陸小亮,吳 彬,陳科濟(jì),李愛軍,范 飛
海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院特需治療科三病區(qū),上海 200438
肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)也被稱為外周型膽管癌、膽管癌之肝內(nèi)型,是肝內(nèi)膽管被覆上皮發(fā)生的、起源于肝段膽管一直到赫令膽管上皮的一種原發(fā)性癌癥,被定義為源于Ⅱ級以遠(yuǎn)的肝內(nèi)膽管病變[1]。肝內(nèi)膽管癌惡性程度高、癥狀隱慝,早期難以被發(fā)現(xiàn),根治性切除機(jī)會較少,且發(fā)展迅速,預(yù)后不佳、死亡率高,近年來其發(fā)病率不斷上升[2]。肝內(nèi)膽管癌發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制目前尚不明確。本研究通過免疫組化、免疫印跡、PCR 方法測定S100A7 在肝內(nèi)膽管癌組織及癌旁組織中的表達(dá),并分析其與肝內(nèi)膽管癌臨床相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系。
收集上海東方肝膽外科醫(yī)院2018 年1 月—2020年1月收治的30例肝內(nèi)膽管癌患者患者,男17例,女13 例。按國際抗癌聯(lián)盟TNM 分期屬Ⅰ、Ⅱ期11例,Ⅲ-Ⅳ期19例。所有患者均未行化療、放療和靶向、免疫治療。
納入標(biāo)準(zhǔn):臨床影像學(xué)診斷為肝內(nèi)膽管癌,首診于我院。排除標(biāo)準(zhǔn):無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,無手術(shù)禁忌。患者及家屬均術(shù)前已簽訂我院標(biāo)本供醫(yī)學(xué)研究使用告知同意書,本研究經(jīng)上海東方肝膽外科倫理會審核并批準(zhǔn)?;颊呔懈蝺?nèi)膽管癌根治術(shù)。術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實(shí)為肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌。
運(yùn)用免疫組化和real-timePCR、免疫印跡的實(shí)驗(yàn)方法檢測S100A7 的蛋白和mRNA 在肝內(nèi)膽管癌組織中的表達(dá)情況:新鮮液氮凍存的組織樣本,分成2 份,一份提取蛋白,一份提取RNA。采用Invitrogen 公司的免疫組化試劑盒對30 例樣本進(jìn)行蛋白水平的檢測;蛋白裂解液裂解組織,4 ℃下離心,獲取上清、蛋白變性20 min;與細(xì)胞裂解液進(jìn)行12%的SDS-PAGE 電泳,ECL 發(fā)光試劑盒顯影、曝光,分析蛋白表達(dá)量;TRizol 抽提組織中的總RNA,設(shè)計(jì)針對S100A7 的特異引物,對反轉(zhuǎn)錄cDNA 進(jìn)行real-time PCR 反應(yīng),以β-actin 為內(nèi)參,檢測S100A7的mRNA水平。
數(shù)據(jù)用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用Fisher 精確概率法、Linear-by-Linear Association法、Pearson Chi-square 法對S100A7 表達(dá)與相關(guān)臨床相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
免疫組化檢測的30 例肝內(nèi)膽管癌組織S100A7表達(dá)水平。結(jié)果顯示,癌組織中S100A7 染色強(qiáng)度、陽性百分比和Quickscore 均顯著高于癌旁組織,見圖1。
圖1 S100A7在肝內(nèi)膽管癌及癌旁組織細(xì)胞中的表達(dá)(免疫印跡法)Fig.1 The expression of S100A7 in intrahepatic cholangiocarcinoma and the adjacent tissue cells(Western blotting)
為驗(yàn)證免疫組化結(jié)果,我們用免疫印跡法檢測了30 例肝內(nèi)膽管癌組織標(biāo)本中S100A7 表達(dá)水平。結(jié)果癌組織S100A7 蛋白表達(dá)水平亦明顯高于癌旁組織,見圖2。
為進(jìn)一步驗(yàn)證S100A7 是否在肝內(nèi)膽管癌高表達(dá),我們用定量PCR檢測了30例肝內(nèi)膽管癌組織標(biāo)本中S100A7 mRNA 表達(dá)。結(jié)果癌組織中S100A7 mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織。見圖3。
本研究分析了30 例肝內(nèi)膽管癌S100A7 表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性。S100A7表達(dá)與浸潤深度,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TMN 分級存在顯著相關(guān)性(P<0.05),但與患者患者的性別、年齡、淋巴管侵犯、腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。見表1。
肝內(nèi)膽管癌是一種惡性程度高,較難早期發(fā)現(xiàn),預(yù)后很差的惡性腫瘤。其發(fā)生可能與某些因素相關(guān)[3]如肝內(nèi)膽管結(jié)石[4]、膽管分支(膽管樹)形態(tài)異常、慢性感染、放射性核素及石棉、亞硝酸胺等化學(xué)性物質(zhì)[5-6]。目前臨床上應(yīng)用的幾個(gè)檢查指標(biāo)如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原199(CA199)[7-9]、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)、堿性磷酸酶(ALP)等為肝內(nèi)膽管癌的腫瘤標(biāo)志物,雖有一定特異度和靈敏度,但總體而言尚缺乏有效的臨床診治、預(yù)后判斷的分子靶標(biāo),且相關(guān)基礎(chǔ)研究較少。
我們前期通過高通量基因表達(dá)譜篩選、芯片檢測及生物信息學(xué)分析,篩查出肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞存在一個(gè)顯著變化的分子即S100A7(S100 calcium binding protein A7)。本文在這基礎(chǔ)上,應(yīng)用免疫組化、免疫印跡、實(shí)時(shí)定量PCR 進(jìn)一步檢測驗(yàn)證,并分析與肝內(nèi)膽管癌患者的臨床病理相關(guān)性。免疫組化、免疫印跡、實(shí)時(shí)定量PCR 的檢測結(jié)果均顯示,S100A7 在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織;而且發(fā)現(xiàn),S100A7 在肝內(nèi)膽管癌中表達(dá)與腫瘤浸潤深度(T1、T2對T3、T4,P=0.027)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0對N1-2,P=0.014)、TNM 分級(Ⅰ、Ⅱ期對.Ⅲ、Ⅳ期,P=0.021)呈正相關(guān),提示肝內(nèi)膽管癌S100A7 表達(dá)越高,其腫瘤浸潤越嚴(yán)重,淋巴結(jié)越易轉(zhuǎn)移,TNM 分期越晚,患者預(yù)后越差;但與性別、年齡、淋巴管轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。
圖2 S100A7在肝內(nèi)膽管癌及癌旁組織細(xì)胞中的表達(dá)(免疫組化)Fig.2 The expression of S100A7 in intrahepatic cholangiocarcinoma and the adjacent tissue cells(immunohistochemistry)
圖3 S100A7 在肝內(nèi)膽管癌及癌旁組織細(xì)胞中的表達(dá)(qRT-PCR)Fig.3 The expression of S100A7 mRNA in intrahepatic cholangiocarcinoma and the adjacent tissue cells(qRT-PCR)
S100A7也稱銀屑病素,最早是在銀屑病皮膚病變中被分離和發(fā)現(xiàn)的一個(gè)相對分子質(zhì)量約11 400的低分子量蛋白,屬S100家族[10]。該家族的典型結(jié)構(gòu)特征是有兩個(gè)螺旋基元(helix-loop-helix)組成的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)(calcium-binding site)[11]。在S100蛋白家族中,有22個(gè)家族成員在1號染色體21位基因座(locus)位置形成基因簇(cluster)[12],其中也包括S100A7。S100家族成員在細(xì)胞內(nèi)、外均起重要的生理功能,包括鈣離子平衡、增殖、凋亡、侵襲/運(yùn)動、細(xì)胞骨架變化、轉(zhuǎn)錄等[13]。作為S100 家族的成員,S100A7 除了上述兩個(gè)具有家族特征的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)外,還有一個(gè)特有鋅結(jié)合位點(diǎn)(zinc-binding site),該位點(diǎn)可能是介導(dǎo)S100A7特異性功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域[14]。據(jù)報(bào)道,S100A7參與了眾多上皮來源的惡性腫瘤[15]包括子宮癌[16]、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等[17-19]的 發(fā) 生、發(fā) 展 過 程,如S100A7 通 過 調(diào) 控Hippo-YAP 通 路 促 進(jìn) 肺 癌 發(fā) 生 發(fā) 展[18]。而 且,S100A7 表達(dá)受表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)信號通路的調(diào)控,并參與該信號通路的調(diào)控[20]。我們團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道,microRNA-26b-5p(miR-26b-5p)可通過抑制S100A7的過度表達(dá)抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移[21]。然而,關(guān)于S100A7 在肝內(nèi)膽管癌中的功能和分子機(jī)制研究以及與臨床病理相關(guān)性,罕有報(bào)道。本文結(jié)果,S100A7 在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞高表達(dá),且與腫瘤浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分級相關(guān),提示可能參與了肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展;在臨床上開展檢測S100A7 表達(dá),可能助于了解肝內(nèi)膽管癌患者的預(yù)后。如若進(jìn)一步研究S100A7及其下游信號通路分子抑制劑,有望開發(fā)針對性的靶向藥以改善患者不良預(yù)后。
表1 肝內(nèi)膽管癌S100A7表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性Tab.1 Relationship between S100A7 expression in intrahepatic cholangiocarcinoma and clinicopathological parameters