微生物菊糖蔗糖酶及在食品中的應(yīng)用研究進展

倪大偉，徐 煒，張文立,2，沐萬孟,2,

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 食品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 無錫 214122）

自然界中存在兩種果聚糖，按照果糖基之間糖苷鍵的差異，可分為β-(2,1)糖苷鍵連接的菊糖和β-(2,6)糖苷鍵連接的左聚糖（圖1）。左聚糖在植物中含量極少，目前工業(yè)上主要以蔗糖為底物，通過果聚糖蔗糖酶（levansucrase，LSase）生產(chǎn)左聚糖[1]；相反地，菊糖在一些植物中含量豐富，尤其是菊科植物，如菊苣、菊芋和大麗花等[2]。作為一種益生元和膳食纖維，菊糖具有許多顯著的生理功能，如抗氧化、促進礦物質(zhì)吸收、緩解便秘等[2]。食品工業(yè)中，菊糖作為膨化劑、增稠劑、脂肪替代品等，常用于冰淇淋、巧克力、酸奶等的生產(chǎn)[3]。

圖1 菊糖和左聚糖結(jié)構(gòu)式[1-2]Fig.1 Structures of inulin and levoglycan[1-2]

一些微生物可以通過菊糖蔗糖酶（inulosucrase，ISase）合成菊糖。微生物菊糖與植物菊糖相比，其分子質(zhì)量是植物菊糖的數(shù)百倍。近年來，以蔗糖為唯一底物，利用ISase合成微生物菊糖受到人們關(guān)注。作為一種兼具水解和轉(zhuǎn)糖基能力的酶，ISase也能夠以蔗糖為果糖基供體，以某些其他糖類為果糖基受體，合成新型低聚糖。

ISase自1973年被發(fā)現(xiàn)以來[4]，在新酶挖掘與性質(zhì)鑒定、構(gòu)效關(guān)系與分子改造等方面的研究不斷被報道。然而，國內(nèi)關(guān)于該酶的研究鮮有報道。本文從近年來學(xué)者們對于ISase結(jié)構(gòu)、功能和催化機理的研究出發(fā)，總結(jié)了在酶分子改造方面，尤其是其產(chǎn)物——菊糖鏈長調(diào)控方面的研究進展。重點討論了ISase在食品領(lǐng)域的應(yīng)用價值，并對其發(fā)展趨勢提出合理的展望。

1 ISase的晶體結(jié)構(gòu)

酶分子的結(jié)構(gòu)決定其功能，對酶結(jié)構(gòu)的解析可以通過酶分子改造手段而改善酶的性質(zhì)，提高酶的應(yīng)用價值。ISase和LSase同屬于糖苷水解酶GH68家族（http://www.cazy.org/），按照催化口袋的整體構(gòu)像，又屬于Clan-J家族。目前，總計15 種微生物來源的ISase被鑒定，僅有一種來自Lactobacillus johnsoniiNCC533的ISase（Laje-ISase）被解析了晶體結(jié)構(gòu)[5]。圖2和圖3A分別展示了Laje-ISase的二級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。ISase的整體構(gòu)象由5 個β-折疊的結(jié)構(gòu)域組成，每個結(jié)構(gòu)域又由4 個反相平行的β-折疊組成。20 個β-折疊共同構(gòu)成了漏斗狀的催化口袋，這種催化口袋的構(gòu)象稱為“5-foldβ-propeller”。

除了裸蛋白結(jié)構(gòu)，Laje-ISase與蔗糖和蔗果三糖復(fù)合物的共晶結(jié)構(gòu)也被解析出來。由此揭示了在酶催化反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用的3 個氨基酸（稱為催化三聯(lián)體），具體為兩個天冬氨酸和一個谷氨酸（D272、D425和E524），分別起到親核試劑、過渡態(tài)穩(wěn)定劑和提供催化質(zhì)子酸/堿的作用（圖3B）。Laje-ISase的結(jié)構(gòu)顯示，在催化口袋的外圍，有一個Ca2+結(jié)合位點，因此，Ca2+可能對酶催化反應(yīng)活力和穩(wěn)定性起到一定的影響。一些對酶學(xué)性質(zhì)的研究證明了這一點，如Lactobacillus reuteri121來源的ISase在添加1 mmol/L CaCl2的條件下，酶活力提高了20%以上[6]。

三聯(lián)體活性位點的協(xié)同作用是ISase和LSase催化反應(yīng)的共同特征。晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，ISase和LSase的催化口袋均采用“5-foldβ-propeller”構(gòu)象，并且兩種酶三維結(jié)構(gòu)的重合度很高。相似的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致ISase和LSase的催化機理和反應(yīng)進程基本一致。目前，5 種微生物來源的LSase晶體結(jié)構(gòu)已被解析，分別來自Bacillus subtilis[7]、Gluconacetobacter diazotrophicus[8]、Erwinia amylovora[9]、Bacillus megaterium[10]和Erwinia tasmaniensis[11]。ISase和LSase結(jié)構(gòu)上的不同主要在于ISase中無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)多，從而蛋白的柔性較大。目前僅解析出一種來源的ISase結(jié)構(gòu)，這可能與其蛋白分子柔性大，不易結(jié)晶有關(guān)。

圖2 Laje-ISase的二級結(jié)構(gòu)[1,5]Fig.2 Secondary structure of Lactobacillus johnsonii NCC533-ISase (Laje-ISase)[1,5]

圖3 Laje-ISase的三維結(jié)構(gòu)圖[5]Fig.3 Three-dimensional structure of Laje-ISase[5]

2 ISase的催化機理

根據(jù)糖苷鍵水解后異頭碳上羥基的構(gòu)象，糖苷酶的反應(yīng)機制分為保留機制和反轉(zhuǎn)機制兩種。通過對糖苷酶的結(jié)構(gòu)分析，涉及催化反應(yīng)的一對羧基的距離決定了兩種不同的反應(yīng)機制。糖苷酶的催化位點由兩個酸性氨基酸組成，若兩個氨基酸上羧基的距離在5.5 ?左右，則為保留機制；距離在10 ?左右，則為反轉(zhuǎn)機制[12]。Laje-ISase在催化過程中，D272和E524的羧基參與反應(yīng)，二者羧基氧相距6.3 ?（圖3B）。因此，可以判定ISase采取保留機制，催化糖苷水解。

ISase以蔗糖為唯一底物時，表現(xiàn)出3 種主要功能：1）剪切蔗糖；2）將果糖基轉(zhuǎn)移到另一分子蔗糖上；3）延伸菊糖鏈。因此，當(dāng)ISase利用蔗糖為唯一底物時，會發(fā)生3 種連續(xù)的反應(yīng)，見圖4A。首先，蔗糖的果糖基和葡萄糖基分別結(jié)合在ISase的-1和+1位點，D272在催化過程中起到親核試劑的作用，其羧基上的羥基“攻擊”蔗糖果糖基的C2。與此同時，E524羧基上的羥基提供質(zhì)子酸，形成酶-果糖基復(fù)合體中間產(chǎn)物。D425的作用是穩(wěn)定這一過渡態(tài)中間體。其次，在水分子參與下，E524羧基上的羥基氧提供質(zhì)子堿，果糖基脫離，發(fā)生水解反應(yīng)；相反，如果另一分子蔗糖作為果糖基受體，則會發(fā)生轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，生成蔗果三糖。最后，不斷延伸的糖分子作為受體，發(fā)生聚合反應(yīng)，菊糖分子不斷延伸。關(guān)于ISase正負位點的定義可以理解為：-1位點是供體果糖基的結(jié)合位點，+1、+2……+n位點是受體糖鏈糖基結(jié)合位點。糖苷鍵的斷裂和形成，發(fā)生在-1和+1位點的交界處。

ISase和LSase具有同樣的催化活性中心構(gòu)象及活性位點，且兩種酶的反應(yīng)進程幾乎一致。因此，ISase和LSase的催化機制經(jīng)常被同時討論。目前，學(xué)者認為ISase和LSase具有同樣的催化反應(yīng)機制。保留機制僅針對糖苷鍵水解后異頭物的構(gòu)象變化而言。催化反應(yīng)過程包括兩步：蔗糖的斷裂和果聚糖的延伸，因此學(xué)者們提出了兩種不同的反應(yīng)機制來分別描述這兩個過程。

圖4 ISase的反應(yīng)機制[1,13-15]Fig.4 Reaction mechanisms of ISase[1,13-15]

如圖4A所示，ISase和LSase采取“乒乓機制”，亦稱雙置換機制剪切蔗糖，形成葡萄糖和酶-果糖基復(fù)合體中間產(chǎn)物[13]。如圖4B所示，“延續(xù)性機制”和“非延續(xù)性機制”被用來解釋高分子質(zhì)量果聚糖和低分子質(zhì)量果聚糖的形成[14-15]。在果聚糖鏈延伸的過程中，形成的果聚糖始終結(jié)合在酶上，這種糖鏈的延伸方式稱為“延續(xù)性機制”；相反，如果糖鏈在每次結(jié)合新的果糖基后都會從酶上脫落再結(jié)合，這種延伸方式稱為“非延續(xù)性機制”?！把永m(xù)性機制”下形成長鏈產(chǎn)物，而“非延續(xù)性機制”形成短鏈產(chǎn)物。

在酶分子采取雙置換機制剪切蔗糖時，3 個活性位點構(gòu)成的催化三聯(lián)體起著絕對的作用。然而，目前關(guān)于糖鏈延伸的“延續(xù)性機制”和“非延續(xù)性機制”所涉及的關(guān)鍵氨基酸殘基還沒有被揭示。

3 ISase產(chǎn)物的鏈長調(diào)控

ISase以蔗糖為唯一底物時，能夠合成菊糖。菊糖的分子質(zhì)量因ISase的微生物來源不同而存在差異。微生物菊糖的分子質(zhì)量通常比植物來源的菊糖高出100～1 000 倍。目前已經(jīng)測定出分子質(zhì)量的微生物菊糖不多，包括L.johnsoniiNCC 533（4×107Da（分子質(zhì)量，下同））[16]、Streptomyces viridochromogenesDSM 40736（2.5×107Da）[17]、Streptococcus mutansJC-2（2×107Da）[18]、Streptococcus mutansGS-5（7×107Da）[19]、L.reuteri121（＞107Da）[6]以及Lactobacillus gasseriDSM 20604（5.858×106Da）[20]。與以上只合成單一分子質(zhì)量的ISase不同，Leuconostoc citreumCW28來源的ISase合成的菊糖，其分子質(zhì)量有兩個范圍，分別是低分子質(zhì)量2.6×103～3.4×103Da和高分子質(zhì)量1.35×106～1.6×106Da。Bacillus agaradhaerensWDG185來源的ISase是目前已知僅能合成低分子質(zhì)量菊糖的ISase，合成的菊糖聚分子質(zhì)量為3×103Da[21]。Aspergillus sydowiIAM 2544是目前鑒定的唯一能合成菊糖的真菌，合成的菊糖分子質(zhì)量為7×107Da[4]。

多糖的分子質(zhì)量是影響其性質(zhì)和功能的重要因素[22-23]，植物菊糖的性質(zhì)也受分子質(zhì)量影響[24-25]。通過改變反應(yīng)條件或利用分子改造的方法，獲得特定分子質(zhì)量的菊糖，是ISase研究和應(yīng)用的方向。LSase合成左聚糖的分子質(zhì)量受到反應(yīng)條件（底物蔗糖濃度、加酶量和離子強度等）的影響[26]。分子改造是研究ISase產(chǎn)菊糖鏈長調(diào)控的主要方式。

Ozimek等[27]報道了對ISase產(chǎn)物鏈長調(diào)控的研究，通過研究L.reuteri121來源的ISase，對其-1位點上完全保守的3 個氨基酸進行單點突變，獲得3 個改變產(chǎn)物鏈長的突變體W271N、W340N和R423K。W271N和R423K除了能合成菊糖外，還能合成更多聚合度大于10的低聚果糖，但R423K不能合成聚合度6～10的低聚果糖；W340N對產(chǎn)物鏈長的影響較大，僅能合成蔗果三糖和蔗果四糖。Anwar等[28]也構(gòu)建了該酶的突變體N543，僅能合成聚合度小于6的低聚果糖，失去合成長鏈菊糖的能力。Rodríguez-Alegría等[29]通過對活性位點附近殘基進行突變，獲得3 個改變產(chǎn)物菊糖鏈長的突變體（S425A、L499F和R618K）。其中S425A和R618K失去合成高分子質(zhì)量菊糖的能力，產(chǎn)物中只有低聚果糖，表明這兩個位點可能對控制菊糖鏈的延伸起重要作用；L499F保留了合成長鏈菊糖的能力，同時產(chǎn)物中也出現(xiàn)了低聚果糖。

對于鏈長調(diào)控的研究，主要集中在對L.reuteri121來源的ISase上。酶法合成多糖的鏈長調(diào)控主要通過以下兩種方式：1）消除或減弱底物與酶結(jié)合位點的相互作用，可通過將殘基突變?yōu)楸彼岬姆绞綄崿F(xiàn)；2）阻斷底物結(jié)合和糖鏈延伸的通道，可通過將殘基突變?yōu)榉枷阕灏被岬姆绞綄崿F(xiàn)[30]。

通過對84 種糖酶的分析發(fā)現(xiàn)，在糖分子與酶的結(jié)合位點附近，與糖分子產(chǎn)生相互作用的氨基酸，80%以上是酸性氨基酸和極性氨基酸[31]。據(jù)此，Charoenwongpaiboon等[31]選擇L.reuteri121來源的ISase底物結(jié)合位點周圍、酶分子表面的一些酸性氨基酸和極性氨基酸作為突變位點，發(fā)現(xiàn)了兩個可能存在的糖鏈延伸通道：通道A（N543、W551、R483、D479、S482和D478）和通道B（N543、N561、N555和D689）。將這些氨基酸單點突變?yōu)楸彼?，以消除可能與糖鏈存在的氫鍵或極性相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些突變體合成長鏈菊糖的能力均不同程度降低；相反，卻合成了更多聚合度小于10的低聚果糖。尤其是突變體R483A，比野生酶產(chǎn)生了更多蔗果六糖（GF5）。Charoenwongpaiboon等[32]針對該位點采用計算模擬的方法進一步研究第二種鏈長調(diào)控方式的作用。只有蔗果五糖（GF4）結(jié)合到催化位點，才能經(jīng)過轉(zhuǎn)糖基作用產(chǎn)生GF5。因此，通過將GF4與突變體R483A、R483F、R483Y和R483W對接，計算結(jié)合自由能ΔGbinding，發(fā)現(xiàn)除R483W的ΔGbinding不變外，其余突變體的ΔGbinding均減小。進一步對突變體產(chǎn)物鏈長分布進行研究，發(fā)現(xiàn)4 個突變體均比野生酶產(chǎn)生了更多聚合度在4～8的低聚果糖，并且產(chǎn)物的最大聚合度均低于12。

對于ISase的產(chǎn)物鏈長調(diào)控，關(guān)鍵是找出產(chǎn)物低聚果糖結(jié)合的更深層次的位點。目前只獲得了ISase與蔗果三糖的共晶結(jié)構(gòu)，揭示了糖鏈結(jié)合的+2位點以及與糖基產(chǎn)生相互作用的氨基酸[5]。因此，獲得ISase與蔗果四糖等更高聚合度寡糖的共晶結(jié)構(gòu)，是揭示糖鏈延伸過程更深層次位點的關(guān)鍵，對產(chǎn)物鏈長調(diào)控具有重要意義。

4 ISase在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

4.1 生產(chǎn)高分子質(zhì)量菊糖

多糖的分子質(zhì)量是影響其性質(zhì)和功能的關(guān)鍵因素。微生物菊糖和植物菊糖的不同在于二者的分子質(zhì)量，但二者在性質(zhì)和功能上的差異，目前還沒有研究涉及。相關(guān)左聚糖的研究顯示了高分子質(zhì)量左聚糖在烘焙方面的優(yōu)勢[33]。面包中添加等質(zhì)量高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量的左聚糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加高分子質(zhì)量左聚糖的面包質(zhì)地更柔軟且體積更大[33]。因此，微生物菊糖的潛在價值和應(yīng)用領(lǐng)域值得進一步挖掘。

目前，工業(yè)化應(yīng)用的菊糖是植物菊糖。雖然其來源廣泛，但提取過程復(fù)雜，成品中難免會含有其他植物多糖等雜質(zhì)。酶法合成菊糖是以蔗糖為唯一底物，反應(yīng)體系中僅含有果糖、葡萄糖、蔗糖、低聚果糖等成分的一種方法，純化過程簡單，產(chǎn)物純度高。微生物菊糖的生產(chǎn)研究發(fā)現(xiàn)L.gasseriDSM 20604來源的ISase在最適條件下可產(chǎn)生53 g/L的菊糖。另外，除了蔗糖，制糖工業(yè)的副產(chǎn)品如糖蜜等，也具有作為酶法生產(chǎn)菊糖的潛力，該方法不僅能降低成本，還有利于資源的綜合利用。

4.2 生產(chǎn)低聚果糖

低聚果糖作為一種重要的益生元，具有促進腸道菌群平衡等諸多生理功能，被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域[34]。低聚果糖是菊糖形成的前期產(chǎn)物，因此，含有菊糖的植物體內(nèi)都會積累低聚果糖。目前工業(yè)生產(chǎn)的低聚果糖主要通過內(nèi)切菊粉酶水解菊糖獲得[35]，或利用呋喃果糖苷酶以蔗糖為底物獲得[36]。

通過鏈長調(diào)控的手段控制產(chǎn)物的鏈長，使ISase失去形成長鏈菊糖的能力，可以有效提高其生產(chǎn)低聚果糖的能力。通過利用生產(chǎn)低聚果糖的突變體R483A，可制備酶交聯(lián)聚集體，以50 g/L的蔗糖為底物，在優(yōu)化的條件下反應(yīng)4 h，低聚果糖的產(chǎn)量達到12 g/L[37]。利用食品級釀酒酵母蛋白表達系統(tǒng)可異源表達L.reuteri121來源的Isase，通過截斷部分序列和引入高效信號肽的方式，使ISase高效表達。分批補料發(fā)酵生產(chǎn)聚合度在2～20的中鏈低聚果糖，從300 g/L的蔗糖中獲得128.4 g/L的低聚果糖，轉(zhuǎn)化率達85.6%[38]。最近的研究表明，短鏈低聚果糖，尤其是蔗果三糖，在改善腸道環(huán)境和促進免疫系統(tǒng)方面有著比長鏈低聚果糖更顯著的作用[39]。此外，與其他短鏈低聚果糖相比，蔗果三糖在甜度、生物活性以及作為益生元等方面表現(xiàn)出更好的性能[40]。Charoenwongpaiboon等[41]通過固定化的手段提高ISase的穩(wěn)定性和循環(huán)利用效率、控制反應(yīng)條件，成功生產(chǎn)出以蔗果三糖為主要成分的低聚果糖。

4.3 生產(chǎn)新型低聚糖

根據(jù)ISase分別以H2O和蔗糖作為受體，發(fā)生水解和轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的這一進程，定義水解活力和轉(zhuǎn)糖基活力。水解活力導(dǎo)致副產(chǎn)物果糖和葡萄糖的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)糖基活力則生成菊糖。轉(zhuǎn)糖基的能力是糖基轉(zhuǎn)移酶研究和應(yīng)用的重點。通過將糖基轉(zhuǎn)移到常見的分子上，形成自然界中少有或沒有的且具有高價值的產(chǎn)物，是研究具有轉(zhuǎn)糖基能力的酶的重要方向。研究表明，ISase催化反應(yīng)過程中，除了H2O和蔗糖可以作為受體分子外，其他一些糖類也可以作為受體，從而形成新型的低聚糖。

Rodríguez-Alegría等[29]首次研究了L.citreum來源的ISase轉(zhuǎn)糖基能力，以蔗糖和木糖或蔗糖和麥芽糖作為共同底物，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)體系中，除了生成菊糖和低聚果糖外，木糖和麥芽糖也可以作為果糖基的受體，生成新型低聚糖，但其未對產(chǎn)物低聚糖進行結(jié)構(gòu)鑒定。

將ISase應(yīng)用于新型低聚糖生產(chǎn)的研究中，L.gasseriDSM 20604來源的ISase是最常用的。通過對以麥芽糖為受體生成的產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)鑒定，表明生成的麥芽糖基果糖苷的聚合度為3～6，且以α-D-吡喃葡萄糖基-(1,4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1,2)-β-D-呋喃果糖苷和β-D-呋喃果糖基-(2,6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1,4)-α-D-吡喃葡萄糖為主要轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物[42]。Díez-Municio等[43]以蔗糖和棉子糖為共底物生產(chǎn)新型低聚糖，并對產(chǎn)物低聚糖進行結(jié)構(gòu)鑒定。果糖基通過β-(2,1)糖苷鍵連接在棉子糖的果糖基上，形成聚合度為4～8的棉子糖基果糖苷——α-D-吡喃半乳糖基-(1,6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1,2)-β-D-呋喃果糖基-((1,2)-β-D-呋喃果糖苷)n，且最大產(chǎn)率為33.4%。

目前，對LSase轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的研究更加廣泛，這可能得益于LSase更加廣泛的微生物來源。許多糖類、酚類和醇都可以作為果糖基的受體，從而形成新的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物[44-46]。這些新型的低聚糖和衍生物在食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域都具有潛在的應(yīng)用價值。因此，獲得高轉(zhuǎn)糖基能力的ISase，并篩選可能的受體底物譜，對于提高ISase的應(yīng)用價值具有重要作用。

4.4 制備菊糖納米材料

建立在高分子質(zhì)量左聚糖納米材料良好性質(zhì)和應(yīng)用價值的基礎(chǔ)上[47-49]，最近，微生物菊糖納米材料的研究也不斷被報道。Jiménez-Sánchez等[50]利用L.citreum來源的ISase生產(chǎn)菊糖，形成了穩(wěn)定的球狀納米顆粒，顆粒平均直徑為112 nm。菊糖納米顆粒質(zhì)量濃度在200 μg/mL以下時，對外周血單核細胞不產(chǎn)生毒性作用。溫度對菊糖納米顆粒的形成和顆粒直徑影響顯著，此外，通過優(yōu)化溫度、蔗糖質(zhì)量濃度和加酶量等條件，能夠獲得高產(chǎn)量的菊糖納米顆粒[51]。將菊糖納米顆粒與類黃酮（槲皮素和漆黃素）復(fù)合，能增加類黃酮的溶解性、穩(wěn)定性和抗氧化活性[51]。因此，微生物菊糖納米顆?？勺鳛橐环N具有生物相容性的材料，在提高某些天然物質(zhì)溶解性和防止降解方面具有潛在的應(yīng)用前景。

5 結(jié) 語

蔗糖是自然界中廣泛存在的二糖，其價格低、易制取，是食品行業(yè)重要的甜味劑。然而，蔗糖由于致齲齒、易導(dǎo)致肥胖等特點，不能滿足人們對健康飲食的要求。ISase作為一種果糖基轉(zhuǎn)移酶，能夠以蔗糖為唯一底物生產(chǎn)具有良好性質(zhì)和功能的菊糖和低聚果糖，有潛力成為蔗糖綜合利用的重要原料。此外，ISase具有轉(zhuǎn)果糖基的能力，能夠以蔗糖為供體，以其他糖類為受體合成某些非天然有價值的糖類。目前，對ISase的研究主要集中在酶學(xué)性質(zhì)、產(chǎn)物鑒定和分子改造等方面。相比于廣泛研究的LSase，ISase仍有許多值得進一步開發(fā)的方面：1）目前只解析出一種來源ISase的晶體結(jié)構(gòu)，這很大程度上限制了學(xué)者們對ISase結(jié)構(gòu)和功能的認知。雖然通過計算輔助的理性設(shè)計和同源模擬等方式能夠在一定程度上指導(dǎo)分子改造研究，但獲得不同微生物來源ISase的晶體結(jié)構(gòu)，對ISase的結(jié)構(gòu)和功能研究更有指導(dǎo)價值；此外，獲得ISase與產(chǎn)物寡糖的共晶結(jié)構(gòu)，對于闡明糖鏈延伸機制具有重要的指導(dǎo)意義。2）受限于ISase的微生物來源較少，在性質(zhì)鑒定、酶分子結(jié)構(gòu)解析、分子改造以及受體反應(yīng)生產(chǎn)新型低聚糖等方面的研究尚不足；因此，探索新來源的ISase，尤其是有較高轉(zhuǎn)糖基能力的新型ISase，對拓展其應(yīng)用方面有重要作用。3）蔗糖是ISase的反應(yīng)底物。制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，如糖蜜等，其蔗糖含量豐富。因此，以糖蜜為底物，合成菊糖或低聚糖等研究，符合資源綜合利用和可持續(xù)發(fā)展的要求。