黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎BALB/c小鼠炎癥反應(yīng)的影響

崔曉諭，鄭紅英，綦占文，林長青，吳笑天，郭建鵬,

（1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133002；3.延邊韓工坊健康制品有限公司，吉林 延吉 133000；4.延邊大學(xué)融合學(xué)院，吉林 延吉 133002）

黑蒜又稱黑大蒜、發(fā)酵黑蒜，是將新鮮帶皮的大蒜經(jīng)過酶解、熟化和干燥等過程制得[1]。大蒜既是普通食品又是傳統(tǒng)中藥材，作為藥材使用最早見于《名醫(yī)別錄》，《中國藥典》收載其功能為解毒、消腫、殺蟲、止痢。黑蒜中保留了大蒜原有的大部分成分，并提高了多種微量元素的含量[2]，具有抗菌譜廣、殺菌能力強(qiáng)的特點，同時兼具抗腫瘤、抗血小板凝集等多種藥理作用[3-4]。

潰瘍性結(jié)腸炎是炎癥性腸病的一種亞型，是一種影響結(jié)腸健康狀態(tài)的慢性特發(fā)性炎性疾病[5]。潰瘍性結(jié)腸炎患者多表現(xiàn)為大便充血和腹瀉，患者長期處于慢性炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)或營養(yǎng)不良。研究表明，在全世界范圍內(nèi)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率正在增加，已成為一種全球性疾病[6-9]。

目前認(rèn)為，促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子平衡的失調(diào)是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的重要機(jī)制[10-11]?；诖?，潰瘍性結(jié)腸炎的治療方法主要包括抗炎和免疫抑制，其主要目的是減輕炎癥反應(yīng)和抑制免疫反應(yīng)。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是公認(rèn)的能介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的促炎細(xì)胞因子，TNF-α的表達(dá)量可以作為反映潰瘍性結(jié)腸炎疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[12-14]。現(xiàn)階段，臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎通常采用美沙拉秦和皮質(zhì)類固醇等藥物，這些藥物因其免疫抑制和短期愈合的特性，具有較強(qiáng)的副作用，不適于長期使用。因此，尋求一種副作用小且安全、有效的天然替代品對于炎癥性腸病的防治具有重要意義。

此前，已有學(xué)者證明了黑蒜具有提高BALB/c小鼠免疫功能的作用[15]。本實驗通過葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，考察黑蒜對小鼠炎癥評價指標(biāo)的影響，為黑蒜在預(yù)防或輔助治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康SPF級BALB/c雌性小鼠，6 周齡，體質(zhì)量為18～21 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2015-0001。

黑蒜 延邊韓工坊健康制品有限公司。

DSS（Lot：D5906810） 上海翊圣生物科技有限公司；美沙拉秦緩釋顆粒 上海愛的發(fā)制藥有限公司；米吐爾 上海源葉生物科技有限公司；冰醋酸、過氧化氫溶液 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；TNF-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β檢測試劑盒南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠 武漢塞維爾生物科技有限公司；17590-1-AP TNF-α抗體 武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式高速冷凍離心機(jī) 湖北平凡科技有限公司；Synergy HTX酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek儀器公司；Eclipse Ci顯微鏡（配備Digital Sight DS-FI2成像系統(tǒng)） 日本Nikon公司；TP-A2000電子天平 福建華志電子科技有限公司；BSA224S電子分析天平 德國Sartorius公司；BV-2垂直電泳儀、BT-2轉(zhuǎn)印電泳儀 武漢塞維爾生物科技有限公司；JY92-11N超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 受試物制備及灌胃劑量計算

黑蒜經(jīng)水提取后，收集提取液，濃縮至料液比1∶1，作為受試物。按照中國成年男女平均體質(zhì)量70 kg計，根據(jù)人體每日推薦劑量計算，設(shè)置低、中、高劑量進(jìn)行動物灌胃實驗，分別為成人日攝入劑量的0.5、1、2 倍，計算后灌胃劑量分別為0.39、0.78、1.56 g/（kgmb·d）。

1.3.2 實驗動物分組及造模

將36 只BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為6 組：正常組、模型組和黑蒜低、中、高劑量組以及陽性對照組，每組6 只。正常組小鼠正常飲用蒸餾水，其余各組小鼠自由飲水?dāng)z入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% DSS溶液，連續(xù)7 d，建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。造模成功后，黑蒜低、中、高劑量組小鼠分別按0.39、0.78、1.56 g/（kgmb·d）劑量灌胃黑蒜水提取液，陽性對照組小鼠按0.195 g/（kgmb·d）劑量灌胃美沙拉秦緩釋顆粒，正常組、模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水。連續(xù)灌胃給藥10 d。

1.3.3 樣本采集

灌胃0～7 d期間，每天采集小鼠糞便留樣，進(jìn)行隱血及血便檢測。最后一次灌胃24 h后，小鼠眼球取血，室溫下靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清分裝，-20 ℃保存待測。取小鼠結(jié)腸組織，用生理鹽水清洗后濾紙吸干，測量結(jié)腸長度后放入裝有體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林固定液的EP管中。

1.3.4 隱血及血便檢測

通過硫酸甲氨基酚法檢測血便。取少量小鼠糞便置于玻片中央，滴加10 mg/mL硫酸甲氨基酚-乙酸溶液3 滴，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫溶液3 滴，立即觀察結(jié)果[16]。

1.3.5 小鼠一般情況觀察及體質(zhì)量、疾病活動指數(shù)測定

實驗全程觀察小鼠的精神及活動情況，記錄體質(zhì)量并按下式計算體質(zhì)量變化率。

參照Cooper等[17]的方法按表1所示評分標(biāo)準(zhǔn)計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分。

表1 小鼠DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for DAI evaluation of mice

1.3.6 小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β質(zhì)量濃度的測定

取一定量小鼠血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定TNF-α、IL-6、IL-1β質(zhì)量濃度。

1.3.7 免疫印跡法檢測小鼠結(jié)腸組織中TNF-α表達(dá)水平

取小鼠結(jié)腸中遠(yuǎn)端組織，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液沖洗后剪成小塊，加RIPA裂解液進(jìn)行勻漿。勻漿完成后放置冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清液，通過BCA法測定蛋白濃度。確定蛋白上樣量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉后，洗膜3 次分別加入TNF-α抗體（1∶1 000）和β-actin（1∶3 000），4 ℃孵育過夜，洗膜3 次后加入二抗（1∶5 000），常溫孵育1 h，洗膜3 次后通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，進(jìn)行曝光顯影可視化處理。

1.3.8 小鼠結(jié)腸病理組織觀察

最后一次灌胃24 h后，剖取結(jié)腸組織，常規(guī)取材，脫水，包埋，制片，蘇木精-伊紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并描述組織病理學(xué)變化，拍攝主要描述中不同種類的病變部位。參照Bergstrom等[18]的方法進(jìn)行病理組織學(xué)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 小鼠病理組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for histopathological evaluation of mice

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間采用最小顯著性差異法比較，組間比較采用鄧肯檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Graphad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度及DAI評分的影響

圖1 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of black garlic on body mass of mice with ulcerative cditis

圖2 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響Fig.2 Effect of black garlic on colon length in mice with ulcerative colitis

圖3 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI評分的影響Fig.3 Effect of black garlic on DAI score of mice with ulcerative colitis

小鼠造模后出現(xiàn)精神萎靡、毛發(fā)無光澤、血便、體質(zhì)量下降等現(xiàn)象。由圖1可知，除正常組外，灌胃期間其余各組小鼠體質(zhì)量呈不同程度下降，灌胃結(jié)束時，黑蒜各劑量組小鼠體質(zhì)量與模型組差異顯著。由圖2可知，灌胃結(jié)束后，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸長度極顯著縮短（P＜0.01）；與模型組相比，黑蒜中劑量組小鼠結(jié)腸長度顯著增加（P＜0.05），黑蒜高劑量組和陽性對照組小鼠結(jié)腸長度極顯著增加（P＜0.01），且接近于正常組長度。由圖3可知，與正常組相比，模型組小鼠DAI評分極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，黑蒜低、高劑量組和陽性對照組小鼠DAI評分顯著降低（P＜0.05）。

2.2 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化的影響

圖4 灌胃黑蒜后潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化（×400）Fig.4 Histopathological changes in the colon of mice with ulcerative colitis after gavage with black garlic (× 400)

圖5 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評分的影響Fig.5 Effect of black garlic on histopathological score of colon in mice with ulcerative colitis

由圖4可知，與正常組相比，模型組小鼠出現(xiàn)結(jié)腸黏膜炎癥，隱窩丟失，個別部位黏膜上皮明顯變薄，杯狀細(xì)胞減少。與模型組相比，黑蒜低劑量組小鼠結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)相對完整，仍有部分炎性細(xì)胞浸潤，無明顯差異。黑蒜中、高劑量及陽性對照組小鼠結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)基本完整，炎性浸潤較模型組小鼠明顯減輕，上皮細(xì)胞排列較為緊密，杯狀細(xì)胞數(shù)量較多，這與圖5黑蒜中、高劑量及陽性對照組小鼠病理組織學(xué)評分極顯著低于模型組（P＜0.01）的結(jié)果一致。

2.3 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清和結(jié)腸組織中TNF-α表達(dá)的影響

圖6 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清中TNF-α質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of black garlic on TNF-α concentration in peripheral blood of mice

圖7 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TNF-α相對表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of black garlic on the relative expression of TNF-α in colon tissue of mice with ulcerative colitis

由圖6～7可知，模型組小鼠外周血中TNF-α質(zhì)量濃度和結(jié)腸組織中TNF-α相對表達(dá)量極顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，黑蒜各劑量組和陽性對照組小鼠外周血中TNF-α質(zhì)量濃度和結(jié)腸組織中TNF-α相對表達(dá)量均下降，并呈現(xiàn)量效關(guān)系趨勢，其中黑蒜中、高劑量組與模型組差異極顯著（P＜0.01）。

2.4 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠IL-1β、IL-6表達(dá)的影響

由圖8～9可知，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6質(zhì)量濃度極顯著高于正常組（P＜0.01）；與模型組相比，黑蒜各劑量組和陽性對照組小鼠血清IL-1β、IL-6質(zhì)量濃度均下降，并呈現(xiàn)量效關(guān)系趨勢，其中，黑蒜低劑量組顯著低于模型組（P＜0.05），黑蒜中、高劑量組與模型組相比差異極顯著（P＜0.01）。

圖8 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清IL-1β質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effect of black garlic on serum IL-1β concentration in mice with ulcerative colitis

圖9 黑蒜對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血清IL-6質(zhì)量濃度的影響Fig.9 Effect of black garlic on serum IL-6 concentration in mice with ulcerative colitis

3 討 論

大蒜為百合科蔥屬多年生草本植物，性味辛、溫，具有消炎、抗菌、消毒等功效[4]。高溫發(fā)酵是大蒜的新型加工技術(shù)，發(fā)酵過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，使蒜瓣通體呈黑色，故稱為黑蒜[19]。發(fā)酵過程促使生大蒜中部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成為氨基酸，容易被人體吸收。黑蒜對恢復(fù)體力、增強(qiáng)免疫力及保持健康具有積極作用，與生大蒜相比，黑蒜的抗氧化能力提高了數(shù)十倍，且食后無蒜味、味道酸甜，是極具潛力的保健食品原料[20-23]。

截至2015年，全球大約有1 120萬 人受到潰瘍性結(jié)腸炎與克羅恩病影響[24]。每年每10萬 人中有1～20 人新發(fā)，有5～500 人受到影響[25-26]。潰瘍性結(jié)腸炎是一種以T細(xì)胞浸潤結(jié)腸為特征的自身免疫性疾病，會導(dǎo)致結(jié)腸和直腸的炎癥和潰瘍，并可能導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，其發(fā)病的直接原因尚不明確[27]。

DSS在誘導(dǎo)動物實驗性結(jié)腸炎中使用廣泛，成功率和重復(fù)性高，DSS誘導(dǎo)的動物結(jié)腸組織損傷與人潰瘍性結(jié)腸炎病變相似度高，是建立小鼠結(jié)腸炎模型的理想方法[28]。黏膜組織檢查是明確診斷潰瘍性結(jié)腸炎，并與克羅恩病相鑒別的主要方法。潰瘍性結(jié)腸炎的病理特征包括隱窩結(jié)構(gòu)扭曲、隱窩發(fā)炎、隱窩膿腫以及固有層出血或出現(xiàn)炎性細(xì)胞。越來越多的證據(jù)表明，炎癥相關(guān)因素與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)。潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病時，全身性炎癥指標(biāo)可能出現(xiàn)高水平表達(dá)，此時可以用血清炎癥標(biāo)志物來量化炎癥的程度。目前已發(fā)現(xiàn)，黑蒜對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)陽離子自由基均具有良好的清除作用，對脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞生長抑制有顯著性保護(hù)作用[29]，對NO、IL-1β、IL-6和TNF-α等細(xì)胞炎性因子的釋放均有顯著抑制作用[30]。黑蒜中有效成分蒜氨酸通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶/過氧化物酶體增殖因子活化受體γ刺激的核因子-κB/AP-1/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）活化和p38誘導(dǎo)的STAT1活化，減輕DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎，抑制脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[31]。

本實驗采用DSS建立BALB/c小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，造模后小鼠體質(zhì)量降低，出現(xiàn)稀便和血便等癥狀。病理組織學(xué)可見結(jié)腸長度縮短、黏膜損傷、炎癥細(xì)胞浸潤等炎癥癥狀。以上結(jié)果提示DSS成功誘導(dǎo)了潰瘍性結(jié)腸炎模型。給予不同劑量黑蒜干預(yù)后，小鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥狀減輕和病理組織學(xué)指標(biāo)降低，TNF-α、IL-1β、IL-6的質(zhì)量濃度顯著下降。結(jié)果表明，黑蒜具有降低BALB/c小鼠潰瘍性結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)的作用。研究結(jié)果為黑蒜在預(yù)防或輔助治療潰瘍性結(jié)腸炎中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。