干細(xì)胞治療終末期肝病的臨床研究進(jìn)展

余瀅瀅，王福生，施 明

1 干細(xì)胞治療肝病概述

近年來，關(guān)于干細(xì)胞尤其是成體干細(xì)胞，在治療肝臟疾病的基礎(chǔ)研究和臨床研究方面都取得了重要進(jìn)展，為進(jìn)一步推進(jìn)臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前研究較多且相對(duì)成熟的是間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）。MSCs存在于多種組織及器官，例如臍帶組織、臍帶血、胎盤、外周血、脂肪組織、骨髓等，其中骨髓中含量最為豐富。MSCs由于其多能性和多向性等特征，可以作為種子細(xì)胞應(yīng)用于修復(fù)或替代受損及病變的多種組織器官，從而為目前一些無法有效治愈的重大疾病提供嶄新的治療手段，對(duì)再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)生重要的影響。此外，MSCs也可以釋放各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，這使其免疫調(diào)節(jié)功能越來越受到關(guān)注。因此，MSCs已成為治療炎癥性或自身免疫性疾病的重要細(xì)胞來源。除了MSCs以外，應(yīng)用經(jīng)粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF）動(dòng)員或未經(jīng)動(dòng)員的骨髓CD34+干細(xì)胞也是治療肝病常用的干細(xì)胞種類。

2 干細(xì)胞治療肝病的證據(jù)和機(jī)制

1999年P(guān)etersen等[1]在鼠肝內(nèi)發(fā)現(xiàn)由骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cells,BMSCs）或骨髓造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成的肝卵圓細(xì)胞甚至成熟的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞，首次描述了干細(xì)胞在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞這一現(xiàn)象。Theise等[2]在異性間骨髓移植或肝移植的受體中也發(fā)現(xiàn)了來源于供體的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。Alison等[3]在開展的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)移植了男性骨髓細(xì)胞的女性患者肝臟內(nèi)同樣出現(xiàn)了Y染色體陽(yáng)性的肝細(xì)胞。Korbling等[4]通過肝臟組織標(biāo)本活檢在移植了男性外周血干細(xì)胞的女性患者肝臟內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了來自男性供體的XY染色體陽(yáng)性的肝細(xì)胞。上述研究結(jié)果都證明骨髓和外周血干細(xì)胞在人體內(nèi)可以分化為肝細(xì)胞，但在當(dāng)時(shí)這些干細(xì)胞的起源及其產(chǎn)生肝細(xì)胞方式都尚未知曉。而之后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明骨髓細(xì)胞或骨髓來源的MSCs（bone marrow derived MSCs,BM-MSCs）對(duì)急性肝損傷的動(dòng)物肝臟有保護(hù)作用，能提高動(dòng)物的生存率[5]。于是人們逐漸認(rèn)識(shí)到，基于干細(xì)胞的多向分化和多能性，干細(xì)胞在肝病治療方面存在巨大潛力，并逐步開展了大量的小規(guī)模臨床研究。

以往認(rèn)為，干細(xì)胞治療是通過提供大量肝細(xì)胞樣細(xì)胞替代受損的肝細(xì)胞功能來改善肝功能和恢復(fù)肝臟正常結(jié)構(gòu)。但隨著對(duì)干細(xì)胞治療肝病機(jī)制的進(jìn)一步了解，目前認(rèn)為干細(xì)胞通過旁分泌機(jī)制改變組織微環(huán)境比向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化更重要[6]。例如，MSCs可以通過旁分泌功能發(fā)揮局部效應(yīng)，為肝臟提供營(yíng)養(yǎng)和有利于增生修復(fù)的環(huán)境，促進(jìn)受損肝臟增生及肝臟血管再生，抑制免疫細(xì)胞增殖及向肝臟遷移，調(diào)節(jié)肝臟及全身免疫炎癥反應(yīng)，從而減輕肝臟的損傷[7]。MSCs可以通過分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor β,TGF-β）、前列腺素 E2 等誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）的產(chǎn)生，抑制過度的炎癥反應(yīng)，減輕肝臟炎癥，改善肝臟微環(huán)境，抑制肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞再生；通過分泌IL-10和TNF-α抑制肝星狀細(xì)胞的活性，或通過Fas/FasL途徑促進(jìn)星狀細(xì)胞的凋亡，從而抑制肝纖維化的形成[8-9]。例如有臨床研究表明，應(yīng)用自體BM-MSCs治療HBV相關(guān)終末期肝病，患者肝功能明顯改善的同時(shí)，外周血中Treg、Th17細(xì)胞以及細(xì)胞因子TGF-β、IL-17、TNF-α、IL-6水平發(fā)生明顯改變，這一結(jié)果提示了MSCs具有調(diào)節(jié)免疫改善肝臟炎癥環(huán)境的能力[10]。此外，MSCs也可以通過釋放促細(xì)胞增生因子和基質(zhì)金屬蛋白酶-9刺激內(nèi)源性肝細(xì)胞再生[11-12]。而來源于MSCs分泌的外泌體內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和miRNA，可以通過抑制肝細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和膠原生成來改善肝纖維化，也可以通過抑制肝星狀細(xì)胞內(nèi)的某些特定的信號(hào)通路（如抑制Smo的表達(dá)來抑制Hh信號(hào)的激活）來抑制細(xì)胞的增殖和激活，從而減輕肝纖維化的形成[13]。MSCs還可以提高肝組織血紅素加氧酶-1（heme oxygenase,HO-1）的表達(dá)，通過HO-1的抗炎、抗凋亡作用，改善肝臟炎癥環(huán)境，減少肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)[14]。

3 干細(xì)胞治療肝病的臨床研究

目前，開展干細(xì)胞治療肝病臨床研究常用的干細(xì)胞為MSCs，以及經(jīng)G-CSF骨髓動(dòng)員后獲取的干細(xì)胞。MSCs主要為自體或異體BM-MSCs，以及臍帶來源的MSCs（umbilical cord-derived MSCs,UC-MSCs）。Mohamadnejad等[15]最早報(bào)道了關(guān)于MSCs治療病毒性肝炎導(dǎo)致的終末期肝病的臨床研究（見表1）。在該臨床試驗(yàn)中慢性HBV感染相關(guān)的失代償期肝硬化患者接受了自體BM-MSCs的治療，患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量明顯改善，終末期肝病模型（model of end-stage liver disease,MELD）評(píng)分下降。之后國(guó)內(nèi)外的一些臨床研究也發(fā)現(xiàn)BM-MSCs和UC-MSCs能夠短期內(nèi)改善終末期肝病患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量，降低肝硬化患者肝癌的發(fā)生率和病死率[16-19]（見表1～2）。針對(duì)慢性HCV感染相關(guān)的終末期肝病患者，MSCs治療能使Child-Pugh評(píng)分以及MELD評(píng)分明顯降低，臨床癥狀明顯改善；此外，研究發(fā)現(xiàn)MSCs輸注途徑和是否分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)治療效果無明顯影響[20-21]（見表1）。該結(jié)果可為干細(xì)胞輸注途徑和類型的選擇提供參考，但以上結(jié)論還需要更多的臨床研究支持。從骨髓獲取MSCs為有創(chuàng)操作，對(duì)于肝硬化患者，獲取自體BM-MSCs會(huì)增加額外的創(chuàng)傷，應(yīng)用受到了一定的限制。而應(yīng)用UC-MSCs對(duì)供者和受者無額外的有創(chuàng)操作，且來源廣泛，細(xì)胞質(zhì)量可控，倫理限制較少，故目前在臨床研究中應(yīng)用較為廣泛。

經(jīng)G-CSF骨髓動(dòng)員后獲取的CD34+BMSCs也是臨床研究常用的干細(xì)胞類型。研究人員通過G-CSF進(jìn)行骨髓動(dòng)員后獲取一定量外周血，再通過免疫磁珠分離等方法獲得適宜數(shù)量的CD34+BMSCs，后經(jīng)肝動(dòng)脈、脾靜脈或門靜脈等回輸入患者體內(nèi)，研究結(jié)果顯示患者耐受性良好，序貫器官衰竭估計(jì)（sequential organ failure assessment,SOFA）評(píng)分均明顯下降，血清ALB水平升高，血清TBIL和ALT水平下降，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（international standarization ratio,INR）恢復(fù)正常，臨床癥狀得到改善，并有效的延緩了肝性腦病、肝腎綜合征和敗血癥等終末期肝病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)展進(jìn)程，生存率明顯提高[22-26]（見表3）。另外，針對(duì)未經(jīng)動(dòng)員的BMSCs的安全性和有效性，國(guó)內(nèi)外也開展了相關(guān)臨床研究，結(jié)果顯示安全性良好，患者未出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，肝臟一過性彈性明顯增強(qiáng)，體積逐漸恢復(fù)，肝功能和臨床癥狀明顯改善[27-32]（見表4）。

針對(duì)酒精性肝硬化，有開展自體BM-MSCs治療的臨床研究，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1（transforming growth factor,TGF-1）、I型膠原蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）等肝纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)減少，肝功能明顯改善和Child-Pugh評(píng)分顯著降低，無明顯不良反應(yīng)；肝臟病理顯示：肝臟膠原的比例顯著下降，肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善[33-36]（見表1）。應(yīng)用G-SCF動(dòng)員的BM-MSCs治療，肝臟病理也顯示：肝損傷部位巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多，炎癥和再生途徑相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)[37]。應(yīng)用G-CSF動(dòng)員的BMSCs治療，患者耐受性較好，Child-Pugh評(píng)分、MELD評(píng)分以及SOFA評(píng)分均明顯下降，肝功能明顯改善，預(yù)后顯著改善[23-24，38-39]（見表4）。

隨著對(duì)干細(xì)胞治療機(jī)制的研究，干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能越來越受到關(guān)注，已成為治療炎癥性或自身免疫性疾病的重要依據(jù)。如經(jīng)G-CSF動(dòng)員獲得的CD34+BMSCs可以改善自身免疫性肝病患者肝功能，促進(jìn)ALB、INR、ALT和TBIL等指標(biāo)恢復(fù)正常[23，37]（見表3）。此外，Liang等[40]應(yīng)用UC-MSCs治療自身免疫性疾病[原發(fā)性干燥綜合征、原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis,PBC）、混合性結(jié)締組織病、系統(tǒng)性硬化征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等]導(dǎo)致的肝硬化，結(jié)果顯示安全性好，在隨訪的2年內(nèi)患者肝功能明顯改善（見表3）。有兩項(xiàng)分別應(yīng)用BM-MSCs和UC-MSCs治療PBC患者的研究結(jié)果顯示，患者生活質(zhì)量明顯改善，血清中ALT、AST、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyltransferase,γ-GT）和血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）的水平均明顯下降，外周血中CD4+CD25+Foxp3+T 細(xì)胞和IL-10水平均明顯上升[41-42]（見表1～2）。但Mohamadnejad等[15]通過肝動(dòng)脈回輸BM-MSCs分別治療了1例PBC和1例自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）導(dǎo)致的失代償期肝硬化，發(fā)現(xiàn)患者雖然肝功能有一定程度的改善，但是出現(xiàn)了腎衰竭和肝腎綜合征等并發(fā)癥（見表1）。該研究團(tuán)隊(duì)的另一項(xiàng)臨床研究通過外周靜脈輸注BMSCs治療4例自身免疫性肝病和2例PBC患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的臨床癥狀不僅沒有改善，而且出現(xiàn)了2例死亡事件[40]（見表3）。這一結(jié)局提示外周靜脈輸注BMSCs對(duì)自身免疫性肝病患者可能是不利的，因此，BMSCs治療AIH的有效性和安全性還須要進(jìn)行更大樣本量研究來評(píng)估。

表1 MSCs治療終末期肝病臨床研究方案及主要結(jié)果Table 1 Clinical study protocols and main results about MSCs in treatment of end-stage liver disease

表2 UC-MSCs治療終末期肝病臨床研究方案及主要結(jié)果Table 2 Clinical study protocols and main results about UC-MSCs in treatment of end-stage liver disease

表3 G-CSF動(dòng)員的BMSCs治療終末期肝病臨床研究方案及主要結(jié)果Table 3 Clinical study protocols and main results about BMSCs mobilized by G-CSF in treatment of end-stage liver disease

針對(duì)藥物、遺傳代謝性疾?。ɡ绺味?fàn)詈俗冃?、酪氨酸血癥等）、其他多因素合并以及不明原因?qū)е碌母嗡ソ?，干?xì)胞治療也取得了不錯(cuò)的成效。如應(yīng)用自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植、G-CSF動(dòng)員的骨髓CD34+干細(xì)胞或BM-MSCs等，通過肝動(dòng)脈或門靜脈回輸方式治療上述原因?qū)е碌母嗡ソ?，結(jié)果顯示安全性好，患者肝功能均明顯改善，Child-Pugh、MELD 評(píng)分明顯下降[24，28，30，33]（見表1～2，4）。

表4 未經(jīng)動(dòng)員的BMSCs治療終末期肝病臨床研究方案及主要結(jié)果Table 4 Clinical study protocols and main results about unmobilized BMSCs in treatment of end-stage liver disease

4 結(jié) 語(yǔ)

總之，干細(xì)胞治療終末期肝病的臨床研究取得了很大進(jìn)展，但目前的臨床研究還存在不足之處，例如：大部分是單中心、小樣本的臨床研究，且研究方案各異、評(píng)價(jià)指標(biāo)不一致等。同時(shí)，如何獲得穩(wěn)定、質(zhì)量可控、能夠滿足臨床需求的干細(xì)胞，怎樣確保干細(xì)胞制品的有效性和安全性，細(xì)胞治療的適應(yīng)證、禁忌證如何，如何有效評(píng)估其安全性和有效性，干細(xì)胞最佳類型、最小輸注數(shù)量和最佳輸注途徑、最佳治療時(shí)機(jī)等問題尚待解決。目前，我國(guó)已頒布了《干細(xì)胞臨床研究管理辦法（試行）》，干細(xì)胞臨床研究已實(shí)行臨床研究機(jī)構(gòu)備案和臨床研究項(xiàng)目備案的雙項(xiàng)備案制，在此制度的規(guī)范管理下，干細(xì)胞臨床研究將會(huì)得到不斷深入和有序的發(fā)展，干細(xì)胞治療終末期肝病的臨床應(yīng)用指日可待。