基于酶活力模型和細(xì)胞模型分析紅毛藻多糖降血脂活性

詹 慧，宋田源，余 剛，姜澤東,2,3,4,，杜希萍,2,3,4，朱艷冰,2,3,4，倪 輝,2,3,4，李清彪,2,3,4

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；3.廈門南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；4.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

高脂高糖的飲食習(xí)慣是誘發(fā)多種慢性疾病，如肥胖、動脈粥樣硬化、高脂血癥等的重要因素，過量攝入脂質(zhì)會增加心/腦血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[1]。胰脂肪酶是最主要的脂肪水解酶，它可將膳食中的大部分脂肪水解為脂肪酸和甘油單酯，在脂肪和膽固醇的吸收過程中具有非常重要的作用[2]。研究表明特異性的胰脂肪酶抑制劑可作為高脂血癥類疾病的有效治療藥物[3]，如奧利司他[4]，但長期服用這類藥物會產(chǎn)生腹瀉、腹痛、溏便、惡心等副作用[5]。從天然膳食材料中篩選安全的脂肪酶抑制劑是解決該問題的重要途徑之一。

多糖是海藻中重要的膳食營養(yǎng)元素之一。海藻多糖的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征多樣，表現(xiàn)出多種理化性質(zhì)和生物活性。近年來，海藻多糖如巖藻聚糖、泡葉藻聚糖、褐藻膠、龍須菜多糖、紫菜多糖和瓊脂等因具有優(yōu)良的物理化學(xué)特性和生物活性，如降血糖[6-7]、降高血壓[8-9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11]、抗炎[12]和降血脂活性[13-14]等，已被作為功能性食品、化妝品甚至是藥物廣泛應(yīng)用[15-16]。紅毛藻（Bangia fusco-purpurea）又稱紅毛菜，在中國東南沿海分布較廣，福建省莆田市南日島鎮(zhèn)是其主要產(chǎn)區(qū)之一[17-18]。紅毛藻具有提高免疫力、降血壓、降血脂、滋陰祛火和防止動脈粥樣硬化等多種食藥用功效[19]，但其食藥用功效機(jī)理尚不明確。Jiang Zedong等[20]報(bào)道紅毛藻多糖（B.fusco-purpureapolysaccharide，BFP）可通過競爭性抑制β-淀粉酶活力和非競爭性抑制β-葡萄糖苷酶活力，具有潛在抑制餐后血糖升高的功效。蔡薇[21]研究發(fā)現(xiàn)BFP及其分離組分（F1、F2、F3）能夠通過誘導(dǎo)核因子κB和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶信號通路誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）活化釋放NO和分泌腫瘤壞死因子α，具有潛在的免疫誘導(dǎo)活性。目前，鮮有對紅毛藻降血脂活性機(jī)理的研究報(bào)道。本研究在分離純化紅毛藻主要營養(yǎng)元素多糖組分的基礎(chǔ)上，研究其對胰脂肪酶活力的影響，并利用Caco-2細(xì)胞模型和高血脂/高膽固醇HepG2細(xì)胞模型，評價(jià)各BFP組分對游離脂肪酸吸收及細(xì)胞模型中甘油三酯與膽固醇合成能力的抑制作用，闡明紅毛藻降血脂活性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅毛藻采集于福建省莆田市南日島鎮(zhèn)紅毛藻養(yǎng)殖海域，晾干后，冷藏備用。

人肝癌（HepG2）細(xì)胞、人結(jié)直腸腺癌（Caco-2）細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫（上海）。

Sephadex G-75葡聚糖凝膠層析柱 瑞典GE公司；DEAE-cellulose 52陰離子交換柱 美國Whatman公司；胎牛血清、PierceTMBCA蛋白檢測試劑盒 美國賽默飛世爾科技公司；100×雙抗（100 IU/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素）溶液、油酸、胰蛋白酶、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma-Aldrich公司；高糖DMEM培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；甘油三酯、總膽固醇、游離脂肪酸和脂肪酶檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；胰脂肪酶（來源于豬胰腺，EC 3.1.1.3）、奧利司他、辛伐他灑 默克生命科學(xué)（上海）有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J26XP高速冷凍離心機(jī) 德國貝克曼公司；Free Zone 6 Plus真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；Cytation-5細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)、Cytation-5酶標(biāo)儀美國伯騰儀器有限公司；HERACELL Vois 160i CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 BFP的提取及各組分的分離純化

BFP的提取[21-22]：紅毛藻經(jīng)自來水洗凈，60 ℃烘干，粉碎并過100 目篩網(wǎng)后得到紅毛藻粉。精確稱取50 g干燥藻粉，加入300 mL無水甲醇攪拌處理2 h以去除醇溶性色素和雜質(zhì)。甲醇處理結(jié)束后，烘干備用。藻粉和蒸餾水按照1∶100（m/V）比例混勻，于90 ℃熱水抽提2 h。水提液冷卻至室溫后，離心（8 000×g，20 min），收集上清液。在攪拌情況下向上清液中緩慢滴加無水乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為75%，以獲得醇沉液。靜置過夜后，醇沉液離心（10 000×g，15 min）并收集沉淀。沉淀經(jīng)適量蒸餾水復(fù)溶后，置于透析袋（分子截留量3500 Da）中，在4 ℃下于蒸餾水中透析48 h。透析結(jié)束后，透析袋中溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥后得到紅毛藻粗多糖。

BFP的分離純化[21]：采用Sevag法[23]去除紅毛藻粗多糖中蛋白質(zhì)，冷凍干燥得到去蛋白的紅毛藻粗多糖。取3.0 mL 5 mg/mL紅毛藻粗多糖溶液，加載到Sephadex G75凝膠層析柱（1.6 cm I.D.×100 cm），用0.1 mol/L NaCl溶液以0.5 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，用苯酚-硫酸法[24]監(jiān)測并收集多糖組分。收集的組分經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥后獲得純化的BFP。配制一定質(zhì)量濃度的BFP溶液，采用DEAE Cellulose 52柱層析法（2.6 cm I.D.×20 cm）進(jìn)一步分離純化，用不同濃度（0、0.1、0.3、0.5 mol/L）NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫。用苯酚-硫酸法監(jiān)測，收集得到3 個(gè)組分（F1、F2和F3），經(jīng)濃縮、透析和冷凍干燥后備用。

1.3.2 BFP組分對胰脂肪酶活力的影響實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[25]所述方法分析BFP組分對胰脂肪酶活力的影響。胰脂肪酶溶于50 mmol/L Tris緩沖液（pH 8.0）中，離心（10 000×g，10 min），取上清液，得到1 000 IU/mL的胰脂肪酶溶液。反應(yīng)底物棕櫚酸4-硝基苯酯（4-nitrophenyl palmitate，pNPP）溶于含體積分?jǐn)?shù)5%異丙醇的Tris緩沖液中，制備濃度為2.0 mmol/L的pNPP溶液。BFP各組分（F1、F2和F3）溶于Tris緩沖液中，制備各BFP各組分溶液。分別將不同質(zhì)量濃度（0、200、400、600、800、1 000 μg/mL）的各BFP組分溶液（50 μL）和胰脂肪酶溶液（50 μL）混合均勻后，于37 ℃下孵育10 min，然后立即加入100 μL pNPP溶液，再次置于37 ℃下反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，立即100 ℃水浴5 min以終止反應(yīng)。終止后的反應(yīng)液離心（5 000×g，10 min）去除沉淀，于405 nm波長處測定各反應(yīng)體系吸光度。以奧利司他作為陽性對照，BFP組分對胰脂肪酶活力的影響用酶活力抑制率表示，按式（1）計(jì)算。通過線性擬合計(jì)算BFP組分對胰脂肪酶活力的半抑制濃度（half Inhibiting concentration，IC50）。

式中：AS、AN和AC分別表示添加BFP組分、未添加胰脂肪酶和未添加BFP組分反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.3 酶促動力學(xué)分析

取50 μL不同濃度（0、200、400、600、800、1 000 IU/mL）胰脂肪酶溶液與50 μL 500 μg/mL BFP組分溶液混勻，于37 ℃孵育10 min。孵育結(jié)束后，加入100 μL 2.0 mmol/L pNPP溶液混勻，于37 ℃反應(yīng)10 min后終止反應(yīng)，于405 nm波長處測定各反應(yīng)體系的吸光度。以不添加BFP組分溶液的反應(yīng)體系作為對照組。繪制酶解產(chǎn)物對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝35.036x-0.002 5（R2＝0.999 9），計(jì)算pNP濃度（mmol/L），再將反應(yīng)后的pNP濃度除以反應(yīng)時(shí)間得到反應(yīng)速率（v，mmol/（L·min））。以v為縱坐標(biāo)，胰脂肪酶濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，根據(jù)曲線斜率進(jìn)行反應(yīng)的可逆型判定。

取50 μL 500 IU/mL胰脂肪酶溶液與50 μL 1 000 μg/mL BFP組分溶液混勻，于37 ℃孵育10 min。孵育結(jié)束后，加入100 μL不同濃度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L）pNPP溶液混勻，于37 ℃反應(yīng)10 min后終止反應(yīng)，于405 nm波長處測定各反應(yīng)體系的吸光度。以不添加BFP組分溶液的反應(yīng)體系作為對照。繪制酶解產(chǎn)物對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝35.036x-0.002 5（R2＝0.999 9），計(jì)算pNP濃度（mmol/L），再將反應(yīng)后的pNP濃度除以反應(yīng)時(shí)間得到反應(yīng)速率（v，mmol/（L·min））。以反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）對底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)（1/[S]）作圖，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，確定最大反應(yīng)速率（vmax）和米氏常數(shù)（Km）。根據(jù)雙倒數(shù)圖計(jì)算vmax、Km：曲線與縱軸的截距＝1/vmax；曲線與橫軸截距＝-1/Km；根據(jù)vmax、Km變化確定抑制類型。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2、Caco-2細(xì)胞均采用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.5 BFP組分對細(xì)胞活力的影響實(shí)驗(yàn)

HepG2細(xì)胞預(yù)處理：HepG2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，以3×105個(gè)/孔接種到96 孔板中，37 ℃下孵育24 h。孵育結(jié)束后，移除細(xì)胞上清液，用含不同質(zhì)量濃度（0、10、50、100、200、500 μg/mL）BFP組分或含不同濃度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L）油酸的生長培養(yǎng)基于37 ℃下繼續(xù)孵育24 h。

Caco-2細(xì)胞預(yù)處理：Caco-2細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，以3×105個(gè)/孔接種到96 孔板中，37 ℃下孵育24 h。孵育結(jié)束后，移除細(xì)胞上清液，用含不同質(zhì)量濃度（0、200、400、600、800、1 000 μg/mL）BFP組分或含不同濃度（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L）油酸的生長培養(yǎng)基于37 ℃下繼續(xù)孵育24 h。

細(xì)胞活力測定[26]：取BFP組分F1、F2和F3或油酸處理24 h后的HepG2細(xì)胞或Caco-2細(xì)胞，移除細(xì)胞上清液，每孔中加入100 μL 5 g/100 mL噻唑藍(lán)溶液（溶于磷酸鹽緩沖液，pH 7.4），于37 ℃下繼續(xù)孵育30 min。孵育結(jié)束，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）輕輕洗滌細(xì)胞2 次后，每孔中加入100 μL二甲亞砜溶出細(xì)胞內(nèi)甲瓚。振蕩20 min后，于570 nm波長處測定光密度（optical density，OD）值。以不加BFP組分或油酸處理為對照組，以二甲亞砜為溶劑空白。細(xì)胞活力按式（2）計(jì)算。

式中：AS、AC和A0分別表示BFP組分或油酸處理組、對照組和空白組體系的OD570nm。

Caco-2細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種至24 孔Transwell小室中，培養(yǎng)24 h。吸走小室內(nèi)外的細(xì)胞上清液，處理組為小室內(nèi)外均加入含不同質(zhì)量濃度（50、500 μg/mL）BFP組分F1、F2和F3的生長培養(yǎng)基，于37 ℃下孵育24 h；空白組為小室內(nèi)外均加入生長培養(yǎng)基孵育24 h。孵育結(jié)束后，小室內(nèi)添加500 μL含油酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（油酸終濃度100 μmol/L、BSA終濃度2 μmol/L），基底外側(cè)隔室添加生長培養(yǎng)基，再次于37 ℃下孵育24 h。孵育結(jié)束后，移除小室內(nèi)外的培養(yǎng)基，用BCA蛋白檢測試劑盒測定細(xì)胞蛋白質(zhì)含量，用游離脂肪酸檢測試劑盒測定基底外側(cè)隔室培養(yǎng)基中游離脂肪酸含量[27]，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.3.7 BFP組分對高脂HepG2細(xì)胞模型甘油三酯合成的影響實(shí)驗(yàn)

取HepG2細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種至96 孔板，待其貼壁。用無血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后，用含不同質(zhì)量濃度（0、50、100、200、500 μg/mL）BFP組分F1、F2和F3的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃孵育12 h，然后去除細(xì)胞上清液，用含油酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（油酸終濃度0.5 mmol/L、BSA終濃度2 μmol/L）[28]繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h的正常HepG2細(xì)胞為空白組。

孵育結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）輕輕洗滌細(xì)胞3 次。用RIPA裂解液（50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、1% Triton X-100、1 g/100 mL脫氧膽酸鹽、0.1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉，pH 7.4）在冰浴下裂解細(xì)胞30 min，4 ℃、10 000×g下離心15 min，取上清液。用BCA蛋白檢測試劑盒測定細(xì)胞蛋白質(zhì)含量，使用甘油三酯檢測試劑盒測定上清液中甘油三酯含量，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.3.8 BFP組分F3對高膽固醇HepG2細(xì)胞模型中脂類合成的影響實(shí)驗(yàn)

取HepG2細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種至96 孔板，待其貼壁，移除細(xì)胞上清液，用含不同質(zhì)量濃度（0、50、100、200、500 μg/mL）BFP組分F3的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃孵育12 h，去除細(xì)胞上清液，再用含膽固醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（膽固醇質(zhì)量濃度15 μg/mL、BSA質(zhì)量濃度2 μg/mL）[29-30]繼續(xù)培養(yǎng)24 h；以用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，去除細(xì)胞上清液，再用含15 μg/mL膽固醇和0.2 μg/mL辛伐他灑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h的細(xì)胞為辛伐他灑組。

孵育結(jié)束后，用1.3.7節(jié)中方法裂解細(xì)胞，用BCA蛋白檢測試劑盒測定細(xì)胞蛋白含量，用總膽固醇檢測試劑盒測定HepG2細(xì)胞中總膽固醇含量，結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)。

本試驗(yàn)通過生物顯微鏡分析了絲瓜絡(luò)纖維的縱向和橫截面結(jié)構(gòu)形態(tài)；測定了絲瓜絡(luò)纖維的回潮率、力學(xué)性能、耐酸堿性能以及對重金屬的吸附性能等。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，利用Microsoft Office Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)，用Graphpad Prism 8.0軟件作圖，用SPSS軟件單因素方差分析檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異的顯著性，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BFP各組分對胰脂肪酶活力的影響

圖1 BFP組分對胰脂肪酶活力的抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of polysaccharide fractions from B.fusco-purpurea on pancreatic lipase activity

由圖1可知，在質(zhì)量濃度0～1 000 μg/mL范圍內(nèi)，BFP組分F1、F2和F3對胰脂肪酶活力有不同程度的抑制作用。其中組分F3對胰脂肪酶活力的抑制活性最強(qiáng)，且隨著質(zhì)量濃度的增大，抑制效果極顯著增強(qiáng)（P＜0.01），呈濃度依賴性；當(dāng)組分F3質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到97.35%。擬合得到組分F3對胰脂肪酶活力的抑制曲線方程為y＝0.108 0x-3.325 2，計(jì)算得到組分F3對胰脂肪酶活力的IC50為0.49 μg/mL，奧利司他對胰脂肪酶活力的IC50為1.45 μg/mL。

2.2 BFP各組分對胰脂肪酶抑制作用的酶促動力學(xué)分析

由于組分F3對胰脂肪酶活力的抑制活性最強(qiáng)，選擇組分F3進(jìn)行BFP對胰脂肪酶抑制作用的酶促動力學(xué)分析。由圖2A可知：在固定底物濃度（2.0 mmol/L）的情況下，添加和不添加BFP組分F3，胰脂肪酶的酶促反應(yīng)速率（v）均隨胰脂肪酶濃度（0～1 000 IU/mL）的增大而增加；添加BFP組分F3后，v降低，曲線斜率變??；并且兩條曲線均過原點(diǎn)，表明BFP組分F3對胰脂肪酶活力的抑制類型為可逆性抑制。由圖2B可知：在固定胰脂肪酶濃度（500 IU/mL）的情況下，添加和不添加BFP組分F3，1/v和1/[S]均呈線性正相關(guān)；2 條曲線相交于Y軸上同一點(diǎn)，即添加BFP組分F3后，vmax不變，Km增大。由此可判斷BFP組分F3對胰脂肪酶活力為競爭性抑制。綜上所述，BFP組分F3對胰脂肪酶活力的抑制作用為可逆競爭性抑制。

圖2 BFP組分F3對胰脂肪酶活力作用的抑制類型（A）和Lineweaver-Burk曲線（B）Fig.2 Inhibition type of F3 on pancreatic lipase activity (A) and Lineweaver-Burk curve (B)

2.3 BFP組分對HepG2細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞活力的影響

圖3 BFP組分和油酸對HepG2細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effects of polysaccharide fractions from B.fusco-purpurea and oleic acid on the viability of HepG2 cells and Caco-2 cells

由圖3A可知，在質(zhì)量濃度0～500 μg/mL范圍內(nèi)，BFP組分F1、F2和F3對HepG2細(xì)胞活力均無顯著影響（P＞0.05），表明3 種BFP組分在實(shí)驗(yàn)選取質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對HepG2細(xì)胞沒有直接毒性作用。由圖3B可知，與對HepG2細(xì)胞活力的影響相似，BFP組分F1、F2和F3在質(zhì)量濃度0～1 000 μg/mL范圍內(nèi)對Caco-2細(xì)胞也均無毒性作用。由圖3C可知，在濃度超過1.0 mmol/L后，油酸對HepG2和Caco-2細(xì)胞活力均有顯著抑制作用，表明較高濃度的油酸對HepG2和Caco-2細(xì)胞有毒性作用。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用0.5 mmol/L油酸作為構(gòu)建細(xì)胞模型的上限濃度。

2.4 BFP組分對油酸誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞模型中游離脂肪酸吸收的影響

圖4 BFP組分對油酸誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞游離脂肪酸吸收的影響Fig.4 Effects of polysaccharide fractions from B.fusco-purpurea on absorption of free fatty acids in Caco-2 cells induced by oleic acid

由圖4可知，與空白組相比，經(jīng)不同質(zhì)量濃度（50、500 μg/mL）BFP組分F1、F2和F3處理后，油酸誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞對游離脂肪酸的吸收均顯著降低（P＜0.05），表明3 種BFP組分均能有效抑制油酸誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞對游離脂肪酸的吸收。其中，組分F1抑制Caco-2細(xì)胞吸收游離脂肪酸的活性優(yōu)于組分F2和F3（P＜0.05）。

2.5 BFP組分對高脂HepG2細(xì)胞模型中甘油三酯合成的影響

圖5 BFP對高脂HepG2細(xì)胞甘油三酯合成的影響Fig.5 Effects of polysaccharide fractions from B.fusco-purpurea on triglyceride synthesis in high-fat HepG2 cells

由圖5可知，與空白組正常HepG2細(xì)胞相比，0.5 mmol/L油酸誘導(dǎo)的模型組高脂HepG2細(xì)胞中甘油三酯含量顯著提高（P＜0.05），表明高脂HepG2細(xì)胞模型構(gòu)建成功。與模型組相比，BFP組分F1、F2和F3處理后，0.5 mmol/L油酸誘導(dǎo)高脂HepG2細(xì)胞中的甘油三酯含量均顯著降低（P＜0.05），表明3 種BFP組分對高脂HepG2細(xì)胞中甘油三酯的積累均具有顯著抑制作用，且隨BFP組分質(zhì)量濃度的增加，抑制效果也相應(yīng)增強(qiáng)，呈濃度依賴性。其中，組分F3對高脂HepG2細(xì)胞甘油三酯合成的抑制活性最強(qiáng)。

2.6 BFP組分F3對高膽固醇HepG2細(xì)胞模型中脂類合成的影響

圖6 BFP組分F3對高膽固醇HepG2細(xì)胞中脂類合成的影響Fig.6 Effect of F3 on lipid synthesis in high-cholesterol HepG2 cells

由于BFP組分F3對油酸誘導(dǎo)高脂HepG2細(xì)胞中甘油三酯積累的抑制活性最強(qiáng)，選擇組分F3研究其對高膽固醇HepG2細(xì)胞模型中脂類合成的影響。由圖6可知，與模型組相比，辛伐他灑組HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量均顯著降低（P＜0.05），表明辛伐他灑作為臨床應(yīng)用的血脂調(diào)節(jié)劑和膽固醇合成關(guān)鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，可有效抑制高膽固醇HepG2細(xì)胞模型中的脂類合成。與模型組相比，在質(zhì)量濃度50～500 μg/mL范圍內(nèi)，BFP組分F3處理高膽固醇HepG2細(xì)胞的胞內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量均顯著降低（P＜0.05），且呈濃度依賴效應(yīng)，表明組分F3在實(shí)驗(yàn)所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較好的抑制高膽固醇HepG2細(xì)胞模型中脂類合成的活性。并且，在較高質(zhì)量濃度（200～500 μg/mL）范圍內(nèi)，組分F3抑制高膽固醇HepG2細(xì)胞模型中脂類合成的活性顯著優(yōu)于0.2 μg/mL辛伐他灑（P＜0.05）。

3 討 論

蔡薇[21]的研究結(jié)果表明，紅毛藻中提取的粗多糖經(jīng)Sephadex G75葡聚糖凝膠過濾柱層析和DEAE-cellulose 52陰離子交換柱分離純化得到3 個(gè)多糖組分，紅毛藻中提取的粗多糖及3 個(gè)組分的得率分別為5.68%、40.8%、6.0%、6.8%，且均為雜多糖，不同組分的單糖組成也存在較大差異。多糖組成是其生物活性差異的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)選取BFP組分F1、F2和F3為研究對象，結(jié)果表明，BFP組分F1、F2和F3對胰脂肪酶活力均有顯著抑制作用，其中組分F3表現(xiàn)出的胰脂肪酶活力抑制作用最強(qiáng)，組分F3質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí)胰脂肪酶活力抑制率達(dá)到97.35%。酶促動力學(xué)分析結(jié)果表明，組分F3對胰脂肪酶活力的抑制屬于可逆競爭性抑制。胰脂肪酶是水解膳食中脂類的關(guān)鍵酶，在甘油單酯和脂肪酸的消化和吸收中起到重要作用[2]。因此，抑制胰脂肪酶的活性對于治療高脂飲食所導(dǎo)致的高血脂疾病具有重要意義。

過量攝入脂肪后，人體會生成大量游離脂肪酸，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體甘油三酯積累和相關(guān)脂蛋白的分泌，最終增加血脂水平[31]。人體中的甘油三酯主要來源于2 條途徑：小腸黏膜細(xì)胞吸收食物中脂肪消化產(chǎn)物（甘油和脂肪酸）重新合成甘油三酯（外源性）；以及肝細(xì)胞和脂肪細(xì)胞通過非脂類物質(zhì)生物合成甘油三酯（內(nèi)源性）。相關(guān)研究表明，Caco-2細(xì)胞具有小腸黏膜細(xì)胞的生理生化功能，多用于與腸道吸收過程相關(guān)的研究[31]；HepG2細(xì)胞保留了天然肝細(xì)胞的正常生化功能，因此被廣泛用于研究甘油三酯在肝臟中的合成能力[28]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用油酸誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞模型研究BFP組分對游離脂肪酸吸收的影響（外源性）；采用高脂HepG2細(xì)胞模型研究BFP組分對甘油三酯合成的影響；采用高膽固醇HepG2細(xì)胞模型研究BFP組分F3對脂類合成的影響（內(nèi)源性），以評價(jià)BFP組分的體外降血脂活性。結(jié)果表明：在毒性限制質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，組分F1表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制油酸誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞對游離脂肪酸吸收的作用，且具有濃度依賴性（P＜0.05），是抑制Caco-2細(xì)胞攝取游離脂肪酸的主要活性組分；組分F3能夠顯著抑制高脂HepG2細(xì)胞模型中細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的合成（P＜0.05）和高膽固醇HepG2細(xì)胞模型中細(xì)胞內(nèi)脂類（總膽固醇和甘油三酯）的合成，且均呈濃度依賴性（P＜0.05）?；诩?xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為BFP是一種潛在的天然降血脂活性成分，可應(yīng)用于調(diào)節(jié)血脂健康食品的開發(fā)，為降血脂健康食品甚至藥品開發(fā)提供良好原料。

4 結(jié) 論

BFP經(jīng)分離純化獲得3 個(gè)組分F1、F2和F3。組分F1是BFP抑制Caco-2細(xì)胞吸收游離脂肪酸的主要活性片段；組分F3可以有效抑制胰脂肪酶活力（IC50＝0.49 mg/mL）；組分F3可抑制高脂HepG2細(xì)胞中甘油三酯的合成和高膽固醇HepG2細(xì)胞中脂類（甘油三酯和膽固醇）的合成。綜上所述，BFP各組分（主要是F1和F3）共同作用，可通過競爭性抑制胰脂肪酶活性，有效降低外源性膳食脂肪的水解和消化，抑制腸道對游離脂肪酸的吸收；同時(shí)，內(nèi)源性抑制肝臟對甘油三酯的合成，具有潛在的降血脂功效。本研究應(yīng)用酶活力分析模型和細(xì)胞模型評價(jià)BFP的潛在降血脂活性，闡明BFP的降血脂活性機(jī)制，為提升紅毛藻精深加工產(chǎn)業(yè)價(jià)值和促進(jìn)BFP在健康食品、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。