超聲復(fù)合堿處理對(duì)大豆分離蛋白乳化性影響及其對(duì)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯保護(hù)作用

閆世長(zhǎng)，徐靜雯，武利春，孫禹凡，齊寶坤,，李 楊,2,3,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150000；3.國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150000）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）主要是由7S（β-伴球蛋白）和11S（球蛋白）兩種球形蛋白組成，可以提供包括賴氨酸在內(nèi)的必需氨基酸，其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。然而，未改性的SPI其功能特性如乳化特性、凝膠特性及其他加工特性等[2]的應(yīng)用常常受限。SPI相對(duì)較低的乳化性可能是由7S和11S球蛋白三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、緊密堆積的球形構(gòu)象以及低分子柔韌性引起的[1]。因此，需要對(duì)SPI進(jìn)行修飾處理以獲得更優(yōu)的乳化特性，這對(duì)其作為功能性和營(yíng)養(yǎng)性成分在食品和藥品中的應(yīng)用有著重要的意義。

近年來(lái)，酸堿處理、超聲處理被廣泛用于蛋白改性。酸堿處理主要是依靠產(chǎn)生的靜電斥力來(lái)引起分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)[3]。超聲處理通過(guò)產(chǎn)生機(jī)械作用、空化作用來(lái)促使蛋白肽鍵斷裂、破壞蛋白聚集顆粒間的非共價(jià)作用，從而引起天然蛋白分子聚集狀態(tài)的改變[4]。Jiang Lianzhou等[5]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理黑豆蛋白可使蛋白的亞基發(fā)生解離、疏水基團(tuán)暴露、乳化特性增加。Zhang Zhaoli等[6]研究發(fā)現(xiàn)堿處理可以使蛋白亞基解離、二硫鍵斷裂，從而改善其功能特性。然而，單一的改性方式對(duì)蛋白功能特性的提升效果并不理想，近年來(lái)，復(fù)合改性方法引起了人們的關(guān)注。Jiang Shanshan等[7]研究發(fā)現(xiàn)超聲復(fù)合酸處理可改變豌豆蛋白的結(jié)構(gòu)，從而提升其功能性。Li Suyun等[8]研究發(fā)現(xiàn)超聲復(fù)合堿處理可使大米蛋白的α-螺旋含量減少，無(wú)規(guī)卷曲含量增加，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變得松散。然而，目前關(guān)于超聲復(fù)合堿處理對(duì)SPI的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶多酚的主要成分。EGCG富含酚羥基，具有強(qiáng)抗氧化活性，并可在預(yù)防癌癥、心血管疾病以及其他慢性疾病方面發(fā)揮作用[9]。但是，EGCG在中性和堿性溶液中非常不穩(wěn)定，隨著pH值、氧氣濃度或溫度的升高，EGCG降解速度加快[10]。因此，尋找理想的方法防止EGCG降解迫在眉睫，Chen Weijun等[11]利用堿處理改性的乳清蛋白與EGCG結(jié)合，顯著提高了乳清蛋白與EGCG的結(jié)合力，阻止了EGCG在貯存過(guò)程中的降解。Shpigelman等[12]研究發(fā)現(xiàn)熱改性的乳蛋白與EGCG的結(jié)合能力增強(qiáng)，有效降低了EGCG的降解速度。然而，關(guān)于超聲復(fù)合堿處理SPI對(duì)EGCG的保護(hù)作用目前鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究超聲復(fù)合堿處理對(duì)SPI分子結(jié)構(gòu)及功能特性的影響及其對(duì)EGCG的保護(hù)作用，以期為SPI作為生物活性成分載體的設(shè)計(jì)提供理論和方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；EGCG（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（1-anilino-8-naphthalene-sulfonate，ANS）美國(guó)Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 北京新光化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；F-6000熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；TU-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器 江蘇金城國(guó)勝儀器廠；Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備與處理

1.3.1.1 SPI制備

根據(jù)Li Yang等[13]的方法制備SPI。將大豆磨粉，過(guò)60 目篩，用正己烷脫脂，將脫脂豆粉分散于去離子水中（1∶10，m/V），用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，攪拌1 h，9 000 r/min離心30 min，取其上清液，然后用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，得到蛋白沉淀物，將蛋白沉淀物水洗如何溶解3 次，6 500 r/min離心30 min得到沉淀物，將沉淀物用蒸餾水溶解后，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，凍干，即得SPI，使用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為（92.35±0.26）%。

1.3.1.2 SPI處理

根據(jù)Hu Hao[14]與Huang Liurong[15]等的方法對(duì)SPI進(jìn)行處理。

對(duì)照組：稱取SPI 1.0 g，加入蒸餾水100 mL，25 ℃攪拌1 h，攪拌過(guò)程中利用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為7.0，在5 000 r/min下離心15 min得上清液，然后凍干。

堿處理：稱取SPI 1.0 g，加入蒸餾水100 mL，25 ℃攪拌1 h，攪拌過(guò)程中利用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為12.0，然后調(diào)節(jié)pH值至7.0保持1 h，在5 000 r/min下離心15 min得上清液，然后凍干。

超聲處理：稱取SPI 1.0 g，加入蒸餾水100 mL，25 ℃攪拌1 h，攪拌過(guò)程中利用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為7.0，然后200 W超聲處理5 min（工作/間歇時(shí)間比為5 s/5 s），蒸餾水定容到100 mL，在5 000 r/min下離心15 min得上清液，然后凍干。

超聲復(fù)合堿處理：稱取超聲處理的SPI 1.0 g，加入100 mL蒸餾水，25 ℃攪拌1 h，并用濃度為0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為12.0，然后調(diào)節(jié)pH值至7.0，保持1 h，在5 000 r/min下離心15 min得上清液，然后凍干。

超聲處理、堿處理、超聲復(fù)合堿處理的樣品分別記作USPI、HSPI、UHSPI。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析

用IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀在室溫下記錄SPI的紅外光譜。將樣品與KBr混合（質(zhì)量比1∶100），然后壓片。在500～4 000 cm-1的范圍內(nèi)記錄光譜，分辨率為4 cm-1。采用Peakfit 4.12軟件中高斯曲線擬合α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的特征峰[16]，分析其相對(duì)含量。

1.3.3 熒光光譜分析

根據(jù)He Zhiyong等[17]的方法并稍作修改，對(duì)SPI進(jìn)行熒光光譜分析，使用F-6000熒光分光光度計(jì)，在連續(xù)掃描模式下，發(fā)射光譜范圍為200～500 nm，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為200～350 nm，共進(jìn)行16 次掃描。

1.3.4 巰基含量測(cè)定

巰基含量參照Lee等[1]的方法進(jìn)行測(cè)定。將15 mg樣品溶解于5.0 mL的緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素，pH 8.0）中，在該蛋白液中加入50 μL的Ellman試劑，漩渦混勻后在室溫（（25±1）℃）下反應(yīng)1 h，然后再經(jīng)10 000×g離心15 min。得到的上清液在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以未加蛋白的Ellman試劑為空白。巰基含量以DTNB摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計(jì)算，單位為μmol/g。

1.3.5 表面疏水性測(cè)定

采用Kang Dacheng等[18]的方法，以ANS為熒光探針測(cè)定的蛋白質(zhì)表面疏水性。利用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）將各處理蛋白配制成2 mg/mL的蛋白溶液。然后用磷酸鹽緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度稀釋至0.005～0.500 mg/mL之間。取不同質(zhì)量濃度的稀釋樣品4 mL，加入50 μL的ANS溶液（采用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制成，濃度8 mmol/L）。采用F-6000型熒光分光光度計(jì)在365 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和484 nm的發(fā)射波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)、蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，曲線斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性。

1.3.6 乳化性測(cè)定

乳化性的測(cè)定參考Gao Hao等[19]的方法并稍作修改。將1.3.5節(jié)樣品溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋（10 mmol/L、pH 7.0）至質(zhì)量濃度為1 mg/mL，將稀釋的樣品以3∶1（V/V）溶解于大豆油中，使用高速剪切均質(zhì)機(jī)以10 000 r/min均質(zhì)1 min形成乳狀液，立即從乳狀液底部提取50 μL乳液分散于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液，稀釋100 倍。經(jīng)漩渦振蕩后用分光光度計(jì)在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度A500nm，用相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的十二烷基硫酸鈉溶液作為對(duì)照。經(jīng)10 min后再次測(cè)定其吸光度。用吸光度表示乳化活性，A500nm越高表示乳化活性越高；按公式（1）計(jì)算乳化穩(wěn)定性。

式中：A0、A10分別為乳狀液在0、10 min時(shí)的吸光度。

1.3.7 熒光猝滅分析

根據(jù)Chen Weijun等[11]的方法，向10 mL不同方式處理的SPI溶液（1 mg/mL）中分別逐滴加100 μL 2.5×10-6、5.0×10-6、7.5×10-6、10.0×10-6、12.5×10-6、15.0×10-6、17.5×10-6、20.0×10-6mol/L的EGCG溶液，漩渦振蕩后，選擇激發(fā)波長(zhǎng)280 nm、激發(fā)狹縫5 nm、掃描速率600 nm/min、連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長(zhǎng)300～400 nm。熒光猝滅一般可分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅2 種作用機(jī)制。應(yīng)用Stern-Volmer方程判斷猝滅類型[20]，見(jiàn)公式（2）。

式中：F0和F分別為未加入和加入猝滅劑EGCG時(shí)SPI溶液的熒光強(qiáng)度；[Q]為EGCG的濃度/（10-6mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s。

一般情況猝滅劑對(duì)于生物大分子最大猝滅速率常數(shù)為2×1010L/（mol·s），當(dāng)大于這一速率時(shí)，則為靜態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅按公式（3）計(jì)算。

式中：Ka為表觀結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.3.8 EGCG穩(wěn)定性測(cè)定

通過(guò)將EGCG溶液（0.5 mg/mL，溶解于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，pH 7.0）和SPI溶液（1 mg/mL，溶解于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）以1∶1的體積比混合制備SPI-EGCG復(fù)合物。使用相同的緩沖液制備游離EGCG溶液（0.25 mg/mL）。將所有樣品在室溫下放置7 d。在425 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度[12]，以吸光度表示EGCG的穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 20軟件中的方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。利用Origin 2020軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖1 超聲與堿處理SPI的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.1 Fourier transform infrared spectra of native and treated SPI

表1 超聲與堿處理SPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 1 Relative contents of secondary structures in native and treated SPI%

傅里葉變換紅外光譜常被用來(lái)分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。由圖1可知，經(jīng)過(guò)不同條件處理后，各樣品酰胺I帶的半峰寬變窄、強(qiáng)度減弱及峰位（SPI：1 631.73 cm-1；HSPI：1 632.81 cm-1；USPI：1 633.02 cm-1；UHSPI：1 633.48 cm-1）發(fā)生改變，由此可知SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量分析如表1所示，與對(duì)照組相比，堿處理可以使蛋白的α-螺旋與β-折疊相對(duì)含量降低，這可能是堿處理提高靜電斥力導(dǎo)致的[21]。Chen Weijun等[11]發(fā)現(xiàn)堿處理可以降低乳清蛋白蛋白的α-螺旋與β-折疊含量，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。超聲處理SPI的α-螺旋相對(duì)含量顯著降低，表明超聲波可以破壞蛋白質(zhì)分子的氫鍵和蛋白的剛性結(jié)構(gòu)，并改善蛋白質(zhì)分子柔性[19]。此外，與對(duì)照組相比，超聲輔助堿處理的SPIα-螺旋相對(duì)含量顯著降低（降低13.23%）、無(wú)規(guī)卷曲含量顯著升高（升高8.44%），可能是由于蛋白質(zhì)表面的氫鍵含量減少和堿處理提供的靜電相互作用降低了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[22]。

2.2 SPI的熒光光譜分析結(jié)果

圖2 超聲與堿處理SPI的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of native and treated SPI

色氨酸在280 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收峰，因此可通過(guò)280 nm激發(fā)波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度變化考察蛋白內(nèi)部色氨酸的變化。SPI含有一定數(shù)量的色氨酸，當(dāng)色氨酸存在于天然蛋白質(zhì)內(nèi)部時(shí)，熒光強(qiáng)度降低，熒光峰位會(huì)發(fā)生藍(lán)移，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)時(shí)，熒光強(qiáng)度增加，熒光峰位會(huì)發(fā)生紅移[23]。本研究利用熒光光譜來(lái)表征蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，如圖2所示，與對(duì)照蛋白相比，堿處理的SPI沒(méi)有發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象，但是其熒光強(qiáng)度明顯增加，這是由于堿誘導(dǎo)促使蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，使內(nèi)部的發(fā)色基團(tuán)暴露[11]。超聲處理的SPI熒光強(qiáng)度增加并發(fā)生明顯的紅移現(xiàn)象，這是由于超聲產(chǎn)生的空化作用或機(jī)械剪切應(yīng)力導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，內(nèi)部的芳香族氨基酸暴露出來(lái)，造成熒光強(qiáng)度增加[8]。超聲輔助堿處理與單獨(dú)的超聲或堿處理相比，其熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增加，表明超聲與堿處理有協(xié)同作用，可以使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生解折疊，使疏水基團(tuán)暴露，熒光強(qiáng)度增加[24]。

2.3 SPI的表面疏水性分析結(jié)果

表面疏水性是蛋白質(zhì)一種重要的表面性質(zhì)，與蛋白的乳化特性相關(guān)。如圖3所示，與對(duì)照蛋白相比，超聲處理的SPI表面疏水性顯著增加（P＜0.05），可能是因?yàn)槌暡óa(chǎn)生的空化作用破壞了蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)，暴露出分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基，這些疏水性基團(tuán)吸附在蛋白質(zhì)表面，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性增加[7]。堿處理的SPI表面疏水性也發(fā)生顯著的變化（P＜0.05），這是因?yàn)閴A誘導(dǎo)使蛋白質(zhì)二硫鍵遭到破壞，亞基發(fā)生解離，造成包埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露在分子表面，進(jìn)而導(dǎo)致表面疏水性增加[11,21]。超聲處理SPI比堿處理SPI表面疏水性增加程度更顯著，這可能是恢復(fù)到中性條件時(shí)，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生部分重新折疊，部分疏水基團(tuán)被重新包裹在蛋白內(nèi)部[7,21]。超聲輔助堿處理的SPI與單獨(dú)超聲處理或堿處理相比，其表面疏水性增加更顯著，這表明超聲處理產(chǎn)生的空化作用與堿處理提供的靜電斥力相輔相成，使難溶的SPI結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出更多的疏水作用位點(diǎn)，增加了蛋白的表面疏水性[19]。

圖3 超聲與堿處理SPI的表面疏水性Fig.3 Surface hydrophobicity of native and treated SPI

2.4 SPI的巰基含量分析結(jié)果

圖4 超聲及堿處理SPI的巰基含量Fig.4 Sulfhydryl contents of native and treated SPI

蛋白質(zhì)巰基含量的變化也表征著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，巰基含量的測(cè)定結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，超聲處理的SPI巰基含量增多，可能的原因是超聲處理后蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白內(nèi)部的巰基基團(tuán)暴露出來(lái)[1]。堿處理的SPI巰基含量也增加，可能是堿處理使蛋白質(zhì)二硫鍵遭到破壞，亞基發(fā)生解離，進(jìn)而使巰基含量增加[7,21]。超聲輔助堿處理的SPI與單獨(dú)超聲或單獨(dú)堿處理SPI相比，其巰基含量顯著增加（P＜0.05），這可能是超聲與堿處理產(chǎn)生協(xié)同作用，使蛋白的結(jié)構(gòu)變得松散，亞基發(fā)生解離，二硫鍵斷裂，內(nèi)部的巰基基團(tuán)暴露出來(lái)[25]。

2.5 SPI的乳化性分析結(jié)果

乳化活性與乳化穩(wěn)定性是表征蛋白乳化能力與穩(wěn)定乳狀液能力的重要指標(biāo)，其中乳化活性表示蛋白乳液形成油-水界面的能力，乳化穩(wěn)定性是指乳狀液形成小液滴的穩(wěn)定能力[26]。由圖5可知，與對(duì)照SPI相比，單獨(dú)堿處理的SPI乳化活性與乳化穩(wěn)定性顯著增加，可能是由于pH 12距離蛋白的等電點(diǎn)較遠(yuǎn)，產(chǎn)生較高的靜電斥力，蛋白分子間的相互作用減弱，粒徑分布均勻，表面疏水性增加，從而改善其乳化特性[7,19]。單獨(dú)超聲處理的SPI乳化活性與乳化穩(wěn)定性也呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)，可能是由于超聲處理破壞蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，使SPI分子展開(kāi)，暴露出埋藏在分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)，促進(jìn)了SPI在油-水界面上的展開(kāi)，有利于形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[27]。超聲輔助堿處理的蛋白表現(xiàn)出最高的乳化活性（1.714）與乳化穩(wěn)定性（364.68 min），這可能是堿處理產(chǎn)生的靜電斥力使蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，疏水性基團(tuán)暴露，同時(shí)超聲處理可以使蛋白形成穩(wěn)定的膠束包裹在油滴表面，進(jìn)而提升蛋白的乳化性[24]。

圖5 超聲及堿處理SPI的乳化活性與乳化穩(wěn)定性Fig.5 Emulsifying activity and emulsion stability of native and treated SPI

2.6 SPI的熒光猝滅分析結(jié)果

蛋白質(zhì)熒光圖被認(rèn)為是研究多酚與蛋白質(zhì)相互作用和結(jié)合的實(shí)用工具。本實(shí)驗(yàn)采用熒光猝滅光譜法評(píng)價(jià)EGCG與SPI在pH 7.0下的相互作用，結(jié)果如圖6所示。隨著EGCG濃度的增加，SPI、HSPI、USPI、UHSPI的熒光強(qiáng)度降低，并發(fā)生輕微紅移，這一結(jié)果表明EGCG的加入改變了蛋白的結(jié)構(gòu)，使疏水性基團(tuán)進(jìn)一步暴露[11]。其中，超聲輔助堿處理的SPI與EGCG相互作用，其熒光損失率最大。

圖7A為不同濃度EGCG猝滅超聲及堿處理SPI的Stern-Volmer圖，其猝滅相關(guān)常數(shù)如表2所示，SPI、HSPI、USPI、UHSPI的雙分子猝滅速率常數(shù)分別為1.390×1012、2.060×1012、2.450×1012、3.150×1012L/（mol·s），其均高于最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)（2×1010L/（mol·s）），因此SPI、HSPI、USPI、UHSPI與EGCG之間的猝滅為靜態(tài)的。Kq和Ksv反映了生物分子與猝滅劑的結(jié)合強(qiáng)度，較高的Kq和Ksv可能表明生物分子與猝滅劑更易結(jié)合[20]。對(duì)于靜態(tài)猝滅，用式（3）計(jì)算表觀結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n），結(jié)果如圖7B和表2所示，超聲輔助堿處理的SPI顯示出最大的表觀結(jié)合常數(shù)（6.560×104L/mol）與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（1.43），表明UHSPI對(duì)EGCG具有更大的結(jié)合力。由于蛋白質(zhì)與多酚的相互作用與蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)明顯相關(guān)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化可能會(huì)影響多酚的結(jié)合反應(yīng)，Chen Weijun等[11]研究發(fā)現(xiàn)，堿處理可以改變?nèi)榍宓鞍椎慕Y(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)蛋白與EGCG之間的結(jié)合力；此外，Shpigelman等[12]還提出，蛋白與EGCG結(jié)合強(qiáng)度的增加可能是熱處理使蛋白的疏水基團(tuán)暴露進(jìn)而與EGCG發(fā)生疏水性結(jié)合所致，因此，超聲輔助堿處理的SPI有著最強(qiáng)的結(jié)合能力可能是由于其結(jié)構(gòu)變化，這與本實(shí)驗(yàn)前面結(jié)構(gòu)變化討論的結(jié)果一致。

圖6 EGCG對(duì)SPI的熒光猝滅Fig.6 Fluoresecence quenching of native and treated SPI in the presence of EGCG

圖7 EGCG猝滅超聲及堿處理SPI的Stern-Volmer圖（A）及雙對(duì)數(shù)圖（B）Fig.7 Stern-Volmer plot (A) and double logarithm plot (B) of fluorescence quenching of native and treated SPI in the presence of EGCG

表2 SPI-EGCG復(fù)合物的雙分子猝滅速率常數(shù)、動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Table 2 Fluorescence quenching rate constant, dynamic quenching constant, apparent binding constant and binding site number of SPI-EGCG complex

2.7 EGCG的穩(wěn)定性分析結(jié)果

圖8 EGCG與不同處理SPI復(fù)合后的貯藏穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of EGCG complexed with native or treated SPI

多酚易受環(huán)境壓力的影響，從而發(fā)生氧化形成帶有顏色的醌類物質(zhì)，因此，研究多酚物質(zhì)的降解情況可以有效防止其發(fā)生降解，進(jìn)而提高其利用率[28]。圖8顯示了在室溫下貯存7 d期間對(duì)照組、HSPI、USPI和UHSPI對(duì)EGCG降解的保護(hù)情況?？梢钥闯?，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，游離EGCG的吸光度迅速上升，這表示EGCG發(fā)生了氧化降解[29-30]。SPI與EGCG復(fù)合后，其吸光度輕微降低，表明SPI對(duì)EGCG有較弱的保護(hù)能力，可能與蛋白的結(jié)構(gòu)及與EGCG的結(jié)合強(qiáng)度有關(guān)，EGCG與超聲處理、堿處理以及超聲輔助堿處理的SPI復(fù)合之后，其吸光度與對(duì)照組相比均進(jìn)一步降低；其中，超聲輔助堿處理展現(xiàn)出最好的保護(hù)作用，這可能與UHSPI具有較高的巰基含量及與EGCG較強(qiáng)的結(jié)合能力有關(guān)。Bae等[31]的研究表明蛋白質(zhì)的巰基可以作為抗氧化劑，從而抑制EGCG的氧化降解。Shpigelman等[12]研究發(fā)現(xiàn)熱處理的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與EGCG的結(jié)合強(qiáng)度增加，能夠保護(hù)EGCG不被降解。Chen Weijun等[11]還指出，堿處理的乳清蛋白與EGCG的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)增加，從而提高了EGCG的抗氧化性并延緩其降解速率。

3 結(jié) 論

本研究探究了超聲復(fù)合堿處理SPI結(jié)構(gòu)、功能的變化及其對(duì)EGCG的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲復(fù)合堿處理中堿處理可以誘導(dǎo)蛋白分子展開(kāi)，同時(shí)超聲提供的機(jī)械剪切及空化作用使蛋白分子結(jié)構(gòu)變得更松散，暴露出更多的疏水性基團(tuán)，比單一處理的方式更有效；堿處理、超聲處理、超聲復(fù)合堿處理均可以提高蛋白的乳化特性，超聲復(fù)合堿處理的效果最佳；熒光猝滅光譜分析結(jié)果表明，超聲復(fù)合堿處理的SPI與EGCG具有最強(qiáng)的結(jié)合能力，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)最多（1.43）；堿處理、超聲處理、超聲復(fù)合堿處理均可以防止EGCG氧化，超聲復(fù)合堿處理的保護(hù)效果最優(yōu)。本研究可為SPI在食品工業(yè)中作為乳化劑和功能性活性物質(zhì)載體的應(yīng)用提供理論參考。