m6A RNA甲基化調(diào)控因子對(duì)甲狀腺癌進(jìn)展及預(yù)后的影響

黃甜甜,段碧晗,葉迎春,王碩,高凌

甲狀腺癌是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，也是人類最常見(jiàn)的腫瘤之一。在世界許多地區(qū)，特別是發(fā)達(dá)國(guó)家，甲狀腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。分化型甲狀腺癌在甲狀腺癌中占90%以上，包括甲狀腺乳頭狀癌和濾泡型甲狀腺癌。然而，甲狀腺癌通常是無(wú)癥狀的，芬蘭一項(xiàng)經(jīng)典研究發(fā)現(xiàn)，隱匿性甲狀腺癌的患病率高達(dá)30%[1]。因此，了解甲狀腺癌發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)早期診斷、準(zhǔn)確治療及改善預(yù)后都至關(guān)重要。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)是一種甲基化修飾，可發(fā)生在RNA腺嘌呤上，是大多數(shù)真核生物最普遍的mRNA修飾形式[2]。在人類及其他許多物種中，m6A在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞行為和生理狀態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用[3]。m6A甲基化是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過(guò)程，根據(jù)13個(gè)m6A甲基化調(diào)控因子的功能不同，可以將其分為三類[4-5]：“書(shū)寫(xiě)者”介導(dǎo)RNA的甲基化修飾過(guò)程，包括METTL3、METTL14、KIAA1429、WTAP、RBM15和ZC3H13；“擦除者”介導(dǎo)RNA的去甲基化過(guò)程，包括FTO和ALKBH5；“閱讀者”負(fù)責(zé)讀取RNA甲基化信息，參與下游RNA的翻譯和降解，包括YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和HNRNPC?！安脸摺敝坏腇TO與人類肥胖和心理發(fā)展有關(guān)，而ALKBH5已被證明以去甲基化依賴的方式影響小鼠的精子發(fā)生[6-7],這表明在各種生理過(guò)程中m6A扮演著重要的角色。

越來(lái)越多的研究表明，m6A在許多復(fù)雜的人類疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[8-9]。關(guān)于m6A與胃癌、肝癌、乳腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤疾病的關(guān)系已有較多報(bào)道[10-13]，而m6A在甲狀腺癌發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中的作用仍不十分清楚。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析了13個(gè)廣泛報(bào)道的m6A RNA甲基化調(diào)控因子在甲狀腺癌中的表達(dá)。此外，使用LASSO Cox回歸分析，篩選出3個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)控因子構(gòu)建LASSO風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，預(yù)測(cè)甲狀腺癌患者的生存和預(yù)后，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 從TCGA (https://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了甲狀腺癌組織510例和正常甲狀腺組織58例的RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及相應(yīng)甲狀腺癌患者臨床病理數(shù)據(jù)。在分析甲狀腺癌亞組的總體生存率和臨床病理因素時(shí)，排除了缺少年齡、性別、病理分級(jí)和隨訪數(shù)據(jù)的樣本，最終保留了501例甲狀腺癌樣本，其中甲狀腺癌患者中男314例，女187例；年齡≤60歲171例，>60歲330例；生存狀態(tài)：死亡182例，存活319例；臨床分級(jí)：1級(jí)36例，2級(jí)184例，3級(jí)281例；臨床分期：Ⅰ期79例，Ⅱ期152例，Ⅲ期205例，Ⅳ期65例；原發(fā)腫瘤：T139例，T2111例，T3215例，T4136例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移：M0451例，M150例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0153例，N1138例，N2104例，N3106例。

1.2 生物信息學(xué)分析方法 主要使用Active-Perl 5.24.3 Build 2404(https://www.perl.org)、Rv3.6.0 (https://www.r-project.org/)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換、統(tǒng)計(jì)分析和計(jì)算。使用R軟件包中的“pheatmap” 軟件包比較甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織中13個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)。使用“Consensus Cluster Plus” 軟件包通過(guò)一致性聚類分析方法將甲狀腺癌組織分為2個(gè)亞組，探究m6A RNA甲基化調(diào)控因子在甲狀腺癌中的作用。主成分分析“PCA”包檢測(cè)基于m6A相關(guān)基因表達(dá)的腫瘤分組的可行性。為了探討m6A RNA甲基化調(diào)控因子的預(yù)后價(jià)值，使用Lasso Cox回歸分析方法來(lái)確定與總生存率顯著相關(guān)的3個(gè)基因，并得到最終風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式。根據(jù)每位患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將其分為高危組和低危組，并使用R包中的“survival”“survminer”“pheatmap”軟件包比較2組總體生存率和臨床病理特征。使用2組間的ROC曲線來(lái)檢驗(yàn)生存模型的預(yù)測(cè)效率，并使用單因素和多因素Cox回歸分析方法確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)后價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 主要采用R軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較m6A RNA甲基化調(diào)控因子在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況。根據(jù)m6A RNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)情況將患者分為2個(gè)亞組后，采用卡方檢驗(yàn)比較聚類 1和聚類2的性別、年齡、WHO分期和病理分級(jí)。在總體生存分析中，采用Kaplan-Meier法檢測(cè)甲狀腺癌亞組間、高危組和低危組間的總體生存率。使用ROC曲線分析評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)5年生存率的預(yù)測(cè)效率。通過(guò)單因素和多因素Cox回歸分析確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)后價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 m6A RNA甲基化調(diào)控因子在甲狀腺癌中的表達(dá)情況 分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中501例甲狀腺癌樣本和58例正常甲狀腺組織樣本中13個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)情況。除YTHDF2外，12個(gè)調(diào)控因子均表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)(圖1A、B)。與正常組織比較，甲狀腺癌組織的METTL3、YTHDC2、WTAP、ALKBH5、YTHDF1、METTL14、YTHDC1、FTO、KIAA1429、ZC3H13、RBM15顯著下調(diào)(P<0.001)，HNRNPC顯著上調(diào)(P<0.001)。為進(jìn)一步了解13個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)控因子之間的關(guān)系，構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)圖來(lái)結(jié)果顯示，WTAP、HNRNPC和YTHDC1似乎處于中心位置，并與其他m6A RNA甲基化調(diào)控因子相互作用 (圖1C)。此外，大多數(shù)m6A RNA甲基化調(diào)控因子都顯示出正相關(guān)關(guān)系。其中，ZC3H13與KIAA1429、KIAA1429與METTL14、METTL14與YTHDC1等3對(duì)調(diào)控因子呈較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系(ρ=0.78)，只有HNRNPC和ALKBH5呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(ρ=-0.18)(圖1D)。

注：A.甲狀腺癌與正常甲狀腺組織中13個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)控因子的基因表達(dá)水平(藍(lán)色代表正常組織，粉紅色代表甲狀腺癌組織)。紅色越深表示基因表達(dá)上調(diào)越明顯，綠色越深代表基因表達(dá)下調(diào)越明顯；B.小提琴圖可視化m6A RNA甲基化調(diào)控因子在甲狀腺癌中的表達(dá)差異；C.PPI網(wǎng)絡(luò)圖評(píng)估m(xù)6A RNA甲基化調(diào)控因子之間的相互作用；D.Spearman相關(guān)分析每個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)控因子之間的關(guān)系

2.2 m6A RNA甲基化調(diào)控因子的一致性聚類分析 采用一致性聚類分析對(duì)501例甲狀腺癌組織進(jìn)行分組，分組標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)累積分布函數(shù)增長(zhǎng)率較慢；(2)聚類后各組樣本量足夠大；(3)組內(nèi)相關(guān)性高而組間相關(guān)性低。在TCGA數(shù)據(jù)集中，根據(jù)m6A RNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)相似性，最終將甲狀腺癌組織分為2個(gè)亞組(圖2A～C)。對(duì)甲狀腺癌2個(gè)亞組的主成分分析驗(yàn)證表明，總RNA在亞組中的表達(dá)具有特異性，即聚類1似乎有向中心聚集的趨勢(shì)，而聚類2則有向四周擴(kuò)散的趨勢(shì)(圖2D)，這說(shuō)明根據(jù)m6A RNA甲基化調(diào)控因子的一致性聚類分析可以將甲狀腺癌很好地區(qū)分為2個(gè)亞組。但2個(gè)亞組之間存在很多重疊的區(qū)域，這表明甲狀腺癌2個(gè)亞組之間具有一些共同點(diǎn)。

注：A.k = 2～9的一致性聚類累積分布函數(shù)；B.k =2～9時(shí)累積分布函數(shù)曲線下面積的相對(duì)變化；C.當(dāng)k = 2時(shí)，一致性聚類分析將TCGA甲狀腺癌數(shù)據(jù)分成2個(gè)不同的亞組；D.TCGA數(shù)據(jù)集總RNA表達(dá)譜的主成分分析，紅色代表聚類1，藍(lán)色代表聚類2

2.3 聚類結(jié)果與臨床轉(zhuǎn)歸及臨床病理特征的關(guān)系 進(jìn)一步分析甲狀腺癌患者的總體生存率及臨床病理特征發(fā)現(xiàn)，聚類1的總體生存率明顯高于聚類2(圖3A)。聚類1的4年生存率約為97%，聚類2約為87%。此外，在聚類1中HNRNPC明顯高表達(dá)，而ALKBH5的表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步說(shuō)明這兩種調(diào)控因子之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系。與聚類 1比較，聚類 2與男性、高臨床分期和高T狀態(tài)顯著相關(guān)(圖3B)?？偠灾?，聚類結(jié)果與甲狀腺癌患者的總體生存率及臨床腫瘤惡性程度密切相關(guān)。

注：A.聚類1總體生存率明顯高于聚類2(P<0.05)；B.聚類 1和聚類 2臨床病理特征比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與聚類1相比，aP<0.05，bP<0.01

注：A.TCGA數(shù)據(jù)集中與總體生存率相關(guān)的13個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)控因子的單變量Cox回歸分析，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)比、95%置信區(qū)間確定了3個(gè)基因(P<0.05,HR>1)；B、C.在TCGA數(shù)據(jù)集中選擇靶基因的過(guò)程；D.根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將甲狀腺癌患者分為高危組和低危組的總體生存曲線

2.5 甲狀腺癌危險(xiǎn)評(píng)分與預(yù)后及臨床病理特征的關(guān)系 ROC曲線結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)甲狀腺癌患者的5年生存率有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率(AUC=0.717)(圖5A)。為進(jìn)一步了解高危組與低危組甲狀腺癌患者3個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)情況及其臨床病理特征的關(guān)系，再對(duì)不同分組與臨床病理特征(性別、年齡、生存狀態(tài)、T狀態(tài))進(jìn)行相關(guān)性分析并繪制其m6A RNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)熱圖(圖5B)。結(jié)果顯示，與低危組比較，高危組RBM15、KIAA1429、FTO表達(dá)明顯增高，且高危組和低危組甲狀腺癌患者在T狀態(tài)之間存在顯著差異。

注：A.ROC曲線顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的5年生存率預(yù)測(cè)價(jià)值；B.熱圖顯示3種m6A RNA甲基化調(diào)控因子在甲狀腺癌患者高危組和低危組的表達(dá)水平以及臨床病理特征差異；與甲狀腺癌患者高危組相比，aP<0.05，bP<0.01

2.6 甲狀腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)分析 單因素Cox回歸分析顯示，年齡、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、分期、T狀態(tài)均與總體生存率相關(guān)。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，年齡和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以作為甲狀腺癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，即甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)隨著年齡和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的增加而增加，見(jiàn)圖6。

注：A.TCGA數(shù)據(jù)集中臨床病理因素和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者總體生存之間的單變量Cox回歸分析；B.TCGA數(shù)據(jù)集中臨床病理因素和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者總體生存之間的多變量Cox回歸分析

3 討 論

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，近40年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。超聲檢查的進(jìn)步可能是造成這種趨勢(shì)的原因[14]，然而，導(dǎo)致這一增長(zhǎng)的其他原因尚不清楚。雖然甲狀腺癌相對(duì)于其他惡性腫瘤具有較好的惰性和良好的長(zhǎng)期生存率，但甲狀腺癌可發(fā)生在任何年齡，通常對(duì)年輕人的影響更大[15]。m6A RNA甲基化調(diào)控因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且已被證實(shí)與多種癌癥密切相關(guān)，靶向m6A RNA甲基化的抗癌藥物在臨床的應(yīng)用前景非常廣闊[16]。因此，有必要探討m6A RNA甲基化調(diào)控因子與甲狀腺癌的關(guān)系或?qū)谞钕侔╊A(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

在本研究中，首先分析了m6A RNA甲基化調(diào)控因子在甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中的表達(dá)情況及其與不同臨床病理的關(guān)系。甲狀腺癌組織和正常組織中多達(dá)12個(gè)m6A RNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

急性髓系白血病患者中METTL3表達(dá)升高，并發(fā)揮致癌作用。METTL3通過(guò)增加cMYC、BCL-2和PTEN的翻譯，抑制細(xì)胞分化和凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。MELLT3還激活PI3K / AKT通路，控制細(xì)胞分化和自我更新[17]。肝細(xì)胞癌中METTL3表達(dá)升高，METTL3在體外可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和集落形成，在體內(nèi)可影響肝癌的成瘤性、生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移，且METTL3水平升高提示預(yù)后不良[16]。METTL3在卵巢癌中也高表達(dá)，且METTL3高表達(dá)與腫瘤分級(jí)、FIGO分期及總生存率顯著相關(guān)[18]。近期，有學(xué)者進(jìn)行了METTL3促進(jìn)甲狀腺癌進(jìn)展的相關(guān)研究[19]，研究表明，METTL3誘導(dǎo)TCF1 mRNA m6A甲基化，上調(diào)TCF1蛋白水平，TCF1通過(guò)激活Wnt通路進(jìn)一步刺激腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而加重甲狀腺癌的惡性進(jìn)展，提示METTL3是一種潛在的癌基因。然而，本研究顯示，METTL3在甲狀腺癌患者中的表達(dá)遠(yuǎn)低于正常組織，提示METTL3可能阻礙了甲狀腺癌的進(jìn)展。這表明METTL3在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用可能還需要更多的研究來(lái)證明。

在探索m6A RNA甲基化調(diào)控因子是否對(duì)甲狀腺癌有預(yù)后價(jià)值的過(guò)程中，進(jìn)行了Cox單變量分析和LASSO回歸分析，鑒定篩選出RBM15、KIAA1429和FTO等3個(gè)基因。研究發(fā)現(xiàn)，RBM15、KIAA1429和甲狀腺疾病的關(guān)系研究甚少，而FTO與甲狀腺癌密切相關(guān)。

RBM15對(duì)基因敲除模型小鼠中多種組織的發(fā)育至關(guān)重要，尤其對(duì)維持造血干細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)態(tài)和巨核細(xì)胞、B細(xì)胞的分化具有重要作用[20]。此外，RBM15參與了染色體易位t (1;22)，產(chǎn)生與急性巨核細(xì)胞白血病相關(guān)的RBM15-MKL1融合蛋白[21]。除參與急性巨核細(xì)胞白血病的發(fā)生外，RBM15還是X染色體沉默的重要因素，并已證實(shí)在乳腺組織中表達(dá)[22]。研究表明，雌激素可獨(dú)立增加RBM15的表達(dá)，并與乳腺疾病的發(fā)生有關(guān)。對(duì)于甲狀腺癌，女性的發(fā)病率高于男性，這是否與雌激素信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)還有待進(jìn)一步研究。

KIAA1429已被證實(shí)通過(guò)不同途徑影響多種癌癥，包括通過(guò)依賴于GATA3的m6A轉(zhuǎn)錄后修飾促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展，以及通過(guò)直接靶向c-jun mRNA調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖[23]。此外，一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌的研究表明，KIAA1429可通過(guò)調(diào)節(jié)CDK1表達(dá)而成為乳腺癌的致癌因子[24]。各種CKD抑制劑被廣泛應(yīng)用于臨床治療惡性腫瘤，包括甲狀腺癌[25]。因此，KIAA1429與甲狀腺癌的關(guān)聯(lián)機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

FTO在乳腺癌、急性髓系白血病和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)，并促進(jìn)這些癌癥的進(jìn)展，現(xiàn)階段已開(kāi)發(fā)出相關(guān)藥物[10，26-27]。大黃酸是第一種有效的FTO抑制劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合催化區(qū)域和單鏈RNA底物抑制FTO。大黃酸還能有效抑制m6A去甲基化，提高體外m6A水平[28]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)FTO在甲狀腺癌中表達(dá)水平較低。此外，它在膀胱癌中也呈低表達(dá)。m6A調(diào)控基因的致癌作用似乎存在爭(zhēng)議。這可能是由于癌癥的異質(zhì)性，相同的基因在不同的癌癥中扮演不同的角色，導(dǎo)致m6A調(diào)節(jié)基因在不同癌癥中的表達(dá)差異。FTO更多的是作為一個(gè)與肥胖、糖尿病和代謝綜合征相關(guān)的基因進(jìn)行研究，在一些大型的研究中發(fā)現(xiàn)，BMI增加已成為甲狀腺癌一個(gè)新的危險(xiǎn)因素。

綜上，m6A RNA甲基化調(diào)控因子在甲狀腺癌中異常表達(dá)并具有預(yù)后價(jià)值，為進(jìn)一步探討m6A甲基化在甲狀腺癌中的作用和尋找相關(guān)治療靶點(diǎn)提供了重要證據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

黃甜甜：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；高凌：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；段碧晗：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；葉迎春：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；王碩：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫(xiě)