還受機(jī)體的多種方式調(diào)節(jié)，因而在機(jī)體中血糖總量處于動(dòng)態(tài)平衡中，但也極易受其他脅迫因子的影響[43-45]，比如水環(huán)境、饑餓等。李懋等[46]認(rèn)為，魚在受傷或饑餓狀態(tài)時(shí)血糖水平會(huì)降低。本試驗(yàn)中，許氏平鲉在慢性鹽度脅迫下血糖水平與鹽度呈負(fù)相關(guān)。因此，可能是由于鹽度變化后組織對(duì)葡萄糖的利用率降低，導(dǎo)致血糖濃度升高，也可能是滲透機(jī)制調(diào)節(jié)中的高能量需求而使組織糖原異生作用增強(qiáng)，導(dǎo)致血糖濃度升高[47]；在鹽度9～21內(nèi)，可能推測(cè)許氏平鲉在這個(gè)鹽度環(huán)境下，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度升高，導(dǎo)致血液中血糖濃度降低；在高鹽度環(huán)境如鹽度27～32下血糖濃度的降低可能是由于鹽度的突變對(duì)許氏平鲉刺激性加強(qiáng)，而魚類機(jī)體主要是通過自身血糖代謝和無氧代謝所產(chǎn)生的糖質(zhì)來提供所需能量[48]，故而大量消耗體內(nèi)葡萄糖。

另有研究指出，白球比與血漿膠體滲透壓相關(guān)，且白球比與血漿膠體滲透壓成正相關(guān)[49]。在本試驗(yàn)中，許氏平鲉的白球比均呈現(xiàn)上下略微波動(dòng)的現(xiàn)象。說明很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)血清的白球比在受鹽度脅迫后都是相對(duì)穩(wěn)定的。