微凍貯藏對牛肉保水性的影響

盧 驍，董鵬程，張一敏，毛衍偉，梁榮蓉，楊嘯吟，朱立賢,，羅 欣,2,

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

溫度是決定肉品貨架期和品質(zhì)的主要因素，目前肉品保鮮主要是通過低溫貯藏抑制微生物生長繁殖和內(nèi)源酶活性實現(xiàn)的[1]。低溫保鮮因貯藏成本低廉并且對組織結(jié)構(gòu)破壞程度低而成為肉品貯藏最常用的技術(shù)手段，目前最常用的方法是冷藏和冷凍。微凍是一種溫度介于冷藏和凍藏之間的貯藏方法，通常將食品溫度控制在低于冰點1～2 ℃，在此溫度下，大多數(shù)微生物的生長繁殖受到抑制，從而達到延長食品保質(zhì)期的目的[2]。Liu Qian等[3]發(fā)現(xiàn)，-3 ℃微凍貯藏能將鯉魚醬的貨架期延長至35 d。劉明爽等[4]研究表明，4 ℃冷藏的鱸魚貨架期僅為9 d，而-2 ℃微凍貯藏樣品的貨架期可達到15 d。微凍作為一種新興的低溫貯藏方法，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品的保鮮，但是對肉類食品尤其是對牛肉的研究并不多見。

保水性是肉品最重要的品質(zhì)特性之一，也是評價肉品價值的重要指標(biāo)[5]。保水性不僅影響肉的營養(yǎng)、嫩度、多汁性和色澤等品質(zhì)特性，還會對加工肉制品的質(zhì)地、產(chǎn)量有較大影響。對于冷藏條件下的肉品來說，pH值、肌原纖維蛋白降解速率以及氧化程度是影響肌肉保水性的重要因素[6]。凍藏過程中，影響肉品保水性的因素主要是冰晶的生長和蛋白質(zhì)冷凍變性[7]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，微凍條件下牛肉的汁液損失率和蒸煮損失率均顯著高于冷藏和冷凍處理組[8]，但是目前關(guān)于微凍貯藏過程中牛肉保水性的變化還鮮有報道。因此，本研究以冷藏和冷凍貯藏為對照，從肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和水分遷移等方面分析了微凍貯藏過程中牛肉保水性的變化機制，為微凍貯藏在牛肉中的應(yīng)用和推廣提供科學(xué)理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗隨機選取4 頭18～24 月齡、體質(zhì)量620～680 kg的魯西黃牛雜交牛，經(jīng)放血屠宰后冷卻成熟48 h，取左右半胴體的腰背最長肌，然后將取下的肌肉分割成厚2.54 cm的牛排，每一塊牛排獨立真空包裝，將所有樣品置于冰上運回實驗室。

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、尿素、溴酚藍、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 北京索萊寶科技有限公司；Tris-base北京Novon Scientific公司；5,5’-二硫代-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoate，DTNB） 上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SSN11E溫度記錄儀 深圳宇問加壹傳感系統(tǒng)有限公司；AB104-S分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Mini-Protean II小型垂直電泳儀、ChemiDoc MP凝膠成像儀美國Bio-Rad公司；T18 Ultra-Turrax高速分散機德國IKA公司；SpectraMax M5酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；SU2080掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；NMI20-015V-I低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）儀 上海紐邁電子科技有限公司；BD-145HDE冷藏冷凍轉(zhuǎn)換柜 青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將樣品進行3 種貯藏處理：冷藏（2 ℃）、微凍（-4 ℃）和冷凍（-18 ℃）。在貯藏的第0、4、8、12周測定相應(yīng)指標(biāo)，微凍和冷凍貯藏的牛排在測定各項指標(biāo)之前放入4 ℃冰箱解凍24 h。

1.3.2 牛肉冰點的測定

取5 cm×5 cm×5 cm的肉樣，剔除可見脂肪和結(jié)締組織，然后將溫度記錄儀的金屬探頭插入肉樣的幾何中心，放入-18 ℃的冰柜中，每隔30 s記錄溫度的變化，當(dāng)溫度變化出現(xiàn)平臺期時，此溫度即為牛肉的冰點。

1.3.3 汁液損失率的測定

包裝前對牛排進行稱質(zhì)量（m1/g），牛排經(jīng)過貯藏后打開包裝，用濾紙擦干表面的汁液，再對其稱質(zhì)量（m2/g）。汁液損失率按公式（1）計算。

1.3.4 蒸煮損失率的測定

打開包裝后，用濾紙擦去牛排表面的汁液，稱其質(zhì)量（m1/g）。再將肉樣放入蒸煮袋中，溫度計探頭插入牛排的中心位置，然后置于80 ℃水浴鍋中，加熱至牛排中心溫度70 ℃，室溫冷卻后放于4 ℃冰箱過夜。用濾紙擦干牛排表面汁液后稱質(zhì)量（m2/g）。蒸煮損失率按公式（2）計算。

1.3.5 水分分布及核磁共振成像的測定

利用LF-NMR進行水分分布（橫向弛豫時間T2）的測定及核磁共振成像，具體參考參考孫文彬等[9]的方法，并稍作修改。

橫向弛豫時間T2的測定：儀器預(yù)熱30 min后開始使用，測試溫度為32 ℃。在測試樣品前使用標(biāo)準(zhǔn)油樣的FID序列對儀器進行校準(zhǔn)，所用FID參數(shù)為：SF＝21、TW＝2 000、NS＝4、SW＝100、RFD＝0.05、RG1＝20、DRG1＝3。肉樣沿肌纖維方向切成1 cm×1 cm×2 cm肉條，稱質(zhì)量后緩緩放入核磁試管底部，32 ℃水浴加熱至樣品恒溫，擦干管壁后進行測定。測試樣品所使用的為CPMG序列參數(shù)為：SF＝21、SW＝250、TW＝2 500、TE＝0.6、NECH＝10 000、NS＝8。

核磁共振成像：測試溫度為32 ℃，儀器預(yù)熱30 min后開始使用。測試樣品前，使用標(biāo)準(zhǔn)油樣進行校準(zhǔn)，樣品定位預(yù)掃描后進行正式成像。主要成像參數(shù)：TR＝500、TE＝20、AVERAGES＝4，成像大小為50 mm×50 mm，肉樣成像厚度為3 mm，成像方式為橫斷面，圖像保存后再進行偽彩處理。

1.3.6 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參考Liu Rui等[10]的方法，并稍作修改。取0.5 g剔除脂肪和結(jié)締組織的肉樣，加入5 mL試劑I（100 mmol/L Tris-base、10 mmol/L EDTA，pH 8.3），15 000 r/min勻漿兩次，每次30 s，然后于4 ℃、15 000×g離心40 min。倒掉上清液，向沉淀中加入5 mL試劑II（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液、0.6 mol/L NaCl，pH 6.5），勻漿后4 ℃、2 000×g離心10 min，上層溶液即為肌原纖維蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，再用試劑II將肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度調(diào)整為8 mg/mL和2 mg/mL。2 mg/mL的蛋白溶液用于測定巰基含量和蛋白質(zhì)表面疏水性。8 mg/mL的蛋白溶液與等體積試劑III（100 mmol/L Tris-base、40 g/L十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、20%丙三醇、0.8%β-巰基乙醇、0.005%溴酚藍、5 mmol/L EDTA，pH 6.8）充分混合，95 ℃金屬浴5 min，室溫冷卻后分裝樣品，-80 ℃貯存用于SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）。

1.3.7 總巰基和活性巰基含量的測定

總巰基和活性巰基含量的測定采用Fu Qingquan等[11]的方法，并略作修改。取1 mL 2 mg/mL蛋白樣品，加入9 mL緩沖液（50 mmol/L磷酸鹽緩沖液、8 mol/L尿素、0.6 mol/L氯化鉀、10 mmol/L EDTA，pH 7.0），然后加入0.4 mL 1 g/L DTNB溶液，混勻后在40 ℃反應(yīng)25 min，然后于412 nm波長處測定吸光度。測定活性巰基含量時所用的緩沖液中不加入尿素，與蛋白溶液4 ℃反應(yīng)60 min，其他步驟與測定總巰基含量相同。使用摩爾吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）來計算總巰基和活性巰基含量，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計。

1.3.8 蛋白質(zhì)表面疏水性的測定

表面疏水性的測定參考Chelh等[12]的方法，并稍作修改。取1 mL 2 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液，加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍溶液，在室溫下混合反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后樣品離心（3 000×g、15 min、4 ℃），取上清液在595 nm波長處測定吸光度。另取1 mL 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（0.6 mol/L NaCl，pH 6.5）替代肌原纖維蛋白溶液為對照組。以溴酚藍的結(jié)合量表征表面疏水性指數(shù)，具體按公式（3）計算。

1.3.9 蛋白組成的測定

SDS-PAGE的測定參考Xia Xiufang等[13]的方法，并稍作修改。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，上樣量15 μg。濃縮膠恒壓80 V電泳30 min，進入分離膠后恒壓120 V繼續(xù)電泳，直到樣品移至分離膠底部。然后用考馬斯亮藍染色1 h，脫色后拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗采用裂區(qū)設(shè)計，采用SAS 9.2系統(tǒng)中的混合模型（MIXED procedure）進行數(shù)據(jù)分析。模型中以貯藏方式、貯藏時間以及它們之間的交互作用作為固定效應(yīng)，以牛個體作為隨機效應(yīng)。采用type-3法分析固定效應(yīng)顯著性，差異顯著水平為P＜0.05。采用SigmaPlot 12.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉冰點的確定

圖1 牛肉凍結(jié)曲線Fig.1 Freezing curve of beef muscle

牛肉的凍結(jié)曲線如圖1所示，在整個凍結(jié)過程中，牛肉的中心溫度在凍結(jié)初期快速下降，當(dāng)中心溫度下降到-1.9 ℃～-2.1 ℃時出現(xiàn)了平臺期，此后溫度繼續(xù)下降，由此確定該溫度范圍為牛肉的冰點。微凍貯藏通常是將食品溫度控制在冰點以下1～2 ℃，因此本實驗選擇-4 ℃作為牛肉微凍貯藏的溫度。

2.2 牛肉貯藏過程中汁液損失率和蒸煮損失率的變化

表1 冷藏、微凍、冷凍貯藏對牛肉汁液損失率和蒸煮損失率的影響Table 1 Effects of chilled, superchilled and frozen storage on juice loss rate and cooking loss rate of beef muscle

汁液損失率和蒸煮損失率是反映肉品保水性的常用指標(biāo)。如表1所示，貯藏溫度、貯藏時間和它們的交互作用對汁液損失率和蒸煮損失率均有顯著影響（P＜0.05）。隨著貯藏時間的延長，冷藏和微凍牛肉的汁液損失率都呈現(xiàn)顯著上升的趨勢，微凍組的汁液損失率明顯高于冷藏組，而冷凍貯藏的牛肉汁液損失率在12 周貯藏期內(nèi)沒有發(fā)生顯著變化。3 種貯藏方式下牛肉的蒸煮損失率都呈現(xiàn)顯著上升的趨勢，微凍組上升速率最快，冷藏組次之，冷凍組最慢。

實驗結(jié)果表明，微凍貯藏的牛肉保水性最差。對于微凍和冷凍條件下的牛肉來說，凍結(jié)溫度越低，解凍后牛肉的保水性越好，這與李俠等[14]的結(jié)果一致。蛋白質(zhì)冷凍變性導(dǎo)致蛋白質(zhì)的水合能力下降，此外，凍結(jié)過程中形成的冰晶會對肌纖維結(jié)構(gòu)造成機械損傷，也是導(dǎo)致肌肉解凍后保水性下降的重要原因[15]。對于冷藏條件下的樣品，貯藏過程中由于鈣激活酶等內(nèi)源性蛋白酶的作用，較大程度地降解了肌原纖維蛋白，導(dǎo)致肌原纖維蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，大大減弱了肌原纖維蛋白束縛水分的能力，使得水分從肌纖維內(nèi)部向外部遷移，導(dǎo)致了汁液損失[16]。

2.3 牛肉貯藏過程中水分狀態(tài)的變化

圖2 冷藏（A）、微凍（B）、冷凍（C）貯藏對牛肉水分橫向弛豫特性的影響Fig.2 Effects of chilled (A), superchilled (B) and frozen (C) storage on transverse relaxation characteristics of water in beef muscle

LF-NMR儀通過測定肉品中氫原子核在磁場中的弛豫特性可以分析肉品中水分的分布和狀態(tài)[17]。根據(jù)橫向弛豫時間T2可以區(qū)分牛肉中不同狀態(tài)的水分，T2越大，水分自由度越高。由圖2可知，3 種貯藏方式下牛肉樣品的橫向弛豫時間T2圖譜中都出現(xiàn)了3 個特征峰，分別對應(yīng)牛肉中的結(jié)合水T21（0～10 ms）、不易流動水T22（10～100 ms）和自由水T23（100～1 000 ms），這與Cheng Shasha等[18]的研究結(jié)果一致。

表2 冷藏、微凍、冷凍貯藏對牛肉水分T2弛豫時間的影響Table 2 Effects of chilled, superchilled and frozen storage on T2 relaxation time of water in beef muscle

由表2可知，隨著貯藏時間的延長，冷藏和微凍處理組的T21、T22和T23都呈現(xiàn)上升的趨勢，說明水分流動性增加，冷藏條件下的樣品上升速率最快，微凍組次之，而冷凍樣品的結(jié)合水和不易流動水的弛豫時間沒有明顯的變化，說明貯藏溫度越低，水分的逃逸能力越差，這與栗俊廣等[19]對雞肉的研究結(jié)果基本一致。

表3 冷藏、微凍、冷凍貯藏對牛肉水分組成的影響Table 3 Effects of chilled, superchilled and frozen storage on moisture composition of beef muscle

牛肉樣品在貯藏過程中結(jié)合水、不易流動水和自由水相對含量分別用P21、P22以及P23來表示。由表3可知，冷藏條件下牛肉的結(jié)合水和不易流動水相對含量在貯藏過程中呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，自由水相對含量顯著上升（P＜0.05）；微凍貯藏過程中結(jié)合水相對含量保持穩(wěn)定，不易流動水相對含量顯著下降，自由水相對含量顯著上升（P＜0.05）；而冷凍條件下的樣品其結(jié)合水和不易流動水的相對含量在貯藏過程中均沒有出現(xiàn)顯著變化，自由水相對含量顯著上升（P＜0.05）。冷藏條件下，肌原纖維蛋白可能發(fā)生較大程度的降解，不但使蛋白質(zhì)水合能力下降，還會形成汁液損失通道，導(dǎo)致部分結(jié)合水和不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水，使自由水相對含量增加，從而導(dǎo)致汁液損失率的上升[20]。結(jié)合水是肉品中與肌原纖維蛋白結(jié)合最緊密的水分，其含量的下降表明牛肉的品質(zhì)逐漸劣變，這與冷藏牛肉較短的貨架期相吻合。在微凍貯藏過程中，肌原纖維蛋白未出現(xiàn)明顯的降解，蛋白質(zhì)功能相對完整，所以結(jié)合水的相對含量未出現(xiàn)變化；但是冰晶破壞了肌原纖維的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肌原纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中的不易流動水向自由水轉(zhuǎn)變，因此自由水的相對含量上升[21]。在冷凍貯藏過程中，肌原纖維蛋白的變性程度較小，蛋白質(zhì)的水合能力較好，因此結(jié)合水和不易流動水相對含量在貯藏過程中未出現(xiàn)顯著變化。在本實驗中，保水性較差的微凍貯藏的樣品，自由水相對含量始終保持在較高的水平。有研究表明，自由水相對含量越高，肉的保水性越差[22-23]，這與本實驗的結(jié)果相一致。

2.4 牛肉貯藏過程中核磁共振成像的變化

圖3 冷藏、微凍、冷凍貯藏對牛肉水分分布核磁共振成像的影響Fig.3 Effects of chilled, superchilled and frozen storage on magnetic resonance imaging of water distribution in beef steaks

核磁共振成像技術(shù)可以獲得肉品中H質(zhì)子的密度圖像，其能夠直觀地呈現(xiàn)出肌肉中水分的空間分布狀態(tài)。圖像越紅，說明肉品中H質(zhì)子密度越高，水分含量越高；圖像越綠，說明肉品中H質(zhì)子密度越低，水分含量越低。如圖3所示，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏方式下的牛肉核磁共振成像圖有明顯變化。貯藏初期新鮮牛肉的圖像多呈現(xiàn)紅色，說明牛肉中水分含量豐富；在貯藏中后期，冷藏和微凍貯藏的樣品較多地呈現(xiàn)綠色，說明這兩個處理組的牛肉汁液損失較多，水分含量下降；而冷凍的樣品分布有較多的紅點，說明該處理組的牛肉含水量仍然較多。這與汁液損失和水分分布的實驗結(jié)果相一致。汪春玲等[24]研究了微凍貯藏過程中羅非魚片的水分遷移規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)-4 ℃微凍貯藏的樣品核磁共振成像圖出現(xiàn)綠色，水分含量相對較低，與本研究的結(jié)果相一致。

2.5 牛肉貯藏過程中總巰基和活性巰基含量的變化

肌球蛋白和肌動蛋白是肌原纖維蛋白的主要組成部分，這兩種蛋白分子中含有大量的巰基，在貯藏過程中，肌原纖維蛋白中的巰基容易發(fā)生氧化反應(yīng)形成二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量的下降，因此，巰基含量可用于評價蛋白質(zhì)氧化的程度[25]。貯藏溫度、貯藏時間和它們的交互作用對總巰基和活性巰基含量均有顯著影響（P＜0.05）。由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，3 種貯藏方式下肌原纖維蛋白的總巰基含量和活性巰基含量均呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。貯藏初期，牛肉肌原纖維蛋白中總巰基含量和活性巰基含量分別為97.8 nmol/mg和79.0 nmol/mg，貯藏至第8周，冷藏條件下的牛肉總巰基和活性巰基含量分別下降到了39.5 nmol/mg和26.7 nmol/mg，顯著低于微凍和冷凍貯藏的樣品；微凍貯藏的樣品在第12周的總巰基和活性巰基含量分別為45.7 nmol/mg和33.7 nmol/mg；冷凍貯藏樣品在貯藏末期的總巰基和活性巰基分別為71.0 nmol/mg和50.8 nmol/mg，顯著高于微凍處理組。錢書意等[26]研究表明，牛肉的貯藏溫度越低，肌原纖維蛋白的巰基含量越高，這與本實驗的結(jié)果基本一致。

圖4 冷藏、微凍、冷凍貯藏對牛肉總巰基（A）和活性巰基（B）含量的影響Fig.4 Effects of chilled, superchilled and frozen storage on total sulphydryl (A) and free sulphydryl (B) contents in beef muscle

巰基對于肌原纖維蛋白的穩(wěn)定性起著重要作用，微凍貯藏過程中，肌原纖維蛋白總巰基和活性巰基含量的下降可能是由于冰晶破壞了肌球蛋白的構(gòu)象，暴露出分子內(nèi)部的活性巰基，進而氧化形成二硫鍵[27]。在貯藏末期，微凍條件下總巰基和活性巰基含量較低，說明微凍貯藏牛肉的蛋白質(zhì)氧化較為嚴(yán)重，降低了肌原纖維蛋白的水合能力。

2.6 牛肉貯藏過程中蛋白質(zhì)表面疏水性的變化

蛋白質(zhì)表面疏水性是評價蛋白質(zhì)變性程度的一個有效指標(biāo)，溴酚藍可以與蛋白質(zhì)的疏水性殘基結(jié)合，通過檢測溴酚藍與蛋白質(zhì)的結(jié)合量能夠反映蛋白質(zhì)表面疏水性，表面疏水性越大說明蛋白質(zhì)變性程度越高[12]。如圖5所示，貯藏溫度、貯藏時間和它們的交互作用對蛋白質(zhì)表面疏水性影響顯著（P＜0.05）。隨著貯藏時間的延長，3 種貯藏方式下蛋白質(zhì)表面疏水性均呈現(xiàn)顯著上升的趨勢，這與蘭洋[28]對兔肉的研究結(jié)果基本一致。貯藏初期，肌原纖維蛋白的溴酚藍結(jié)合量為9.0 μg，冷藏的樣品在貯藏第8周達到了18.6 μg，微凍和冷凍貯藏的樣品在貯藏末期的溴酚藍結(jié)合量分別為20.1 μg和13.6 μg。

圖5 冷藏、微凍、冷凍貯藏對牛肉蛋白質(zhì)表面疏水性的影響Fig.5 Effects of chilled, superchilled and frozen storage on protein surface hydrophobicity of beef muscle

實驗結(jié)果表明，貯藏溫度越低，越有利于延緩蛋白質(zhì)表面疏水性的上升。貯藏過程中牛肉肌原纖維蛋白由于物理或化學(xué)作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子鏈展開，使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性氨基酸殘基暴露出來，進而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的上升[29]。蛋白質(zhì)表面疏水性的上升會減弱肌原纖維蛋白的水合能力，使得部分結(jié)合水和不易流動水態(tài)變?yōu)樽杂伤?，從而造成肉品保水性的下降。本實驗中，在貯藏末期，微凍條件下樣品的溴酚藍結(jié)合量快速上升，說明肌原纖維蛋白變性程度較大，推測是微凍貯藏過程中形成的冰晶破壞了肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)，使得疏水基團和親水基團的位置發(fā)生了變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性的上升。

2.7 牛肉貯藏過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜的變化

圖6 冷藏、微凍、冷凍貯藏對牛肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜的影響Fig.6 Effects of chilled, superchilled and frozen storage on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis profile of myofibrillar protein in beef muscle

從圖6可以看出，從上到下的主要條帶依次是肌球蛋白重鏈（220 kDa）、副肌球蛋白（100 kDa）和肌動蛋白（43 kDa）。在8 周貯藏期內(nèi)，冷藏條件下的樣品在55 kDa處的蛋白條帶消失，在30 kDa和35 kDa左右產(chǎn)生了新的蛋白條帶，說明冷藏過程中牛肉肌原纖維蛋白出現(xiàn)了嚴(yán)重的降解。微凍貯藏的肌原纖維蛋白樣品降解程度較小，僅在30 kDa處發(fā)現(xiàn)了新的蛋白條帶，并且強度較低。冷凍貯藏的牛肉樣品，肌原纖維蛋白在整個貯藏期內(nèi)都未發(fā)現(xiàn)明顯的變化，說明蛋白降解程度最低。

3 討 論

有很多學(xué)者研究證實，肉品在微凍貯藏過程中保水性較差[8,30-31]。造成這一現(xiàn)象的原因主要來自兩方面，首先，在凍結(jié)過程中，肌肉中的大部分水分形成冰晶，冰晶的生長會對肌纖維產(chǎn)生壓迫作用，破壞肌纖維結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致解凍時汁液損失的增加[32]。其次，凍藏過程中肌原纖維蛋白發(fā)生冷凍變性，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與水分子間作用力減弱，從而降低了肌肉的保水性[33]。

在本實驗中，微凍貯藏牛肉的汁液損失率和蒸煮損失率顯著高于冷藏和冷凍處理組，說明微凍牛肉的保水性最差。微凍貯藏的牛肉肌原纖維蛋白在12 周貯藏期內(nèi)僅出現(xiàn)了輕微的降解，在貯藏后期肌原纖維蛋白的變性程度較高。LF-NMR結(jié)果顯示，微凍貯藏過程中牛肉的結(jié)合水相對含量沒有發(fā)現(xiàn)顯著變化，部分不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，冰晶的作用導(dǎo)致牛肉在微凍貯藏過程中肌纖維間的分離程度逐漸變大[34]，因此推測冰晶對肌纖維結(jié)構(gòu)的破壞和較高的蛋白質(zhì)變性程度提升了肌原纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中不易流動水的自由度，使得部分不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水，形成汁液損失，最終導(dǎo)致了微凍牛肉較差的保水性。冷凍貯藏的牛肉在12 周貯藏期內(nèi)肌原纖維蛋白降解程度最低，變性程度最小，使得汁液損失和蒸煮損失都處于較低的水平，LF-NMR的結(jié)果也驗證了該處理組牛肉較好的保水性。

4 結(jié) 論

微凍貯藏牛肉的汁液損失率和蒸煮損失率顯著高于冷藏和冷凍處理組，保水性最差。3 種貯藏方式下，牛肉中的水分逐漸向自由水遷移，流動性增加，其中冷藏和微凍樣品的不易流動水向自由水轉(zhuǎn)化，冷凍樣品的水分遷移程度最小。隨著貯藏時間的延長，3 種貯藏方式下牛肉的總巰基含量和活性巰基含量均顯著下降，蛋白質(zhì)表面疏水性顯著上升，貯藏溫度越低，變化速率越慢。冷藏條件下，肌原纖維蛋白發(fā)生了嚴(yán)重的降解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水合能力下降，牛肉中的部分結(jié)合水和不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水，造成汁液損失率的上升。微凍貯藏過程中，牛肉肌原纖維蛋白降解程度較低，貯藏后期肌原纖維蛋白變性程度顯著上升，提升了不易流動水的流動性，使得部分不易流動水轉(zhuǎn)化為自由水，導(dǎo)致了微凍牛肉較差的保水性。冷凍貯藏的牛肉在整個貯藏期內(nèi)肌原纖維蛋白降解程度最低，變性程度最小，使得汁液損失率和蒸煮損失率都處于較低的水平，保水性較好。