天門冬離體快繁技術(shù)

李 林，李 揚，張明生*，彭思靜，吳尚澆，賈 娜，劉 智，于曉松，楊朝雄

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州仙草農(nóng)業(yè)集團有限公司，貴州 貴陽550081)

天門冬(Asparagus cochinchinensis)為百合科(Liliaceae)天門冬屬(Asparagus)多年生攀緣狀亞灌木，又名天冬草、武竹等[1]。天門冬以干燥塊根入藥，是傳統(tǒng)大宗藥材之一[2—4]，其性寒、味甘微苦，歸肺、腎經(jīng)；具有養(yǎng)陰潤燥，清肺生津的功效；用于肺燥干咳、頓咳痰黏、腰膝酸痛、骨蒸潮熱、內(nèi)熱消渴、熱病津傷、咽干口渴、腸燥便秘等癥[5]。天門冬雖然廣泛分布于我國中部、西北、長江流域及南方各地，但因天然種子產(chǎn)量低，種皮堅硬致密、萌發(fā)困難，故自然種群極小，多呈零星分布[6—8]，加之長期人為掠奪式采挖，致其野生資源日漸稀少，遠(yuǎn)不能滿足藥材市場需求，亟需進(jìn)行人工種植[9]。優(yōu)質(zhì)種子種苗繁育是中藥材規(guī)?；N植的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此天門冬優(yōu)質(zhì)種苗的組培快繁是實現(xiàn)其藥材規(guī)范化、規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑之一[10]。本研究以天門冬種子無菌萌發(fā)的胚軸為材料，通過愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)分化與增殖、試管苗壯苗生根與煉苗移栽等適宜培養(yǎng)條件的探索，初步建立其種苗繁育技術(shù)，以期為構(gòu)建天門冬藥材產(chǎn)業(yè)化技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

天門冬種子來自貴州省務(wù)川仡佬族苗族自治縣天門冬生產(chǎn)基地。

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織誘導(dǎo)與增殖

以無菌萌發(fā)25 d的天門冬種子胚軸為外植體，分別接種于10種培養(yǎng)基(處理)(表1)，每處理接種3瓶，每瓶接種5個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)14 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。以5 mm2愈傷組織小塊為外植體，設(shè)置 NAA (0、1.0、2.0、2.5 mg·L-1)、6-BA (0、0.5、1.0 mg·L-1)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合實驗，共7個處理(表2)，每處理接種3瓶，每瓶接種5個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計愈傷組織增殖倍數(shù)。

除特別說明外，培養(yǎng)基均以MS為基本培養(yǎng)基，添加瓊脂 6.5 g·L-1，蔗糖 30 g·L-1，pH 5.8～6.0，培養(yǎng)條件均為培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，光照強度2000 lx，光照時間 12 h·d-1。

1.2.2 叢生芽誘導(dǎo)

以增殖后的愈傷組織1.0 mm2小塊為外植體，采用 L9(34)正交試驗設(shè)計，設(shè)置 6-BA (0.2、0.5、0.7 mg·L-1)、NAA (0.1、0.2、0.3 mg·L-1)、KT (0.1、0.2、0.3 mg·L-1)三因素三水平，共 9個處理(表 3)，每處理接種3瓶，每瓶接種5個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)21 d后統(tǒng)計叢生芽誘導(dǎo)率。

1.2.3 無根苗誘導(dǎo)與壯苗培養(yǎng)

以上述叢生芽為外植體，設(shè)置IAA (0、0.5、1.0、1.5 mg·L-1)與 6-BA (0、0.1、0.2、0.3 mg·L-1)組合實驗，共9個處理(表4)，每處理接種3瓶，每瓶接種5個外植體，重復(fù)3次，培養(yǎng)21 d后統(tǒng)計無根苗誘導(dǎo)及其生長情況。

1.2.4 生根培養(yǎng)

選生長健壯、高5 cm左右的無根苗，采用不同基本培養(yǎng)基(MS、1/2MS、1/4MS)與NAA (1.0、2.0、3.0 mg·L-1)組合處理(表5)，每處理接種3瓶，每瓶接種5棵，重復(fù)3次，35 d后統(tǒng)計生根率和生根數(shù)。

1.2.5 煉苗移栽

生根培養(yǎng)40 d后，選擇根系較發(fā)達(dá)、高5～7 cm的天門冬試管苗打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，置于室溫下煉苗(期間適當(dāng)噴霧維持一定環(huán)境濕度)。3 d后將苗取出，用自來水洗凈根部培養(yǎng)基后移栽至泥炭土:蛭石(2:1)混合基質(zhì)，澆透水。小拱棚覆膜保濕，7 d后揭開薄膜，噴霧保濕，30 d后統(tǒng)計組培苗成活率。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、LSD多重比較等。統(tǒng)計中涉及的項目計算公式如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的外植體個數(shù)/接種數(shù))×100%

愈傷組織增殖倍數(shù)=增殖后愈傷組織鮮重/接種愈傷組織鮮重

叢生芽誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出5個及5個以上芽的個數(shù)/接種數(shù))×100%

平均苗高=(最高苗高+最低苗高) /2

生根率=(生根外植體數(shù)/接種數(shù))×100%

平均生根數(shù)=生根總數(shù)/生根外植體數(shù)

試管苗成活率=(成活苗株數(shù)/移栽試管苗株數(shù))×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 天門冬愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基

以天門冬種子無菌萌發(fā)的胚軸為外植體(圖 1:a)，按表1處理組合篩選適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(圖1: b)。結(jié)果表明，單獨添加6-BA不能誘導(dǎo)無菌胚軸產(chǎn)生愈傷組織，而NAA和6-BA組合對提高愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著效果。當(dāng)NAA濃度一定時，隨著6-BA濃度增加，愈傷組織誘導(dǎo)率先提高后降低，6-BA濃度為1.0 mg·L-1時愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于其他兩個濃度。處理 A2的愈傷組織誘導(dǎo)率與處理 A5差異不顯著，但其愈傷組織生長狀況差異較大，前者愈傷組織量較少、易分化，接種于增殖培養(yǎng)基中增殖慢、易褐化，生長勢較弱；處理 A5的愈傷組織量較大(圖1: c)，雖有少量分化轉(zhuǎn)綠，但轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基中增殖較快、生長勢強(圖1: d)。因此，適于天門冬愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為 MS +6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1，誘導(dǎo)率為 95.6%。

表1 不同濃度NAA和6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 1 Effects of different concentrations of NAA and 6-BA for callus induction

圖1 天門冬愈傷組織誘導(dǎo)、分化和植株再生Fig. 1 Callus induction and differentiation and plant regeneration of A. cochinchinensis

2.2 天門冬愈傷組織增殖的適宜培養(yǎng)基

將天門冬愈傷組織切成小塊，接入表2處理組合的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果表明，單獨添加 6-BA或NAA均能使天門冬愈傷組織增殖(處理B2、B3、B7)，但效果較差，且單獨添加NAA時愈傷組織周圍可分化產(chǎn)生不定根。當(dāng) NAA 濃度為 1.0 mg·L-1時，愈傷組織增殖較快，顏色翠綠，質(zhì)地較為緊實且很快分化出芽(處理 B1和 B4)；6-BA 濃度為0.5 mg·L-1、NAA 濃度為 2.0 mg·L-1(處理 B5)的愈傷組織增殖倍數(shù)最高(9.7)，黃綠色、質(zhì)地較疏松、增殖快而分化晚，適于后期繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)叢生芽(圖1: d)；NAA濃度增至2.5 mg·L-1時，愈傷組織增殖倍數(shù)下降，其邊緣及表面逐漸老化、褐化(處理B6)。因此，適于天門冬愈傷組織增殖的培養(yǎng)基配方為MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 2.0 mg·L-1。

表2 不同濃度6-BA和NAA對愈傷組織增殖的影響Table 2 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA for callus proliferation

2.3 天門冬叢生芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基

將增殖的天門冬愈傷組織切成小塊接入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基，約10 d后出現(xiàn)白色芽點，14 d后淡黃色愈傷組織上誘導(dǎo)出較多叢生芽，顏色逐漸變綠，生長勢強(圖1: e)，28 d后叢生芽快速增殖、加粗變長，顏色翠綠(圖1: f)。隨后，根據(jù)文獻(xiàn)[10—12]篩選出對叢生芽誘導(dǎo)分化有重要影響的因素設(shè)計正交試驗(表3)。以叢生芽誘導(dǎo)率為指標(biāo)，培養(yǎng)基中各成分對叢生芽誘導(dǎo)率影響作用依次為6-BA＞KT＞NAA，隨著6-BA濃度增加，叢生芽誘導(dǎo)率先上升后下降，6-BA 濃度為 0.5 mg·L-1時誘導(dǎo)率較高(處理 C4～C6)，根據(jù)正交試驗，適于天門冬叢生芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方為 MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1。

表3 不同濃度6-BA、NAA和KT對叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different concentrations of 6-BA, NAA and KT for cluster buds induction

2.4 天門冬壯苗的適宜培養(yǎng)基

將誘導(dǎo) 28 d的叢生芽轉(zhuǎn)至不同壯苗培養(yǎng)基培養(yǎng)。從表4可以看出，9個不同處理的幼苗生長情況差異較大，不添加任何植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中叢生芽幾乎停止生長，不分化成苗，莖逐漸玻璃化而死亡(處理D1)。單獨添加6-BA或IAA均能促進(jìn)叢生芽生長，但二者效果差異較大。單獨添加6-BA時，芽苗莖粗而矮，且腋芽不能分化形成枝葉(處理D2～D4)；而單獨添加IAA時，芽苗莖細(xì)長，且腋芽可分化成枝葉，但生長勢弱(處理D5～D7)。當(dāng)同時添加6-BA和IAA時，芽苗莖粗而長、分枝多，但以 6-BA 0.2 mg·L-1、IAA 1.0 mg·L-1較為適宜(處理D8)，培養(yǎng)7 d后叢生芽明顯長高長粗并分化成幼苗，21 d后幼苗的莖節(jié)上出現(xiàn)腋芽并逐漸分枝形成細(xì)葉，幼苗生長勢強，色澤翠綠(圖1: g)。因此，適于天門冬組培壯苗的培養(yǎng)基配方為 MS + 6-BA 0.2 mg·L-1+ IAA 1.0 mg·L-1。

表4 不同濃度IAA和6-BA對幼苗生長的影響Table 4 Effects of different concentrations of IAA and 6-BA for shoots growth

2.5 天門冬生根的適宜培養(yǎng)基

從表5可知，不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根的效果差異較大，添加NAA能促進(jìn)試管苗生根，隨著NAA濃度增加，生根率先增后降(處理E3～E5)。無機鹽濃度對試管苗生根的數(shù)量和質(zhì)量均有一定影響，生根數(shù)為1/4MS＞1/2MS＞MS；MS中試管苗生根慢，主根短，側(cè)根少，幼苗葉片出現(xiàn)白化，長勢差，移栽成活率低(處理E2)；1/2MS中試管苗生根快，主根較長，側(cè)根多且韌性強，幼苗長勢好，移栽成活率高(處理E3～E5)；1/4MS中試管苗生根稍慢，主根和側(cè)根均纖細(xì)、易脆，幼苗生長勢較弱，移栽成活率較低(處理E6)。綜合比較得出，天門冬試管苗適宜的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA 2.0 mg·L-1，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)天門冬無根苗10 d后苗基部出現(xiàn)突起，個別苗齡較大的幼苗開始生根，繼續(xù)培養(yǎng)35 d后形成完整根系(圖1: h, i)，生根率為84.4%，經(jīng)煉苗后移栽成活率達(dá)88.3%，植株生長健壯(圖1: j)。

表5 不同基本培養(yǎng)基和NAA濃度對試管苗生根的影響Table 5 Effects of different basic media and NAA concentrations for test-tube plantlets rooting

4 討論

外植體的選擇是影響組培快繁成功與否的重要因素。天門冬為多年生攀緣狀亞灌木，雖有報道其一年生莖、葉和芽作為外植體可誘導(dǎo)愈傷組織和建立植株再生體系[10]，但實際上十分困難，效果不理想，至今也未能真正實現(xiàn)天門冬規(guī)?；姆N苗繁育。對以營養(yǎng)器官作外植體難以建立其組培快繁體系的物種，嘗試用種子胚性組織誘導(dǎo)愈傷組織，以此再分化形成胚狀體或叢生芽，并進(jìn)一步發(fā)育成再生植株，是一種有效途徑，本研究即是以此途徑較為成功地建立了天門冬的離體快繁技術(shù)。

天門冬種子表面光滑，質(zhì)地堅硬[11]，表面消毒容易[12]，但必須以強酸處理種子方能吸脹萌動獲得具有活力的胚性組織。在植物組織培養(yǎng)中，外植體剪切傷口過大易導(dǎo)致外植體褐化和白化死亡[13]，天門冬組培快繁也是如此。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類、不同配比的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物組培快繁各個環(huán)節(jié)均有明顯影響，適宜的6-BA與NAA組合有助于愈傷組織誘導(dǎo)與增殖，6-BA與較低濃度 NAA和KT組合，能有效促進(jìn)愈傷組織分化叢生芽[14—15]，6-BA與IAA組合可提高芽的生長勢[16]。天門冬種苗快繁中，叢生芽誘導(dǎo)增殖是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，與全妙華等[12]的方法相比，本研究通過對 6-BA、KT、NAA的合理組合獲得較高的叢生芽誘導(dǎo)率。在壯苗培養(yǎng)過程中，6-BA能促進(jìn)主莖變粗，莖上出現(xiàn)明顯腋芽，但不易分枝長葉，而IAA可促進(jìn)腋芽分枝并長出細(xì)葉，兩種生長調(diào)節(jié)劑配合使用，能有效促進(jìn)叢生芽生長成苗，并提高生根率和移栽成活率。NAA、較低濃度無機鹽的MS基本培養(yǎng)基對天門冬生根有利。