‘印度青’蘋果合成與分解代謝通量研究及貯藏溫度的優(yōu)化

袁 帥，魯丁強(qiáng)，龐廣昌

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

現(xiàn)如今低溫貯藏和化學(xué)保藏是我國水果保鮮的兩個(gè)主要技術(shù)手段[1]，它們作為傳統(tǒng)的保鮮方法技術(shù)成熟，并且隨著不斷研究，優(yōu)點(diǎn)更加明顯的生物保鮮技術(shù)逐漸成為新興的現(xiàn)代保鮮方法[2-3]。但無論利用哪種技術(shù)手段，保鮮的目的都是為了延長水果壽命、延緩腐敗，從本質(zhì)上來講就是保持水果生命活動(dòng)的情況下，最大限度地減少其分解代謝[4-6]。代謝是生物體不斷進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息交流過程所形成的網(wǎng)絡(luò)，生物體內(nèi)各種酶則控制著代謝網(wǎng)絡(luò)有序進(jìn)行[7]。溫度是影響酶活性及代謝作用最重要的因素之一[8]，低溫保鮮技術(shù)成為水果保鮮中應(yīng)用最廣泛研究最成熟的一種方法，但是在貯藏過程中溫度對代謝影響的研究則比較少[9]。

保證生物體的一切生命活動(dòng)的是能量，這種能量主要以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的形式存在。在分解代謝過程中一方面經(jīng)過糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸在有氧條件下通過三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)產(chǎn)生ATP；另一方面中間代謝物脫氫產(chǎn)生NADH和H+，通過遞氫體將其中的氫質(zhì)子和電子傳遞給氧生成水，并通過氧化磷酸化提供能量。TCA循環(huán)與氧化磷酸化都在線粒體中進(jìn)行，兩種產(chǎn)能方式都需要充足的氧氣，但當(dāng)機(jī)體內(nèi)供氧不足時(shí)，代謝中產(chǎn)生的丙酮酸與NADH、H+只能在乳酸脫氫酶催化下生成乳酸。研究表明，乳酸鹽不僅與中心代謝途徑相偶聯(lián)，還可以通過乳酸穿梭作用，作為一種信號分子影響細(xì)胞甚至機(jī)體全身的代謝，并對諸多合成與分解代謝過程（如細(xì)胞呼吸作用、氧化磷酸化、糖異生等）起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[10-12]。水果貯藏過程中沒有營養(yǎng)供給，延長貯藏期就需要盡量減少能量消耗即減少分解代謝。呼吸作用本質(zhì)上就是氧化磷酸化，因此抑制呼吸作用即可以減少分解代謝，從而達(dá)到水果保鮮的目的。乳酸鹽作為調(diào)節(jié)呼吸作用中的一種關(guān)鍵物質(zhì)，在貯藏保鮮中也發(fā)揮重要作用[13]。

水果保鮮在延長貯藏時(shí)間的同時(shí)也需要保證果實(shí)品質(zhì)，糖分構(gòu)成是影響果實(shí)品質(zhì)的重要因素[14-15]，直接影響著果實(shí)口感、風(fēng)味等特征，多種糖分中蔗糖尤其重要[16-18]。只有既延長水果的貯存時(shí)間又不影響其口感品質(zhì)的貯藏溫度才是最適貯藏溫度。因此，減少糖類的分解代謝損耗，增加蔗糖的合成代謝，在水果貯藏中尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘印度青’蘋果（Malus pumilaMill.）于天津果園采摘，選取外觀完整無損傷、無病蟲害、大小質(zhì)量相似、成熟度一致的蘋果作為實(shí)驗(yàn)材料。

4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、1,3-二磷酸甘油酸（1,3-diphosphoglycerate，1,3-BPG）、二羥基苯乙酮（dihydroxyacetophenone，DHAP） 美國Sigma公司；蔗糖比色法檢測試劑盒武漢伊萊瑞特生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；J2-21高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；HVE-50高壓滅菌器日本Hirayama Manufacturing公司；SBA-40C生物傳感器分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；Fluoroskan Ascent FL熒光-化學(xué)發(fā)光檢測儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將采摘后的‘印度青’蘋果進(jìn)行清洗擦干后放置于生化培養(yǎng)箱中，以本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[19]作參照，設(shè)置0、2、5、10、15、20、40 ℃ 7 個(gè)溫度梯度，分別貯藏24 h（‘印度青’蘋果在貯藏24 h之后可以達(dá)到在該溫度下的一種穩(wěn)定的代謝狀態(tài)[9]）。實(shí)驗(yàn)共需21 個(gè)蘋果，每個(gè)溫度設(shè)3 個(gè)平行，待貯藏24 h后取出，從中間部位橫截平面切開，從外向內(nèi)進(jìn)行取樣，將‘印度青’蘋果按圖1分為4 個(gè)部位，并分別標(biāo)記為部位1、部位2、部位3、部位4[13]，其中部位1為果皮層，部位2、3為果肉層，部位4為果核層，除果皮層外，每層取2 cm厚度，果皮層只取外周果皮及相連少許果肉。將取的樣品立即用液氮冷凍防止氧化，并在液氮條件下研磨勻漿，最后將勻漿液全部轉(zhuǎn)移入離心管，以10 000×g、4 ℃離心10 min，收集上清液，并于-80 ℃條件貯藏。

圖1 ‘印度青’蘋果4 個(gè)部位分布圖Fig.1 Schematic diagram of four parts of ‘Indian Green’ apples sampled

1.3.2 ‘印度青’蘋果乳酸鹽和蔗糖代謝網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

根據(jù)代謝網(wǎng)絡(luò)的研究方法及代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建原則[20]，選擇糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）、TCA循環(huán)和蔗糖合成途徑為主要代謝途徑來構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)，代謝過程中的多個(gè)中間代謝反應(yīng)使得網(wǎng)絡(luò)圖過為復(fù)雜，因此將直線反應(yīng)進(jìn)行合并，將不在研究范圍內(nèi)的代謝途徑忽略，減少構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)中代謝反應(yīng)數(shù)目，從而得到簡化的蔗糖乳酸鹽代謝網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。

圖2 蔗糖、乳酸鹽代謝網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Sucrose and lactate metabolic networks

表1 蔗糖、乳酸鹽代謝反應(yīng)方程式[9]Table 1 Sucrose and lactate metabolic reaction equations[9]

表2 蔗糖、乳酸鹽代謝反應(yīng)的質(zhì)量平衡方程[9]Table 2 Metabolic flux model equations of sucrose and lactate metabolic reactions[9]

根據(jù)圖2將代謝網(wǎng)絡(luò)圖中的代謝反應(yīng)方程式提取出來（表1），在整個(gè)蔗糖乳酸鹽代謝網(wǎng)絡(luò)中，有12 個(gè)需要測定的代謝速率（r1～r12），根據(jù)代謝網(wǎng)絡(luò)通量分析的原則[20]，由胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物G6P、F6P、G3P、Pyr、Ac-CoA、G1P、UDPG、SUC-6-P可確定的質(zhì)量平衡方程有8 個(gè)（表2）。假定胞內(nèi)中間途徑的代謝物的量都處于擬穩(wěn)態(tài)，也就是這8 個(gè)途徑代謝物在機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境狀態(tài)下沒有積累，它們的質(zhì)量平衡方程都為0，就可以得到關(guān)于12 個(gè)代謝速率的8 個(gè)約束向量；此時(shí)該系統(tǒng)的自由度F＝4。而代謝產(chǎn)物系統(tǒng)中的NADH的代謝速率（P＝r9-r10+r11+r12）可通過實(shí)驗(yàn)測得，乳酸鹽（Lac）代謝速率r10、蔗糖（Suc）代謝速率r7和葡萄糖（Glu）代謝速率r1也可以通過實(shí)驗(yàn)測定的，因此可以得到唯一解，進(jìn)而通過計(jì)算方程得到蔗糖和乳酸鹽的通量[21]，從而計(jì)算出所構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)圖中的每一條代謝途徑的通量。

為了提升企業(yè)人力資源管理水平，實(shí)現(xiàn)真正的“公平、公正、合理”，管理人員需要保證員工基本的福利待遇，堅(jiān)持公平的分配原則；健全綜合激勵(lì)機(jī)制，豐富激勵(lì)方式，保證人力配置與崗位標(biāo)準(zhǔn)相符合，實(shí)現(xiàn)企業(yè)的良性管理。

1.3.3 葡萄糖、乳酸鹽、NADH和蔗糖含量的測定

不同貯藏溫度的‘印度青’蘋果不同部位中葡萄糖和乳酸鹽的含量通過生物傳感器分析儀測定，蔗糖含量的測定通過蔗糖比色法檢測試劑盒測定。NADH含量的采用熒光-化學(xué)發(fā)光檢測儀通過酶法進(jìn)行測定，具體參考文獻(xiàn)[22-24]的方法，其反應(yīng)體系為0.25 mmol/L HEPES/EDTA緩沖液、100 mmol/L KCl、10 mmol/L MgSO4、3 mmol/L 1,3-二磷酸甘油酸、0.5 mmol/L DHAP、0.4 U/mL GAPDH。再按照文獻(xiàn)[20]的方法，得到代謝網(wǎng)絡(luò)圖中葡萄糖、蔗糖、乳酸鹽、NADH的通量，由于通量為單位時(shí)間與速率的乘積，而實(shí)驗(yàn)中貯藏時(shí)間是一致的，因此速率結(jié)果可近似看作通量結(jié)果，由此得到了r1、r7、r10、P。

1.4 通量系數(shù)矩陣的計(jì)算

使用Matlab軟件以及SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過表2質(zhì)量平衡方程將各個(gè)中間代謝物所對應(yīng)方程的系數(shù)提取出來（例如G6P系數(shù)為1，-1，-1，-1，0，0，0，0，0，0，0，0），建立一個(gè)系數(shù)矩陣G[20]（式（1）），該矩陣行表示可以用于擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)的8 個(gè)中間代謝物以及可測定的NADH，即9 個(gè)約束向量；列表示代謝模型中包括的12 個(gè)生化反應(yīng)，矩陣中的數(shù)值則表示相應(yīng)的化學(xué)計(jì)量系數(shù)。V表示r1～r12速率向量的方向矩陣。

整個(gè)體系處于擬穩(wěn)態(tài)下，通過矩陣G和矩陣V可以將總體化學(xué)計(jì)量方程表示出來，具體見式（3）。

對公式（3）進(jìn)行求解時(shí)，首先將G拆解成兩個(gè)子矩陣，第一個(gè)是已知終產(chǎn)物通量（r1、r7、r10、P）的系數(shù)矩陣，第二個(gè)是剩余未知中間代謝物通量的系數(shù)矩陣；然后將第二個(gè)矩陣進(jìn)行負(fù)逆矩陣處理后與第一個(gè)矩陣相乘得到一個(gè)新矩陣G’。再用G’代替G，將G’、V代入公式（3）并進(jìn)行變形可得到公式（4）。將r1、r7、r10、P的數(shù)值代入公式（4），可求得其他反應(yīng)速率，即各個(gè)反應(yīng)的通量，從而得到‘印度青’蘋果蔗糖乳酸鹽代謝通量網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘印度青’蘋果不同部位蔗糖、乳酸鹽代謝網(wǎng)絡(luò)通量圖的分析結(jié)果

圖3 ‘印度青’蘋果不同部位蔗糖、乳酸鹽通量圖Fig.3 Sucrose and lactate flux in different parts of ‘Indian Green’ apples

由實(shí)驗(yàn)測得7 個(gè)不同溫度（0、2、5、15、20、40 ℃）下貯藏的‘印度青’蘋果蔗糖、葡萄糖以及乳酸鹽的代謝速率，將其帶入平衡方程，即可得到‘印度青’蘋果蔗糖和乳酸鹽代謝網(wǎng)絡(luò)通量圖（圖3）。從代謝通量網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，在整體趨勢下，不同貯藏溫度下的‘印度青’蘋果蔗糖和乳酸鹽代謝通量有明顯不同，并且在同一溫度下不同部分的蔗糖和乳酸鹽代謝通量也有較大區(qū)別。由圖3A可知，在部位1中，在2 ℃的條件下進(jìn)入PPP的通量比其他6 個(gè)溫度均少，在該溫度下更多地流向糖酵解和蔗糖合成途徑；由丙酮酸分支來看，中間溫度（5、10 ℃和15 ℃）進(jìn)入TCA循環(huán)途徑的通量較多，有氧呼吸較強(qiáng)。蘋果作為呼吸躍變型果實(shí)，在果實(shí)成熟后存在著一個(gè)呼吸高峰，當(dāng)溫度適宜，即溫度在5、10 ℃和15 ℃時(shí)，蘋果呼吸作用會(huì)增強(qiáng)，而當(dāng)溫度降低時(shí)，呼吸作用明顯降低。

由圖3B可知，在部位2中，2 ℃和5 ℃對比其他溫度進(jìn)入PPP途徑的通量較少，其他溫度都有較高PPP途徑通量，0 ℃下進(jìn)入PPP的通量甚至超過總通量的一半。再觀察丙酮酸分支，0 ℃時(shí)進(jìn)入TCA循環(huán)途徑通量較少，而在5、10 ℃和15 ℃溫度下進(jìn)入TCA循環(huán)通量大，說明這3 個(gè)溫度下有氧呼吸較強(qiáng)。

由圖3C可知，在部位3中，2 ℃條件下進(jìn)入PPP途徑的通量甚至變?yōu)樨?fù)值，在網(wǎng)絡(luò)圖中可認(rèn)為該處反應(yīng)反向進(jìn)行，并且該溫度下進(jìn)入蔗糖途徑的通量明顯高于其他溫度；20 ℃和40 ℃下進(jìn)入PPP的通量遠(yuǎn)多于其他溫度。對于丙酮酸分支，依然遵循著中間溫度（5、10 ℃和15 ℃）進(jìn)入TCA循環(huán)途徑的通量高于其他4 個(gè)溫度。

由圖3D可知，在部位4中，2 ℃和15 ℃兩個(gè)溫度下進(jìn)入PPP途徑的通量較少，這說明這兩個(gè)溫度下合成其他物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)等的能力降低，反而進(jìn)行蔗糖合成反應(yīng)增加。再觀察丙酮酸分支，0 ℃下進(jìn)入TCA循環(huán)途徑的通量略高于2 ℃，但總體依舊呈中間溫度（5、10 ℃和15 ℃）有氧呼吸強(qiáng)度高，低溫（0 ℃和2 ℃）與高溫（20 ℃和40 ℃）有氧呼吸強(qiáng)度低的特征。

總體來說，蘋果作為呼吸躍變型果實(shí)，在適宜溫度下（5、10 ℃和15 ℃）會(huì)出現(xiàn)明顯的呼吸高峰，有氧呼吸增強(qiáng)，從而使得其分解代謝增強(qiáng)不利于貯存。隨著溫度的降低，有氧呼吸也會(huì)逐漸減弱，但并不是溫度越低呼吸越弱，在0 ℃時(shí)，由于溫度過低而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)酶活力降低，從而引起冷應(yīng)激[25]，增加分解代謝提供能量，加大酶表達(dá)量來維持生命活動(dòng)，使得有氧呼吸增強(qiáng)，不利于貯藏。在不同溫度下，‘印度青’蘋果進(jìn)入TCA循環(huán)途徑的通量都大于乳酸鹽通量，即有氧呼吸在不同溫度、不同層區(qū)中都是主要的呼吸方式。

2.2 ‘印度青’蘋果不同部位蔗糖代謝通量的分析結(jié)果

糖分構(gòu)成是影響果實(shí)品質(zhì)的一個(gè)重要的因素[26]，現(xiàn)有研究表明，蘋果果實(shí)中糖分的積累受韌皮部卸載、跨膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝及相關(guān)酶活性等方面的調(diào)控[27]，其中蔗糖是參與蘋果果實(shí)中糖卸載的一種重要物質(zhì)，并且還是細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)因子[28]，可能通過影響基因表達(dá)發(fā)揮作用；因此蔗糖在與蘋果品質(zhì)形成有關(guān)的代謝中起著重要作用[29]。

圖4 不同溫度下‘印度青’蘋果4 個(gè)部位的蔗糖通量Fig.4 Sucrose flux in four parts of ‘Indian Green’ apples at different storage temperatures

從圖4可以看出，2 ℃時(shí)蔗糖通量明顯高過其他溫度，且此溫度下果肉部分（部位3與部位2）的蔗糖通量高于其他部位。按照溫度變化來看，部位1～4蔗糖通量的方差分別為：4.257、7.376、8.626和2.250，可以看出部位4即靠近果核部位蔗糖通量變化最小，最穩(wěn)定，對溫度變化不敏感。部位2、3即果肉部位蔗糖通量受溫度影響大，并且在2 ℃時(shí)出現(xiàn)最大值，顯然該溫度下利于葡萄糖流向蔗糖這一代謝途徑。蔗糖作為蘋果中一種重要的糖分構(gòu)成，對蘋果貯藏期各種代謝物的協(xié)調(diào)交流起著重要作用[16]，同時(shí)也影響著果實(shí)的品質(zhì)。因此降低葡萄糖的分解代謝，增加蔗糖的合成代謝就意味著可以延長蘋果的貯藏時(shí)間。綜上，2 ℃時(shí)蔗糖合成的通量更多，是‘印度青’蘋果更合適的貯藏溫度。

2.3 ‘印度青’蘋果不同部位乳酸鹽代謝通量的分析結(jié)果

乳酸鹽可以通過單羧酸運(yùn)載體在組織、細(xì)胞中穿梭運(yùn)輸[30]，并調(diào)節(jié)機(jī)體合成與分解代謝以及呼吸作用。葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸則會(huì)在線粒體中被徹底氧化產(chǎn)生能量以及水和二氧化碳，但當(dāng)呼吸作用受到抑制時(shí)，丙酮酸會(huì)轉(zhuǎn)化為乳酸，并通過乳酸穿梭作用到達(dá)機(jī)體其他部位而被利用。因此，高的乳酸鹽通量可以作為氧化呼吸代謝受限制的標(biāo)志，也可以說明部分合成代謝的增強(qiáng)。在‘印度青’蘋果的貯藏中，需要減少其呼吸作用，從而延長其保存期限。

圖5 不同溫度下‘印度青’蘋果4 個(gè)部位的乳酸鹽通量Fig.5 Lactate flux in four parts of ‘Indian Green’ apples at different storage temperatures

由圖5可以看出，2 ℃條件下乳酸鹽通量最高。在生物體內(nèi)存在著持續(xù)的能量、物質(zhì)交換，這些交換越少說明機(jī)體越穩(wěn)定，存活時(shí)間也就越長?！《惹唷O果在貯藏過程中，表皮接觸空氣而果核則不能接觸空氣，這就會(huì)使得各個(gè)部分之間呼吸作用具有差異，這種呼吸作用差異的出現(xiàn)就會(huì)使各個(gè)部分間乳酸鹽通量產(chǎn)生差異。0、2、5、10、15、20、40 ℃條件下4 個(gè)部位乳酸鹽通量的方差分別為0.345 1、0.005 2、0.224 9、0.033 4、0.212 6、0.021 8、0.01 31。方差越低說明各個(gè)部位間的乳酸鹽通量差異越小，呼吸交換越少，狀態(tài)越穩(wěn)定，可以看出在2 ℃下方差最小，10、20 ℃和40 ℃方差也都較小，但0、20 ℃和40 ℃下乳酸鹽通量低，說明在這3 個(gè)溫度下，雖然機(jī)體到達(dá)平衡但處于高呼吸作用下，不利于貯藏。通過乳酸鹽通量及其方差綜合來看，2 ℃時(shí)乳酸鹽通量高，且各部位之間差異小，機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)，有利于限制呼吸作用，從而更好地減小蘋果的呼吸高峰值，使貯藏時(shí)間延長。

3 討 論

本研究進(jìn)行了不同溫度下‘印度青’蘋果的蔗糖和乳酸鹽代謝網(wǎng)絡(luò)通量分析，結(jié)果表明：在2 ℃時(shí)‘印度青’蘋果的蔗糖合成通量較高，部位1～4分別為32、42、47和33，糖分解代謝水平較低，并且部位2、3蔗糖合成通量最高，使其口感品質(zhì)在貯藏期間仍維持在較高水平。蘋果是典型的呼吸躍變型果實(shí)，而乳酸鹽在水果的貯藏保鮮中發(fā)揮重要作用[31]，它的通量反映了呼吸代謝的受限狀態(tài)和合成代謝的增強(qiáng)情況，在2 ℃條件下乳酸鹽通量在‘印度青’蘋果的各個(gè)部位都處于較高的水平，部位1～4分別為1.87、1.86、1.86和1.86，此溫度下貯藏更有利于降低呼吸代謝，延緩呼吸高峰出現(xiàn)的時(shí)間。植物在成長過程中CO2在葉綠體內(nèi)經(jīng)過卡爾文循環(huán)轉(zhuǎn)化為糖[32]，從而產(chǎn)生糖的累積。而在貯藏階段，果實(shí)中的糖分不能通過光合作用補(bǔ)給，為使‘印度青’蘋果長期貯藏依然保持良好口感就需要糖異生的過程，將蘋果酸、甘梨醇等轉(zhuǎn)化為糖[33]，通過實(shí)驗(yàn)中乳酸鹽、蔗糖通量比較，乳酸鹽也可能通過糖異生過程轉(zhuǎn)化為蔗糖，降低呼吸作用，使果實(shí)產(chǎn)生的乳酸也可能會(huì)反饋為蔗糖，從而保持‘印度青’蘋果長時(shí)間貯藏及良好口感。綜合蔗糖代謝通量以及乳酸鹽代謝通量可以得出，2 ℃是‘印度青’蘋果的最適貯藏溫度。這一結(jié)論也與諸多品種蘋果貯藏溫度范圍的研究結(jié)果[34-36]相一致。實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果可為今后水果貯藏保鮮的條件優(yōu)化提供新的研究思路，并從代謝這一整體角度為水果貯藏保鮮提供新的參考。