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    核桃低聚肽對大鼠胃黏膜損傷的保護(hù)作用

    2021-05-19 02:22:24郝云濤劉欣然康家偉毛瑞雪胡佳妮于曉晨
    食品科學(xué) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:乳清無水乙醇奧美拉唑

    劉 睿,珠 娜,郝云濤,劉欣然,康家偉,毛瑞雪,胡佳妮,于曉晨,李 臻,李 勇

    (北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院,北京 100191)

    乙醇攝入體內(nèi)后,通過食管進(jìn)入胃與小腸,大約有20%可以通過胃黏膜被吸收,大部分通過小腸吸收入血液,吸收入血液的乙醇可以迅速分布于全身組織。乙醇進(jìn)入消化道后,會對消化道黏膜造成損傷,其中以胃出血、胃潰瘍最為常見。因此,飲酒人群的消化道疾病的發(fā)病率明顯高于非飲酒人群。世界衛(wèi)生組織報告顯示,2016年酒精造成了全球約300萬 人死亡(男性約230萬、女性約70 萬),占所有死亡人數(shù)的5.3%,而在可歸因于飲酒的死亡人數(shù)中,消化系統(tǒng)疾病所占比例為21.3%,對全球公共衛(wèi)生造成了巨大負(fù)擔(dān)[1]。隨著酒精消費和飲酒人數(shù)的增加,乙醇相關(guān)胃黏膜損傷性疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。但現(xiàn)有臨床治療藥物多存在療效不佳、副作用大、易復(fù)發(fā)和需長期使用等弊端。因此,從營養(yǎng)治療的角度出發(fā),尋找安全、有效、能保護(hù)胃黏膜免受有害因素侵襲的功效成分,具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

    近年來,生物活性肽,尤其是來源于食品的外源性生物活性肽,因其易被機體吸收、獨特的生理活性和安全且無毒副作用的特性已逐漸引起了研究者的關(guān)注[3-6]。已有文獻(xiàn)報道,幾種肽類物質(zhì)如乳清蛋白和膠原蛋白水解產(chǎn)物[7]、鱈魚皮膠原肽[8]、水解小麥蛋白肽[9]、小分子大豆多肽[10]等對胃黏膜損傷均有一定的保護(hù)作用。核桃低聚肽(walnut oligopeptides,WOPs)是利用生物酶解技術(shù)從核桃中提取的小分子生物活性肽,主要是由分子質(zhì)量很小但活性很高的短肽分子組成,前人研究已證實WOPs具有提高記憶力[11]、抗輻射[12]、潤腸通便[13]、提高性功能[14]、抗疲勞[15]及輻射防護(hù)[16-17]等多種作用,但目前尚缺乏針對胃黏膜損傷性疾病的研究報道。因此,本實驗將在既往研究的基礎(chǔ)上,建立無水乙醇誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷模型,探討WOPs對大鼠胃黏膜損傷的保護(hù)作用及其可能機制,為胃黏膜損傷疾病的防治和WOPs的開發(fā)利用提供理論和實驗依據(jù)。此外,由于本課題組前期在小鼠背部皮膚切口手術(shù)模型中發(fā)現(xiàn)牛骨膠原低聚肽(bovine collagen oligopeptides,BCOPs)具有一定的促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用,其機制可能與提高小鼠營養(yǎng)狀況、抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子分泌有關(guān)[18-19],因此,本實驗設(shè)置了BCOPs與WOPs的配伍組,以探討它們配伍后對胃黏膜損傷的聯(lián)合保護(hù)效應(yīng)。

    1 材料與方法

    1.1 動物、材料與試劑

    80 只健康雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心,使用許可證號:SYXK(京)2016-0041;生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0010。

    WOPs購自吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司。通過高效液相色譜法分析WOPs分子質(zhì)量及氨基酸組成,分子質(zhì)量小于1 000 Da的低聚肽占86.5%,小于2 000 Da的肽類比例高達(dá)96.5%,游離氨基酸含量為2.98 g/100 g,其中精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸含量較高。

    BCOPs由吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司提供,用凱氏定氮儀測定其肽含量為92.77 g/100 g、酸溶蛋白含量為95.5 g/100 g。由高效液相色譜儀分析其游離氨基酸組成,發(fā)現(xiàn)氨基酸總量占2.73%,其中精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸含量較高。

    無水乙醇(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、肌酐(creatinine,CR)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)試劑盒 英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司;胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)、黏蛋白(mucin,MUC)、胃泌素(gastrin,GAS)試劑盒 北京麥格泰克科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    AdventurerTM通用型分析天平 美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司;LXJ-IIC低溫高速離心機 德國Eppendorf公司;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海創(chuàng)奕科教設(shè)備有限公司;FSH-2A可調(diào)高速電動勻漿機 金壇市金南儀器廠;AU400全自動生化儀 英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司;FLUOstar Omega多功能酶標(biāo)儀 德國BMG Labtech公司;JEM-100CXII透射電子顯微鏡日本電子株式會社。

    1.3 方法

    1.3.1 實驗動物分組與處理

    本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),WOPs以440 mg/kgmb劑量灌胃實驗動物時,表現(xiàn)出較好的提高學(xué)習(xí)記憶、抗疲勞和增強免疫力的效果[11,15]。因此,本實驗在此基礎(chǔ)上,以440 mg/kgmb為中間劑量,設(shè)置了低、中、高3 個WOPs劑量組,以進(jìn)一步探索WOPs的最佳干預(yù)劑量。此外,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)BCOPs以1.5 g/kgmb的劑量進(jìn)行干預(yù)時,表現(xiàn)出較好的促進(jìn)皮膚傷口愈合的效果,因此選擇該劑量為與WOPs的配伍劑量。本實驗除設(shè)立蒸餾水對照組外,還設(shè)置了乳清蛋白作為蛋白質(zhì)對照組,乳清蛋白是一種營養(yǎng)價值較高的優(yōu)質(zhì)蛋白,所含必需氨基酸種類齊全、數(shù)量充足且比例適當(dāng),具有抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能;并選用臨床常用質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑作為陽性藥物對照組,其干預(yù)劑量是根據(jù)藥物說明書按人推薦服用劑量通過體質(zhì)量比例換算得出。

    實驗大鼠飼養(yǎng)在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部屏障環(huán)境,溫度為(22±2)℃,相對濕度為50%~60%,晝、夜明暗交替時間為12 h/12 h。動物實行分籠飼養(yǎng),每籠3 只,自由飲水、進(jìn)食。在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,根據(jù)體質(zhì)量將大鼠隨機分為8 組:正常對照組、模型對照組、乳清蛋白組(440 mg/kgmb)、陽性藥物組(奧美拉唑,20 mg/kgmb)和3 個WOPs低、中、高劑量干預(yù)組(分別為220、440、880 mg/kgmb)和1 個配伍組(WOPs 440 mg/kgmb+BCOPs 1.5 g/kgmb),每組10 只。正常對照組和模型對照組給予蒸餾水,乳清蛋白組、奧美拉唑組、WOPs劑量組和配伍組給予相應(yīng)劑量受試物,灌胃量為1 mL/100 gmb。動物每周稱體質(zhì)量兩次,灌胃干預(yù)時間為30 d。

    1.3.2 胃黏膜損傷模型建立

    灌胃30 d后,所有大鼠嚴(yán)格禁食24 h(不禁水)。于末次給藥1 h后,除正常對照組外,所有實驗組大鼠給予無水乙醇5 mL/kgmb灌胃造模,正常對照組灌胃等量生理鹽水[20-21]。1 h后,乙醚麻醉處死動物,股動脈采血,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,吸取上清液保存,快速剖腹取出全胃,進(jìn)行指標(biāo)的測定。

    1.3.3 胃黏膜損傷觀察及評分

    將胃組織沿胃大彎剪開,冰凍生理鹽水洗凈胃內(nèi)容物,用游標(biāo)卡尺測量出血點或出血帶的長度和寬度,并對胃黏膜損傷進(jìn)行評分,指標(biāo)包括各實驗組胃黏膜損傷程度以及損傷發(fā)生率(按公式(1)計算)、損傷積分指數(shù)和損傷抑制率(按公式(2)計算)。

    損傷積分指數(shù)根據(jù)下述評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計算:正常胃黏膜為0 分,損傷長度<1 mm(包括糜爛點)為1 分,1~2 mm為2 分,2~3 mm為3 分,3~4 mm為4 分,損傷長度>4 mm分段測量;若損傷寬度>2 mm,分?jǐn)?shù)乘以2;全胃損傷分?jǐn)?shù)之和為該動物的損傷積分指數(shù)[22-23]。

    式中:A為模型對照組的損傷積分指數(shù);B為乳清蛋白組、奧美拉唑組、WOPs劑量組和配伍組的損傷積分指數(shù)。

    1.3.4 大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

    取胃組織樣本(長約2 mm、寬約1 mm)放入體積分?jǐn)?shù)3%的戊二醛溶液中4 ℃固定2 h后,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%四氧化鋨常溫固定1.5 h,用醋酸雙氧鈾染色1 h后,采用體積分?jǐn)?shù)50%~100%的乙醇逐級脫水(各15 min),并用無水乙醇/純丙酮(體積比1∶1)、純丙酮各脫水10 min后,將組織浸入環(huán)氧樹脂/純丙酮(體積比1∶1)中2 h進(jìn)行滲透,隨后采用環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋,聚合后,用超薄切片機進(jìn)行切片(50~70 nm),切片經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色,干燥,最后在電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。

    1.3.5 血清生化指標(biāo)測定

    使用全自動生化儀按試劑盒說明書測定血清ALT、AST、CR、CK水平。

    1.3.6 胃組織中PG、GAS、MUC質(zhì)量濃度的測定

    取各組大鼠相同部位胃組織,勻漿后采用酶聯(lián)免疫吸附法,根據(jù)試劑盒說明書測定PG(PGI、PGII)、GAS、MUC的質(zhì)量濃度。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    實驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。單因素方差分析采用最小顯著性差異法進(jìn)行組間的統(tǒng)計檢驗,以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 WOPs對大鼠體質(zhì)量的影響

    在30 d的實驗周期內(nèi),各實驗組大鼠外觀體征和行為活動、糞便性狀、食量等均未見異常,無中毒體征及死亡。如圖1所示,WOPs灌胃干預(yù)30 d后,各組間動物體質(zhì)量未見明顯差異。

    圖1 WOPs對大鼠初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量的影響Fig.1 Effects of WOPs on initial body mass and final body mass of rats

    2.2 WOPs對無水乙醇模型大鼠胃黏膜損傷評分的影響

    大鼠無水乙醇5 mL/kgmb灌胃造模后,各組大鼠胃黏膜組織均出現(xiàn)不同程度的損傷,損傷發(fā)生率達(dá)到100%,其中模型對照組大鼠胃黏膜損傷最為嚴(yán)重,損傷積分指數(shù)顯著高于WOPs各組(P<0.05,P<0.01)。與模型對照組相比,其余各組大鼠胃黏膜損傷情況明顯減輕,WOPs高劑量組大鼠的胃黏膜損傷抑制率達(dá)到57.39%,高于其他各組。與乳清蛋白組相比,WOPs各組胃損傷積分指數(shù)均降低,損傷抑制率升高,其中WOPs高劑量組損傷積分指數(shù)與乳清蛋白組相比差異極顯著(P<0.01)。奧美拉唑組的干預(yù)劑量是根據(jù)藥物說明書按人推薦服用劑量通過體質(zhì)量比例換算得到的,在此劑量下大鼠胃損傷積分指數(shù)低于模型對照組,但差異并不顯著(P>0.05),損傷抑制率僅為12.79%。WOPs高劑量組和WOPs+BCOPs配伍組的損傷積分指數(shù)顯著低于奧美拉唑組(P<0.01,P<0.05)。

    表1 WOPs對無水乙醇模型大鼠胃黏膜損傷評分(n=10)Table 1 Gastric mucosal injury evaluation of absolute ethanol-induced model rats administered with WOPs (n= 10)

    2.3 WOPs對無水乙醇模型大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

    圖2 大鼠胃黏膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察(×10 000)Fig.2 Observation on the ultrastructure of rat gastric mucosa (× 10 000)

    如圖2所示,正常對照組的大鼠胃黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞核呈圓形,核內(nèi)染色質(zhì)分布基本均勻,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富,嵴短小,細(xì)胞內(nèi)可見較多堆疊排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖2A);模型對照組的大鼠胃黏膜壁細(xì)胞及主細(xì)胞明顯腫脹,壁細(xì)胞數(shù)量增多、體積較大,核內(nèi)常染色質(zhì)稀疏,線粒體腫脹,部分線粒體嵴溶解、消失,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少、呈囊泡化(圖2B);乳清蛋白組(圖2C)和奧美拉唑組(圖2D)的胃黏膜壁細(xì)胞及主細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,壁細(xì)胞輕度腫脹,細(xì)胞核呈圓形,核內(nèi)染色質(zhì)輕度凝集,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富,輕度腫脹;WOPs各劑量組隨劑量的增加,胃黏膜壁細(xì)胞及主細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸趨于正常,細(xì)胞腫脹度減輕,細(xì)胞核形狀逐漸規(guī)則,核內(nèi)染色質(zhì)均勻,線粒體腫脹度逐漸減輕,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富(圖2E~G);配伍組胃黏膜壁細(xì)胞及主細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于正常,細(xì)胞核形狀較為規(guī)則,核內(nèi)線粒體腫脹度較輕(圖2H)。

    2.4 WOPs對無水乙醇模型大鼠血清生化指標(biāo)的影響

    血清ALT、AST水平可以敏感地反映肝細(xì)胞功能狀態(tài),如圖3所示,與正常對照組相比,模型對照組大鼠血清ALT、AST水平均極顯著上調(diào)(P<0.01);與模型對照組相比,WOPs低、中、高劑量組及WOPs+BCOPs配伍組ALT水平顯著下調(diào)(P<0.05,P<0.01),WOPs高劑量組及WOPs+BCOPs配伍組AST水平顯著下調(diào)(P<0.05);CK、CR水平在各實驗組間無顯著性差異(P>0.05)。

    圖3 WOPs對大鼠血清生化指標(biāo)ALT、AST、CK活力和CR濃度的影響Fig.3 Effects of WOPs on serum ALT, AST, CK and CR levels of rats

    2.5 WOPs對大鼠胃組織PG、MUC及GAS質(zhì)量濃度的影響

    圖4 WOPs對大鼠胃組織PGI、PGII、PGR(PGI/PGII)、MUC和GAS質(zhì)量濃度的影響Fig.4 Effects of WOPs on gastric PGI, PGII, PGR (PGI/PGII), MUC and GAS levels of rats

    如圖4所示,與正常對照組相比,模型對照組大鼠胃組織PGI、PGII及GAS質(zhì)量濃度極顯著增加,MUC質(zhì)量濃度極顯著降低(P<0.01);與模型對照組相比,乳清蛋白組、奧美拉唑組和WOPs各劑量組PGI、PGII及GAS質(zhì)量濃度均極顯著降低,MUC質(zhì)量濃度極顯著增加(P<0.01);與乳清蛋白組相比,PGI質(zhì)量濃度、PGR(PGI/PGII)在WOPs各劑量組,PGII質(zhì)量濃度在WOPs低劑量組均極顯著增加(P<0.01),PGII質(zhì)量濃度在WOPs中、高劑量組及MUC質(zhì)量濃度在WOPs高劑量組、WOPs+BCOPs配伍組顯著降低(P<0.05,P<0.01);與奧美拉唑組相比,WOPs各劑量組的PGI、GAS質(zhì)量濃度和PGR均極顯著增加(P<0.01),PGII質(zhì)量濃度在WOPs中、高劑量組,MUC質(zhì)量濃度在WOPs中、高劑量組及WOPs+BCOPs配伍組均極顯著降低(P<0.01)。

    3 討 論

    動物實驗是研究酒精性胃損傷的常用方法,用無水乙醇對大鼠進(jìn)行灌胃,可導(dǎo)致大鼠腺胃部條狀損傷。本實驗通過建立無水乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷動物模型,來探討WOPs對胃黏膜損傷性疾病的可能作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過無水乙醇染毒的大鼠胃黏膜都出現(xiàn)不同程度的損傷,損傷發(fā)生率達(dá)到100%,其中模型對照組大鼠胃黏膜損傷最為嚴(yán)重,多見黏膜條索狀及片狀出血,表明乙醇具有強烈的胃黏膜損傷效應(yīng),這與Raish[22]和El-Maraghy[23]等的研究結(jié)果一致。WOPs干預(yù)后胃黏膜損傷情況隨劑量的增加得到明顯改善,表現(xiàn)在條索狀出血較少,寬度縮窄,其中WOPs高劑量組主要以點狀出血為主,損傷抑制率達(dá)到了57.39%,損傷積分指數(shù)極顯著低于奧美拉唑組和乳清蛋白組(P<0.01),說明WOPs在一定程度上可以改善乙醇引起的胃黏膜充血、水腫、糜爛和腺體受損等病理損傷,對乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷具有較好的保護(hù)作用。此外,血清ALT、AST水平是評價早期肝功能損傷的最為敏感的指標(biāo),當(dāng)肝細(xì)胞被破壞時,轉(zhuǎn)氨酶便會進(jìn)入血液,血清或血漿中轉(zhuǎn)氨酶的活力可反映肝細(xì)胞受損情況[24]。本實驗發(fā)現(xiàn)WOPs對酒精引起的ALT、AST水平上調(diào)有顯著的抑制作用,提示W(wǎng)OPs對酒精誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷有潛在的保護(hù)作用,值得進(jìn)一步探索研究。

    乙醇能上調(diào)胃壁細(xì)胞中H+-K+-ATP酶的表達(dá),促進(jìn)胃蛋白酶的分泌,這是胃黏膜損傷的關(guān)鍵因素之一[24]。PG由主細(xì)胞分泌,且是蛋白酶的無活性前體,可分為PGI和PGII兩種類型,它們可在胃酸的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘奈傅鞍酌竅25]。PGI、PGII質(zhì)量濃度及它們的比值PGR(PGI/PGII)可以反映胃黏膜的形態(tài)和功能狀態(tài),當(dāng)PGI、PGII質(zhì)量濃度及PGR升高時,可認(rèn)為患有胃黏膜損傷性疾病的概率較高,此外PGR還可以用來監(jiān)測萎縮性胃炎的發(fā)生進(jìn)展[26]。GAS可以通過刺激胃酸的分泌從而改變胃黏膜壁的通透性,加速損傷形成。MUC是胃黏膜表面形成保護(hù)性黏液層的關(guān)鍵性糖蛋白成分,由上皮細(xì)胞分泌的中性糖蛋白可以在上皮表面形成一層黏液層,可保護(hù)上皮細(xì)胞免受高濃度酸性胃液的侵蝕。乙醇可通過抑制MUC合成中的關(guān)鍵酶——半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性,從而減少乙醇脫氫酶和MUC的合成[27]。本實驗結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型對照組PGI、PGII和GAS質(zhì)量濃度極顯著升高,MUC質(zhì)量濃度極顯著降低(P<0.01)。而WOPs干預(yù)顯著改善了這一變化,與模型對照組相比,WOPs干預(yù)減少了PGI、PGII及GAS的分泌,促進(jìn)了MUC合成,表明WOPs能夠?qū)挂掖家鸬腗UC分泌的減少和胃蛋白酶及GAS的過度分泌,從而保護(hù)由酒精引起的胃黏膜屏障生理環(huán)境的失衡,減少胃酸及各種刺激因子對胃黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的損傷,從而減輕乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷。

    綜上,WOPs對乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷具有較好保護(hù)作用,其保護(hù)機制可能與增加胃組織MUC質(zhì)量濃度,降低胃蛋白酶活性和減少GAS的合成有關(guān),這為WOPs應(yīng)用于胃黏膜損傷性疾病的預(yù)防和臨床輔助治療提供了依據(jù)。但現(xiàn)階段關(guān)于WOPs的研究多停留在動物實驗階段,以后研究還需在現(xiàn)有基礎(chǔ)上,繼續(xù)優(yōu)化劑量設(shè)置,并在體外研究和人群研究中進(jìn)一步證實其作用機制及適宜劑量,以期為WOPs在人群中的應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

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