玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP77基因克隆及表達(dá)分析

鄒華文，郭凱，張瑩瑩，侯留迪，朱葉青，胡蓉蓉，周開(kāi)明，張丙林，劉衛(wèi)娟

長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州434025

堿性亮氨酸拉鏈(Basic Leucine Zipper，bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族是真核生物中分布最廣泛、結(jié)構(gòu)最保守的一類(lèi)基因家族[1]。bZIP蛋白含有60～80個(gè)氨基酸殘基[2]，這些殘基組成了一個(gè)堿性區(qū)域和一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。堿性區(qū)域含有一個(gè)不變的N-x7-R/K基序；亮氨酸拉鏈區(qū)由一個(gè)或多個(gè)重復(fù)區(qū)域組成[3]。

在植物中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族行使多種功能，包括參與種子發(fā)育、病菌防御、維管發(fā)育、光信號(hào)傳導(dǎo)、組織和器官分化以及非生物脅迫響應(yīng)等多種生理進(jìn)程[4-6]。在擬南芥中，轉(zhuǎn)MdbZIP48基因的擬南芥種子發(fā)芽率、子葉綠化率、根長(zhǎng)均高于野生型[7]。CRAWFORD等[8]研究發(fā)現(xiàn)，胡椒在受到病蟲(chóng)害的侵襲時(shí)，CAbZIP1轉(zhuǎn)錄因子起著重要的調(diào)控作用。MITSUTOMO等[9]研究結(jié)果顯示，bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD能夠促進(jìn)植物開(kāi)花，F(xiàn)D同開(kāi)花關(guān)鍵基因FT互作，進(jìn)而調(diào)控下游與花原基分化相關(guān)基因的表達(dá)。Lu[10]等研究發(fā)現(xiàn)，水稻bZIP家族中的成員OsbZIP12和OsbZIP72的表達(dá)受ABA的誘導(dǎo)和調(diào)控。擬南芥AtbZIP29基因通過(guò)調(diào)控根尖分生組織細(xì)胞中細(xì)胞壁的形成來(lái)影響根的生長(zhǎng)發(fā)育[11]。過(guò)量表達(dá)剛毛怪柳ThbZIP1基因的擬南芥，其耐旱性和耐鹽性都顯著高于野生型[12]。過(guò)量表達(dá)玉米ZmbZIP72基因的擬南芥，其耐旱性和耐鹽性顯著增強(qiáng)[13]。轉(zhuǎn)OsbZIP23基因顯著提高水稻的耐旱性[14]，表明OsbZIP23基因在水稻對(duì)抗非生物脅迫的過(guò)程中起到了重要作用。相對(duì)于其他作物而言，堿性亮氨酸拉鏈蛋白在擬南芥和水稻中的作用研究較為深入，但在玉米中的作用研究相對(duì)較少。

在前期工作中，筆者對(duì)干旱處理下不同耐旱性的玉米材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編號(hào)為GRMZM2G066734的序列在所有玉米材料中都表達(dá)。在干旱敏感材料中，該基因在干旱處理下的表達(dá)量是正常處理下的7.9倍；在耐旱材料中，該基因在干旱處理下的表達(dá)量是正常處理下的13.6倍，提示其可能在干旱信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起到重要作用[15]。將GRMZM2G066734序列片段在MazieGDB中進(jìn)行比對(duì)，得到ZmbZIP77基因序列。研究中，筆者克隆了玉米ZmbZIP77基因，并且對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析該基因在玉米不同組織及不同逆境條件下的表達(dá)特征，以期為下一步深入研究ZmbZIP77生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

研究所用玉米材料為B73自交系，由長(zhǎng)江大學(xué)玉米逆境分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。選取大小一致的玉米種子，用1%次氯酸鈉消毒5min，蒸餾水沖洗3次，置于28℃培養(yǎng)箱中催芽。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的種子，放入1/4 Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每周更換2次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至三葉一心期進(jìn)行處理。用20% PEG6000替換培養(yǎng)液模擬干旱處理，用0.2mol/L NaCl溶液替換培養(yǎng)液模擬鹽脅迫處理，對(duì)照組均為正常培養(yǎng)，分別處理48h后取樣；將植株置于42℃光照培養(yǎng)箱模擬高溫處理，對(duì)照組為正常溫度培養(yǎng)，處理4h后取樣；對(duì)葉面均勻噴施0.1mol/L 的脫落酸(ABA)進(jìn)行處理，對(duì)照組噴施蒸餾水，每隔12h噴灑1次，共4次。分別取各個(gè)處理后植株的根部和正常處理植株的根、葉和胚芽鞘，液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱中。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2 玉米總RNA的提取及cDNA的合成以及基因克隆

以正常培養(yǎng)條件下的玉米根為材料，進(jìn)行總RNA的提取?？俁NA提取參照寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司TRIzol試劑產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行。殘留DNA的去除以及cDNA合成參照全式金公司試劑盒(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)說(shuō)明進(jìn)行。cDNA測(cè)定濃度后保存于-20℃待用。

利用Primer 5.0 分別設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法獲得ZmbZIP77基因片段。PCR體系為10μL：cDNA0.5μL，ddH2O 1.3μL，2× buffer 5.0μL，dNTP(2.5mmol/L) 2.0μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，Taq 酶(5U/μL)0.2μL。 PCR反應(yīng)條件:94℃ 2min，98℃ 10s，62℃ 30s，68℃ 1min，35個(gè)循環(huán)，68℃ 4min。

表1 引物序列及用途Table 1 Primer sequence and application

1.3 玉米ZmbZIP77基因表達(dá)分析

以玉米GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。試驗(yàn)中使用SYBR Green I熒光標(biāo)記染料為購(gòu)于天根生化公司的RealUniversal彩色熒光定量預(yù)混試劑，熒光定量PCR儀型號(hào)為bio-rad CFX connet。每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)技術(shù)重復(fù)，相對(duì)定量的結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 玉米ZmbZIP77基因的生物信息學(xué)分析

利用Expasy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對(duì)玉米bZIP家族成員進(jìn)行氨基酸殘基數(shù)、理論等電點(diǎn)和相對(duì)分子量等理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)，DNAMAN軟件進(jìn)行序列對(duì)比后使用MEGA-X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，使用在線工具InterProscan[16](http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)分析ZmbZIP77蛋白結(jié)構(gòu)域，采用在線工具SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，TMHMM Server v.2.0(https://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ )用于ZmbZIP77蛋白的親疏水性分析，NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)則用于進(jìn)行磷酸化微點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。利用Softberry在線工具Protcomp 9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)進(jìn)行基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmbZIP77的基因克隆與序列分析

圖1 ZmbZIP77核苷酸序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of ZmbZIP77 and amino acid sequence of the coding

RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序后的核酸及編碼的氨基酸序列如圖1所示。在NCBI中比對(duì)結(jié)果表明此序列與其他物種的bZIP77序列相似性最高，于是命名此序列為ZmbZIP77，并在NCBI中登錄，登錄號(hào)為MH210731。進(jìn)一步分析表明，此序列含有1個(gè)長(zhǎng)度為387bp的開(kāi)放閱讀框，上游有1個(gè)起始密碼子ATG，下游有1個(gè)終止密碼子TGA，表明此序列是1個(gè)全長(zhǎng)的基因。

ProtParam在線分析顯示，ZmbZIP77基因共編碼129個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為31.8ku，等電點(diǎn)為5.16，總平均親水性為0.961，親水性系數(shù)介于-3～3之間，屬于兩性氨基酸(見(jiàn)圖2(a))。NetPhos 3.1 在線分析顯示，ZmbZIP77中有5個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)(見(jiàn)圖2(b))。利用InterProscan對(duì)ZmbZIP77蛋白的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白中含有BRLZ結(jié)構(gòu)域和2個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域，分別位于氨基酸14～81、93～103和105～121位置。SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ZmbZIP77的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有α螺旋約占81.40%，β轉(zhuǎn)角約占3.88%，延伸鏈約占1.55%，無(wú)規(guī)則卷曲約占13.18%(見(jiàn)圖2(c))。利用Softberry在線工具進(jìn)行的蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白可能位于細(xì)胞核中。

圖2 ZmbZIP77蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.2 Bioinformatics analysis of ZmbZIP77 protein

2.2 玉米ZmbZIP77的蛋白同源性及進(jìn)化樹(shù)分析

從NCBI中分別選取擬南芥、小麥以及水稻的bZIP序列與ZmbZIP77進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，ZmbZIP77與其他bZIP家族成員一樣，均含有1個(gè)保守的GBF1(Plant G-box binding factor 1)結(jié)構(gòu)域，暗示它和該家族中其他成員具有相同或相似的功能。

圖3 ZmbZIP77蛋白序列及其他序列的多重比對(duì)Fig.3 Multiple alignment of ZmbZIP77 protein sequence with other sequences

圖4表示ZmbZIP77與其他相關(guān)bZIP序列(包括擬南芥中的AtbZIP10和HY5,水稻中的OsbZIP34、OsbZIP06和OsbZIP2b,高粱中的SbbZIP19、SbbZIP27和SbbZIP60,玉米中的ZmbZIP6和ZmbZIP52,小麥中的Wlip9a和TabZIP1)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)。由圖4可知，根據(jù)bZIP序列的同源性，植物bZIP序列可以分為3類(lèi)，ZmbZIP77位于第Ⅱ類(lèi)，與小麥Wlip9a和擬南芥AtbZIP10親緣關(guān)系最近。

圖4 ZmbZIP77蛋白與其它物種同源基因的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of ZmbZIP77 protein and homologous genes of other species

2.3 玉米ZmbZIP77的表達(dá)譜分析

2.3.1ZmbZIP77在玉米不同組織中的表達(dá)譜分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析ZmbZIP77基因在不同部位中的表達(dá)情況。結(jié)果(見(jiàn)圖5)表明，ZmbZIP77在根中的表達(dá)量最高，其次是胚芽鞘，在葉中的表達(dá)水平相對(duì)較低。該基因在根中的表達(dá)量是葉中表達(dá)量的5.17倍，在胚芽鞘中的表達(dá)量是葉中表達(dá)量的1.73倍，由此推斷ZmbZIP77基因可能在根及胚芽鞘的發(fā)育進(jìn)程中起作用。

2.3.2ZmbZIP77在不同處理下的表達(dá)譜分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析玉米根中ZmbZIP77基因在不同非生物脅迫處理下的表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在玉米根中干旱、ABA和高溫極顯著誘導(dǎo)該基因表達(dá)，其中干旱和ABA處理后該基因表達(dá)量是未處理的4.15倍和4.47倍；鹽脅迫對(duì)該基因無(wú)顯著誘導(dǎo)作用，暗示該基因可能參與ABA信號(hào)相關(guān)的干旱信號(hào)響應(yīng)。

圖5 正常條件下ZmbZIP77在玉米各部位中的相對(duì)表達(dá)量 圖6 不同處理?xiàng)l件下ZmbZIP77在玉米根中的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The relative expression of ZmbZIP77 in various Fig.6 The relative expression of ZmbZIP77 in maize parts of maize under normal conditions roots under different treatment conditions

3 結(jié)論

通過(guò)分別從其他作物中選取bZIP序列與玉米ZmbZIP77進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些bZIP序列非常保守，都含有一個(gè)保守的GBF1(Plant G-box binding factor 1)結(jié)構(gòu)域，暗示ZmbZIP77和其它bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員一樣行使相同或相似的功能。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明玉米ZmbZIP77同擬南芥AtbZIP10和小麥Wlip19a的親緣關(guān)系最近，位于第Ⅱ類(lèi)。

在不同組織中測(cè)定玉米ZmbZIP77基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，在根和胚芽鞘中表達(dá)量相對(duì)較高，在葉中表達(dá)量相對(duì)較低，說(shuō)明玉米ZmbZIP77具有組織特異性。對(duì)玉米分別進(jìn)行高溫、干旱、脫落酸(ABA)和鹽4種非生物脅迫處理，結(jié)果表明，干旱顯著誘導(dǎo)玉米ZmbZIP77表達(dá)，ABA和高溫次之，鹽脅迫不顯著誘導(dǎo)該基因表達(dá)。在根部中，玉米ZmbZIP77受干旱誘導(dǎo)表達(dá)模式與香蕉MaZAT10基因受干旱誘導(dǎo)表達(dá)相似[17]；玉米ZmbZIP77受高溫誘導(dǎo)表達(dá)模式和水稻OsBBX6相似[18,19]。玉米ZmbZIP77基因不但可以被干旱和高溫等非生物脅迫因子誘導(dǎo)表達(dá)，還可以被ABA誘導(dǎo)表達(dá)，表明其可能參與ABA介導(dǎo)的非生物脅迫響應(yīng)信號(hào)通路。對(duì)于其真實(shí)的生化特性、在逆境信號(hào)傳導(dǎo)及植物生長(zhǎng)發(fā)育中的確切作用還需要進(jìn)一步研究探討。