用于酵母細胞電阻抗檢測的集成微電極陣列微流控芯片的有限元仿真研究*

張 釗耿楊燁朱 真

(東南大學電子科學與工程學院，江蘇南京 210096)

近年來，隨著多學科交叉的深入發(fā)展及微納加工技術的進步，微流控技術在生命科學、醫(yī)學檢測領域得到廣泛應用[1-3]。由于微流控芯片具有小型化的特點，特征尺寸與細胞尺度相近、成本低、結(jié)構(gòu)設計靈活且易于與其他檢測分析手段集成，因此被廣泛用于單細胞分析[4-6]。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，也稱為出芽酵母，作為一種重要的模式生物，在現(xiàn)代生物學研究中具有重要意義。而微流控芯片則為酵母單細胞分析提供了便捷又精準的研究平臺。

目前，微流控芯片中酵母細胞的監(jiān)測方法主要是光學顯微成像技術[7-9]。通過高分辨顯微鏡能夠獲得出芽酵母單細胞的形態(tài)、尺寸、生長速率、子細胞剪切等信息。利用熒光蛋白標記亞細胞結(jié)構(gòu)(液泡、細胞核、線粒體等)，還能獲得酵母細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化[9]。然而，高分辨率時序顯微成像技術的通常需要熒光標記，對細胞的正常生理過程存在一定的影響；此外，大批量的圖像處理耗時耗力[10]。

相比于顯微成像技術，電阻抗譜(Electrical impedance spectroscopy，EIS)具有非侵入性、無需熒光標記、快速檢測、多參數(shù)讀取等特點[11-13]。電阻抗譜檢測功能可通過微電極集成在微流控芯片中，通過檢測單細胞的介電特性表征細胞尺寸、生長狀態(tài)等。例如，Haandbaek 等[14]在微流控芯片中集成微電極，并根據(jù)電阻抗信號對流經(jīng)微流體通道的酵母細胞的出芽狀態(tài)進行區(qū)分。Zhu 等[15]提出一種可以捕獲酵母單細胞的微流控芯片，并通過電阻抗對單個出芽酵母的生長及運動進行監(jiān)測、區(qū)分。然而，現(xiàn)有的研究成果還無法實現(xiàn)對出芽酵母的高通量、長時間的EIS 監(jiān)測。因此，用于出芽酵母長時間培養(yǎng)、原位時序電阻抗監(jiān)測的高通量微流控芯片尚待研究。

本研究提出一種集成高通量酵母單細胞捕獲結(jié)構(gòu)及微電極陣列的微流控芯片，建立微流控芯片及酵母細胞的三維有限元模型，分析模型內(nèi)電流分布情況以及不同行列間距下鄰近細胞對于待測細胞EIS 信號的影響?？紤]到陣列集成度及檢測靈敏度的需求，根據(jù)仿真分析結(jié)果探索微電極陣列的最優(yōu)行列間距，對基于電阻抗譜的微流控酵母檢測芯片的設計優(yōu)化具有重要意義。

1 原理和方法

1.1 微流控芯片的結(jié)構(gòu)及工作原理

如圖1(a)所示，微流控芯片由玻璃襯底、鉻-金微電極陣列、氮化硅絕緣層、SU-8 光刻膠捕獲-剪切結(jié)構(gòu)等組成。微電極陣列是酵母細胞EIS 檢測的核心結(jié)構(gòu)。如圖1(b)、圖1(b)所示，微電極陣列由列電極(紅色部分)和行電極(藍色部分)交叉排列而成，SU-8 捕獲-剪切結(jié)構(gòu)則分布于每個行列電極交叉處。所有行列電極寬度均為10 μm。列電極與行電極表面有一層氮化硅絕緣層，在捕獲-剪切結(jié)構(gòu)上下游分別形成長為15 μm，寬為8 μm 的圓角矩形開孔，用于對出芽酵母的電阻抗檢測。氮化硅絕緣層能夠有效避免微電極陣列間的電流串擾，提高電阻抗檢測的靈敏度。每個捕獲-剪切結(jié)構(gòu)以及與之對應的絕緣層開孔處的微電極對即為一個酵母細胞的捕獲檢測單元。相鄰捕獲檢測單元的列間距設為Δx、行間距設為Δy。如圖1(b)、圖1(c)所示，捕獲-剪切結(jié)構(gòu)由2 根對稱的SU-8 微柱組成，微柱高為8.3 μm，2 根微柱的下游開孔寬度為3 μm，與上下游氮化硅開孔距離均為6 μm。圖1(c)為捕獲檢測單元沿AA′的截面示意圖，行列電極的厚度均為0.2 μm，氮化硅層的總厚度為1 μm。具體地，列電極位于玻璃襯底表面，行電極位于厚度為0.5 μm 的第一層氮化硅上表面。

圖1 微流控芯片幾何結(jié)構(gòu)圖

如圖1(b)所示，出芽酵母細胞以出芽方式進行增殖。母細胞被流體動力固定在捕獲-剪切結(jié)構(gòu)中，子細胞在下游開孔外出芽生長，并最終被流體剪切去除。SU-8 捕獲-剪切結(jié)構(gòu)、被捕獲的出芽酵母細胞以及周圍的培養(yǎng)液構(gòu)成一個等效電路系統(tǒng)，酵母細胞的生長以及子細胞的剪切均會改變系統(tǒng)的電阻抗。通過捕獲檢測單元上下游的微電極對可以實現(xiàn)對系統(tǒng)電阻抗的檢測，其原理是對上游激勵電極施加幅值固定的交流電壓并記錄下游響應電極的電流響應，基于歐姆定律計算出系統(tǒng)的電阻抗[16]。幅值、頻率一定的激勵信號記為，響應電流記為，則該系統(tǒng)的復阻抗為:

對捕獲檢測單元中的出芽酵母進行電阻抗檢測時，施加激勵信號至與之對應的列電極，并檢測相應行電極的響應電流信號。按照行列尋址的方式選擇不同的行列電極組合，能夠?qū)崿F(xiàn)陣列中所有出芽酵母的電阻抗檢測。根據(jù)式(1)，在激勵信號不變的情況下，響應電流的變化能夠反映系統(tǒng)復阻抗的變化，進而揭示待測出芽酵母的相關信息，如細胞的尺寸變化、子細胞的剪切等。

1.2 細胞等效模型

出芽酵母細胞具有細胞質(zhì)、細胞膜、內(nèi)層細胞壁、外層細胞壁等多層結(jié)構(gòu)，相應結(jié)構(gòu)的幾何及材料參數(shù)如表1 所示。

表1 出芽酵母細胞多層結(jié)構(gòu)的幾何及材料參數(shù)[17]

材料的復介電常數(shù)和介電常數(shù)、電導率的關系如下:

由于用于電阻抗檢測的微電極厚度為0.2 μm，遠大于細胞膜的厚度(8 nm)，直接使用4 層結(jié)構(gòu)的出芽酵母細胞建模時模型中不同結(jié)構(gòu)的尺寸相差過大，會造成網(wǎng)格剖分困難并生成低質(zhì)單元。基于麥克斯韋混合場理論的均質(zhì)等效模型被廣泛用于模擬多層結(jié)構(gòu)球形細胞的介電性質(zhì)[18]。應用麥克斯韋混合場理論可將具有細胞膜和細胞質(zhì)的兩層細胞模型等效為一個均質(zhì)球，其復介電常數(shù)為:

如圖2 所示，根據(jù)式(3)，由內(nèi)而外逐層進行3次等效，將多層出芽酵母細胞簡化成具有等效復介電常數(shù)的均質(zhì)球模型，并根據(jù)式(2)計算出等效細胞模型的相對介電常數(shù)和電導率，作為有限元模型中細胞的材料參數(shù)。

圖2 出芽酵母細胞多層結(jié)構(gòu)的均質(zhì)等效

1.3 有限元模型

考慮到本研究中電極陣列的排布具有周期性以及良好的對稱性，根據(jù)圖1 所示的微流控芯片結(jié)構(gòu)，以2×2、3×3 2 組捕獲檢測陣列為代表，在COMSOL Multiphysics 軟件中建立對應的三維模型進行有限元仿真研究。模型中捕獲檢測單元的列間距、行間距分別設為全局參數(shù)Δx、Δy，便于進行行列間距的參數(shù)化掃描。模型中其他結(jié)構(gòu)尺寸參照1.1 節(jié)設置。

前期研究結(jié)果表明，1 MHz 頻率下的電阻抗幅值信號能夠較好地反映細胞幾何尺寸的變化[19]。因此，我們利用1.2 節(jié)的等效模型理論計算1 MHz頻率下母細胞和子細胞的等效材料參數(shù)，即相對介電常數(shù)與電導率。有限元模型中其他各結(jié)構(gòu)的材料參數(shù)如表2 所示。

表2 仿真模型結(jié)構(gòu)的材料參數(shù)

應用AC/DC 模塊的電流物理場對有限元模型進行仿真。仿真模型基于歐姆定律求解電流守恒方程:

式中:σ為電導率，ε0、εr分別為真空介電常數(shù)、相對介電常數(shù)，?U是電勢差。

模型的外部邊界條件設為電絕緣，內(nèi)部不同域的交界面設置為電流連續(xù)條件，所有域的電勢初始值設為0 V。列電極從左到右依次記為S1、S2、S3電極，行電極從上至下依次記為R1、R2、R3電極。仿真中，待測捕獲檢測單元對應的列電極為激勵電極，設置其終端電壓為幅值1 V，頻率1 MHz 的交流電壓；對應的行電極為響應電極。非檢測電極設置為初始值為0 V 的懸浮電位或接地。基于電流守恒方程對模型進行有限元求解，并通過全局計算得出待測出芽酵母細胞對應的響應電流。

1.4 仿真計算

本研究中，以待測母細胞的子細胞剪切造成的響應電流相對變化量作為判斷電阻抗檢測靈敏度優(yōu)劣的指標。非檢測電極不同的設置對待測細胞的檢測靈敏度有較大影響，因此需要分別對其設置成懸浮電位和接地進行仿真計算，從而指導后續(xù)研究。待測細胞對應的響應電流會受到其鄰近捕獲檢測單元中細胞的影響，其中以是否存在鄰近細胞的影響最為顯著。因此，在芯片設計時，需選擇合適的行列間距以確保鄰近細胞的存在與否對待測響應電流的影響遠小于目標檢測單元中酵母子細胞剪切產(chǎn)生的信號變化，進而通過測得的EIS 信號準確反映子細胞的剪切事件。

為方便表示，將第x行第y列被捕獲的出芽酵母細胞記為Cxy。對出芽酵母細胞Cxy進行EIS 檢測時，設置Sx為激勵電極，Ry為響應電極。進行有限元仿真求解后，計算Ry的響應電流幅值Iy。為便于分析，對仿真結(jié)果數(shù)據(jù)作以下處理:定義待測出芽酵母Cxy被捕獲與未被捕獲時響應電流幅值Iy的比值為相對幅值Ar。待測出芽酵母細胞的子細胞剪切以及鄰近細胞的有無使得相對幅值Ar產(chǎn)生的變化量的絕對值記為ΔAr。

首先仿真分析非檢測電極設置懸浮和接地的C11子細胞剪切的檢測靈敏度。在陣列大小為2×2的模型中，所有捕獲檢測單元設有母細胞，設置S1電極為激勵電極，R1電極為響應電極。分別將非檢測電極設置成懸浮和接地，對行間距和列間距為50 μm、75 μm、100 μm、125 μm、150 μm、175 μm、200 μm、225 μm、250 μm、275 μm、300 μm 的全部組合進行參數(shù)化掃描求解?；诿恳粋€參數(shù)化解計算ΔAr，分別繪制其關于行列間距的三維柱狀圖，并對比分析。此外，繪制培養(yǎng)液中電流密度模的體箭頭圖，分析響應電流I1的組成及分布情況?；诿恳粋€參數(shù)化解，繪制響應電流I1關于行列間距的三維柱狀圖，分析行列間距變化對I1的影響。

進一步研究不同行列間距組合中，單個鄰近細胞存在與否造成的ΔAr，并將其與C11子細胞剪切造成的ΔAr作對比，確定較小的行列間距使鄰近細胞存在與否造成的ΔAr相對于C11子細胞剪切造成的ΔAr達到最低。在陣列大小為3×3 的模型中，被捕獲的母細胞C11為目標細胞，設置S1電極為激勵電極，R1電極為響應電極。對行間距和列間距為50 μm、75 μm、100 μm、125 μm、150 μm、175 μm、200 μm、225 μm、250 μm、275 μm、300 μm 的全部組合進行參數(shù)化掃描求解，分別研究母細胞C12、C13、C21、C31、C22存在與否以及C11子細胞剪切對響應電流I1的影響。基于每一個參數(shù)化解計算ΔAr，分別繪制ΔAr關于行列間距的三維柱狀圖進行比較。

2 仿真結(jié)果與討論

2.1 非檢測電極設置懸浮和接地的EIS 檢測靈敏度比較

圖3 非檢測電極的不同設置對C11子細胞剪切的影響

如圖3(a)、圖3(b)所示，非檢測電極設置成懸浮和接地時，C11子細胞剪切造成的ΔAr隨行列間距變化的趨勢相似，整體上隨著行列間距增大而逐漸增大。非檢測電極接地時，C11子細胞剪切產(chǎn)生的ΔAr更大，其EIS 檢測靈敏度更高。因此，后續(xù)的仿真實驗中非檢測電極均設置為接地。

2.2 響應電流的組成及分布

如圖4(a)、圖4(b)所示，響應電極R1記錄的響應電流I1由4 部分構(gòu)成，依次記為Ia、Ib、Ic、Id。其中，只有部分Ia流經(jīng)C11所在的捕獲檢測單元，因此只有Ia反映母細胞C11的幾何尺寸信息。響應電流I1中Ia所占的比重越大，對于母細胞C11的檢測靈敏度越高。Ib流經(jīng)C12所在的捕獲檢測單元，因此C12細胞存在與否主要影響Ib，進而對響應電流I1造成影響。C12細胞的存在使其所在捕獲檢測單元處的電阻抗提高，Ib減小，因此響應電流I1減小。C21細胞存在時其所在捕獲檢測單元處的電阻抗提高，造成Ic、Id增大，因此響應電流I1增大。

圖4 響應電流的分布及組成

如圖5 所示，總體上，響應電流I1隨著行列間距的增大而減小。在行列間距為200 μm～300 μm時，響應電流I1幾乎不隨行列間距的變化而變化。這是由于此時行列間距已經(jīng)足夠大，Ib、Ic、Id較小，響應電流I1主要由Ia組成，此時對酵母細胞C11的EIS 檢測靈敏度較高。

圖5 響應電流的幅值變化圖

2.3 鄰近細胞對響應電流的影響

非檢測電極設為接地，仿真研究不同行列間距組合中單個鄰近細胞存在與否以及待測子細胞剪切造成的ΔAr。圖6(a)～圖6(e)分別反映了待測細胞C11的鄰近細胞C12、C13、C21、C31、C22存在時響應電流相對幅值ΔAr隨行列間距的變化。如圖6(a)、圖6(b)所示，總體上來看，隨著列間距的增大，C12細胞的存在造成了ΔAr顯著減小。由于C12細胞主要影響Ib，當行列間距均在100 μm 以下時，Ib在I1中所占比重較小，Ib的變化并未引起響應電流的顯著變化，因此ΔAr較小。隨著行間距的增大，Ic、Id逐漸減小，響應電流中Ib所占比重逐漸增大，因此ΔAr逐漸增大。C13細胞的存在引起ΔAr的變化相對于C12細胞的存在小一個數(shù)量級，因此其影響可以忽略。如圖6(c)、圖6(d)所示，隨著行間距的增大，C21細胞的存在引起ΔAr顯著減小。這是由于C21主要影響Ic、Id，隨著行間距的增大，Ic、Id逐漸減小，因此ΔAr也逐漸越小。C31細胞的存在引起ΔAr的變化相對于C21細胞的存在小一個數(shù)量級，因此其影響也可忽略。如圖6(e)所示，C22細胞的存在引起ΔAr的變化比C12、C21細胞的存在小1 到2 個數(shù)量級，其影響忽略。待測細胞C11的子細胞剪切引起ΔAr的變化如圖6(f)所示。總體上，隨著行列間距的增大，C11子細胞剪切的檢測靈敏度逐漸增大。

圖6 鄰近細胞的存在及待測細胞子細胞剪切對待測響應電流的影響

由以上分析可知，與待測細胞同行或同列的鄰近細胞對響應電流的影響隨著列間距或行間距的增加而顯著下降，并且最鄰近的細胞對響應電流的影響要遠大于較遠處的細胞。與待測細胞不同行不同列的細胞對響應電流的影響可忽略。因此在確定合適的行列間距時只考慮C12、C21細胞的存在對ΔAr的影響，分別將其與C11的子細胞剪切造成的ΔAr比較。行列間距越大，鄰近細胞對于響應電流的影響越小，目標細胞的檢測靈敏度越高。然而捕獲檢測單元的行列間距過大會降低酵母單細胞的捕獲效率以及芯片的集成度。因此，綜合考慮檢測靈敏度以及芯片集成度，選擇列間距為100 μm、行間距為125 μm 作為捕獲檢測陣列的設計參數(shù)。此行列間距下，C12、C21細胞存在與否以及C11子細胞剪切造成的ΔAr分別為1.78×10-4、6.85×10-4、4.66×10-3。與C11子細胞剪切造成的EIS 信號變化(4.66×10-3)相比，鄰近細胞對于響應電流相對幅值的影響在其15%以下，因此預期可實現(xiàn)對待測出芽酵母子細胞剪切事件的準確檢測。

3 總結(jié)

在本研究中，我們提出了可用于出芽酵母細胞電阻抗檢測的集成微電極陣列微流控芯片的設計結(jié)構(gòu)，并建立了三維有限元模型，重點研究了微電極陣列的行列間距對細胞電阻抗檢測靈敏度的影響。通過有限元模型仿真計算中對捕獲檢測單元的行列間距進行了參數(shù)化掃描，分析了微電極陣列中待測響應電流的分布及組成，并研究了鄰近細胞對于待測響應電流的影響，確定了有效檢測待測出芽酵母子細胞剪切所需的最小行列間距組合。所提出的集成微電極陣列微流控芯片有望用于基于電阻抗譜技術的高通量酵母單細胞復制衰老及壽命檢測，建立的有限元模型及仿真分析結(jié)果為微流控芯片的設計及優(yōu)化改進提供了重要參考。