伯克霍爾德氏菌YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病的防效及其促生作用

孫正祥，孟祥佳，龍欣鈺，邱美莎，毛國慶，周燚

1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北 荊州 434025 2.湖北省農(nóng)林病蟲害預(yù)警與調(diào)控工程技術(shù)研究中心(長江大學(xué))，湖北 荊州 434025

由尖孢鐮刀菌西瓜專化型(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)侵染引起的西瓜枯萎病是一種土傳的系統(tǒng)性病害，是西瓜的重要病害之一，在西瓜的整個(gè)生育期均可發(fā)生，對(duì)西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成巨大的威脅[1]。目前西瓜枯萎病的防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治、抗病育種和化學(xué)藥品防治，其中化學(xué)防治因其效果好、成本低而成為了主要的病害防治手段[2,3]。但長期使用同一種農(nóng)藥易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，且其大量殘留會(huì)殺死土壤中的有益微生物，同時(shí)對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，不宜長期使用[3-5]。生防菌劑防治因其具有對(duì)植物病害的良好防效和對(duì)環(huán)境無污染等特點(diǎn)，逐漸受到了人們的重視[6-8]。

生防細(xì)菌具有適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)、營養(yǎng)需求簡單、定殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為植物病害生物防治研究的熱點(diǎn)。目前，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)和假單胞菌屬 (Pseudomonassp.)已成功應(yīng)用于植物病害生物防治領(lǐng)域。但伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)應(yīng)用于生物防治的研究較少[9]。菌株YZU-S230是由長江大學(xué)植物與微生物互作研究室前期分離得到的一株生防細(xì)菌，經(jīng)鑒定為伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)，具有廣譜的抑菌活性且對(duì)水稻紋枯病具有良好的盆栽防效。該研究通過盆栽試驗(yàn)測(cè)定了YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效和對(duì)西瓜植株的促生作用及其定殖動(dòng)態(tài)，旨在為西瓜枯萎病的生物防治提供更多的菌源，也為后期探究生防細(xì)菌與病原菌、寄主的互作關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株包括西瓜枯萎病病菌(F.oxysporumf.sp.niveumFON)和伯克霍爾德氏菌YZU-S230和YZU-S230gfp(將pBBR1MCS2-Tac-EGFP質(zhì)粒導(dǎo)入YZU-S230，由長江大學(xué)植物與微生物互作研究室前期轉(zhuǎn)化完成)。供試西瓜為西農(nóng)八號(hào)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)選育。供試培養(yǎng)基包括LB培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌作用

采用平板對(duì)峙法[10]，選取培養(yǎng)3d的西瓜枯萎病原菌菌餅(5mm)接種至PDA平板中央，在平板兩側(cè)距平板中央各2.5cm的地方平行劃線接種菌株YZU-S230，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每個(gè)處理3次重復(fù)，7d后測(cè)量各處理和對(duì)照(CK)的菌落直徑并計(jì)算抑菌率。

1.2.2 西瓜幼苗的培養(yǎng)

挑選健康的大小一致的西瓜種子,按常規(guī)方法進(jìn)行表面消毒[11]，隨后將其放入含有濕棉花的培養(yǎng)皿中，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待種子露白后將其播種至含有無菌基質(zhì)土的育苗盤中，待西瓜幼苗長出第3片真葉后將其移栽至裝有無菌基質(zhì)土的盆缽中，用于后續(xù)試驗(yàn)處理[12]。

1.2.3 YZU-S230對(duì)西瓜植株的促生作用

將活化好的YZU-S230 接種到LB培養(yǎng)基中，28℃、130r/min 震蕩培養(yǎng)4d，用分光光度計(jì)將其濃度調(diào)至光密度D600nm=1.0。采用灌根法接種生防細(xì)菌，每株西瓜幼苗接種20mL，以接種等量的LB為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，各有西瓜苗15株[13]。接種30d后記錄西瓜植株的株高、根長、葉綠體含量和鮮重等數(shù)據(jù)[13]。

1.2.4 YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理:①西瓜枯萎病菌(FON)+提前3d接種YZU-S230；②FON+同時(shí)接種YZU-S230；③FON+LB。

將西瓜枯萎病菌接種至PDB培養(yǎng)基中，于28℃、130r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)，5d后用血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)培養(yǎng)液中西瓜枯萎病菌孢子的濃度，接種時(shí)將孢子液與無菌基質(zhì)土進(jìn)行混合制成病土，使每克基質(zhì)土含有1.0×105cfu個(gè)分生孢子[15,16]。細(xì)菌的培養(yǎng)和接種參照1.2.1。以接種LB為對(duì)照，每處理 3次重復(fù)，各有西瓜苗15株。接種30d后調(diào)查各處理西瓜植株的發(fā)病嚴(yán)重度，計(jì)算相應(yīng)的病情指數(shù)和相對(duì)防效[17]。

1.2.5 YZU-S230在西瓜根部的定殖動(dòng)態(tài)

將活化后的菌株YZU-S230gfp接種至含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、130r/min震蕩培養(yǎng)，4d后用分光光度計(jì)將培養(yǎng)液濃度調(diào)至光密度D600=1.0，其接種方法參照1.2.1。分別在接種后1、3、5、7、9、15、21、30d采集西瓜苗，采用稀釋涂布法分離其根部內(nèi)生細(xì)菌[18]，取100μL 研磨液涂布于含卡那霉素的LB固體平板上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算菌株在西瓜根部的定殖數(shù)量[19,20]。另取上述不同時(shí)間的西瓜苗根部組織，用無菌水沖洗干凈后在冷凍切片機(jī)上切成薄片，并將其制成玻片，于熒光顯微鏡下觀察菌株YZU-S230gfp在西瓜根部組織中的定殖動(dòng)態(tài)[21]。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌作用

圖1 YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌作用Fig.1 Inhibition effect of YZU-S230 on watermelon Fusarium wilt

平板對(duì)峙試驗(yàn)表明,對(duì)照組西瓜枯萎病菌平均菌落直徑為81.84mm，處理組西瓜枯萎病菌平均菌落直徑為18.22mm(見圖1)。菌株YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病的抑制率為82.80%。

2.2 YZU-S230對(duì)西瓜植株的促生作用

促生長試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)YZU-S230處理后30d，西瓜植株的地上鮮重、主蔓長和根長都顯著大于對(duì)照組，其中地上鮮重與對(duì)照相比增加了6.9g，主蔓長和根長分別增加了8.7cm和3.0cm(表1)。

表1 菌株YZU-S230對(duì)西瓜的促生作用Table 1 Growth promotion of strain YZU-S230 on watermelon

2.3 YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效

盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果顯示，處理30d后，只接種病原菌時(shí)西瓜苗的發(fā)病率是100%，而用菌株YZU-S230處理后其發(fā)病率為60%，且接種生防菌的植株病情指數(shù)都顯著低于對(duì)照。此外，提前3d接種菌株YZU-S230時(shí)其對(duì)西瓜枯萎病的防效可達(dá)68.40%，明顯高于同時(shí)接種時(shí)的防效(30.87%)(表2、圖2)。

表2 YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效(接種30d后)Table 2 Control effect of strain YZU-S230 on watermelon Fusarium wilt in pot experiment(30 days ofter inoculation)

2.4 YZU-S230在西瓜根部的定殖動(dòng)態(tài)

圖2 菌株YZU-S230對(duì)西瓜枯萎病的盆栽防效Fig.2 Control effect of strain YZU-S230 on watermelon Fusarium wilt in pot experiment

圖3 不同時(shí)間下YZU-S230在西瓜根部的定殖數(shù)量Fig.3 Colonization number of YZU-S230 in watermelon roots at different times

定殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，YZU-S230gfp不僅能在西瓜植株根表穩(wěn)定定殖，還能進(jìn)入根內(nèi)定殖。該菌株在西瓜根部可持續(xù)定殖30d，其數(shù)量先增后減，隨后趨于穩(wěn)定，第21天時(shí)其定殖數(shù)量仍可達(dá)1.2×105cfu/g(見圖3)。鏡檢結(jié)果表明，YZU-S230gfp在熒光顯微鏡下能發(fā)出明顯的綠色熒光，在根組織中的數(shù)量也呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)(見圖4)。

圖4 YZU-S230gfp在西瓜根部的定殖動(dòng)態(tài)Fig.4 Colonization dynamics of YZU-S230gfp in watermelon roots

3 討論與結(jié)論

西瓜枯萎病是世界上十分嚴(yán)重的土傳病害之一，目前沒有安全有效的防治方法[22]。利用植物內(nèi)生細(xì)菌以及根際細(xì)菌抑制病原菌是生物防治的重要手段和方法。已有研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌與根際細(xì)菌具有促進(jìn)植物種子萌發(fā)、增強(qiáng)植物抗病能力、促進(jìn)植物幼苗生長的作用[23,24]。菌株YZU-S230是從白芨根部分離的一株內(nèi)生細(xì)菌，前期試驗(yàn)表明該菌株對(duì)水稻紋枯病的盆栽防效顯著，而筆者的研究表明其對(duì)西瓜枯萎病具有良好的盆栽防效，對(duì)西瓜植株具有促生長作用。

生防菌在植物體內(nèi)的有效定殖是其發(fā)揮生防效果的重要條件之一，因此測(cè)定生防菌的定殖能力已成為目前研究生防菌作用機(jī)制的重要內(nèi)容[25]。研究采用抗生素標(biāo)記法[25]檢測(cè)了菌株的定殖能力，結(jié)果顯示西瓜根部YZU-S230菌量在第3天出現(xiàn)高峰后迅速下降，這可能與西瓜在此時(shí)生長迅速有關(guān)，生物量迅速增加導(dǎo)致植株內(nèi)的YZU-S230菌量相對(duì)下降。21d后，菌株YZU-S230和植物苗的生長達(dá)到一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的狀態(tài)，此時(shí)單位鮮重植物組織中的YZU-S230菌量也達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，表明菌株YZU-S230能與西瓜植株形成共生關(guān)系，可以在西瓜植株內(nèi)長期穩(wěn)定定殖并發(fā)揮防治西瓜枯萎病的作用[27]。

室內(nèi)環(huán)境與田間環(huán)境區(qū)別較大，導(dǎo)致菌株在田間試驗(yàn)中的防治效果遠(yuǎn)低于實(shí)驗(yàn)室中的防治效果。菌株YZU-S230能否在田間穩(wěn)定發(fā)揮其生防機(jī)制還需通過下一步的田間試驗(yàn)進(jìn)行探究。其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性(溫度、紫外光)是該菌株能被制成生防菌活菌劑，并與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際情況相結(jié)合的關(guān)鍵。因此，對(duì)菌株YZU-S230產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)的研究是后期工作的重點(diǎn)。