澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物功能成分與抗氧化活性及其相關(guān)性分析

郭剛軍，胡小靜，付鎵榕，馬尚玄，徐 榮，黃克昌，彭志東，賀熙勇，鄒建云,

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100；2.文山學(xué)院化學(xué)與工程學(xué)院，云南 文山 663000）

自由基是人體新陳代謝酶促反應(yīng)所產(chǎn)生具有未成對電子的原子、分子、離子和基團(tuán)，其性質(zhì)活潑且具有強(qiáng)烈的氧化作用[1]。過量的自由基對人體危害很大，它可以氧化各種酶和蛋白質(zhì)的巰基，改變其功能和結(jié)構(gòu)；破壞細(xì)胞膜上的多糖結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞功能的發(fā)揮；損害核酸和染色體，使生物體發(fā)生突變或產(chǎn)生病變。攝入具有自由基清除能力的食物或藥物（即通常所說的抗氧化劑）可減緩自由基對機(jī)體的侵害，預(yù)防動脈粥樣硬化、糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤、機(jī)體衰老及各種炎癥等病變的發(fā)生[2-3]。許多研究證實(shí)植物源提取物和酚類、黃酮類、醌類、皂苷、多糖、生物堿等功能成分具有很好的抗氧化活性[4-6]。

澳洲堅(jiān)果（Macadamia ternifoliaF.Muell）又名夏威夷果、昆士蘭果、昆士蘭栗、澳洲胡桃等，原產(chǎn)于澳大利亞的亞熱帶雨林[7]，因其果仁營養(yǎng)豐富、口感細(xì)膩、味美可口、營養(yǎng)價值高，被譽(yù)為“堅(jiān)果之王”[8]。我國澳洲堅(jiān)果自上世紀(jì)九十年代開始商業(yè)化種植，現(xiàn)主要分布在云南、廣西和貴州等?。▍^(qū)），2017年種植面積279.64萬 hm2，占全球總種植面積的61.86%[9]。澳洲堅(jiān)果果實(shí)由青皮、果殼和果仁組成，其青皮占鮮果質(zhì)量的45%～60%，產(chǎn)量巨大[10-11]。研究表明，澳洲堅(jiān)果青皮中蘊(yùn)含蛋白質(zhì)、糖類、酚類、單寧、黃酮、酚酸、有機(jī)酸、皂苷、P、K、Ca、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn等多種營養(yǎng)與功能成分；其中，酚類中包含沒食子酸、對羥基苯甲醇、3,4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛等化合物，皂苷中含有極具生物活性與藥理作用的豆腐果苷和熊果苷成分[12-14]。澳洲堅(jiān)果青皮是采后處理加工環(huán)節(jié)的主要副產(chǎn)物，目前僅有極少量用作漚肥或飼料，絕大部分被丟棄，其本身所具有的保健、藥用和經(jīng)濟(jì)價值尚未引起足夠的重視，其提取物中總酚、黃酮、多糖等抗氧化成分含量及活性的相關(guān)研究也尚不多見。為此，本研究以澳洲堅(jiān)果青皮為實(shí)驗(yàn)材料，通過提取與萃取獲得其不同極性部位的分步提取物，測定其總酚、黃酮與多糖等主要功能成分含量，評價其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、超氧陰離子、2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力與還原力，并分析它們之間的相關(guān)性，以期為開發(fā)利用澳洲堅(jiān)果青皮資源提供一定的技術(shù)依據(jù)，有效促進(jìn)澳洲堅(jiān)果產(chǎn)業(yè)的健康、可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲堅(jiān)果青皮采自云南省熱帶作物科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)基地。

沒食子酸（色譜純）、蘆?。ㄉV純）、葡萄糖（色譜純）標(biāo)準(zhǔn)品 合肥博美生物科技有限公司；DPPH 美國Sigma-Aldrich公司；ABTS 上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SB-5200DT型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；BGZ-240型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA集團(tuán)；SGIA-100F型冷凍干燥機(jī) 寧波市雙嘉儀器有限公司；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋 上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠；UV-754N型紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技有限公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物的制備

新鮮澳洲堅(jiān)果青皮經(jīng)挑揀、清洗，40 ℃烘干，粉碎，過60 目篩，用80%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇在溫度60 ℃、料液比1∶8（m/V）條件下超聲提取2 h，重復(fù)3 次，合并提取液，過濾，減壓濃縮至無乙醇味。將80%乙醇提取物用適量蒸餾水充分混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，分別重復(fù)3 次，剩余提取液為水溶解物，減壓回收溶劑，冷凍干燥，得到澳洲堅(jiān)果青皮80%乙醇提取物、石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物與水溶解物，備用[15]。

1.3.2 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物功能成分測定

1.3.2.1 總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

采用福林-酚法測定總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)：總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參照文獻(xiàn)[16]，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，采用最小二乘法作線性回歸，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度x/（μg/mL）與吸光度y標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y＝0.013 9x+0.001 8，決定系數(shù)R2＝0.999 5。然后分別取10 mg澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，搖勻。量取1.0 mL定容液，依次加入1.0 mL福林-酚溶液與5.0 mL蒸餾水，室溫放置3～4 min，再加入3.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的Na2CO3溶液，40 ℃水浴60 min，在762 nm波長處測定其吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算得出澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.2 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

NaNO2-Al(NO3)3比色法測定黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)：黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參照文獻(xiàn)[17]，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，采用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度x/（mg/mL）與吸光度y標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y＝11.695x+0.01，決定系數(shù)R2＝0.999 5。然后分別取10 mg澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物，加蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，搖勻。量取2.0 mL定容液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液1.0 mL，室溫靜置5 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaOH溶液10 mL，蒸餾水定容至25 mL，靜置30 min，顯色，在510 nm波長處測定其吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算得出澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.3 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

苯酚-硫酸法測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)：多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參照文獻(xiàn)[18]，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)樣，采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度x/（μg/mL）與吸光度y標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y＝0.017 3x+0.008 5，決定系數(shù)R2＝0.999 2。然后分別取10 mg澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，搖勻。量取2.0 mL定容液，加入1.0 mL 5%苯酚溶液與5.0 mL濃硫酸，搖勻，70 ℃水浴15 min，在490 nm波長處測定其吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算得出澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除率測定

在10 mL試管中依次加入3.9 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液和0.1 mL不同質(zhì)量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，下同）澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品樣液，混勻后，在517 nm波長處測定其吸光度，記為As；再對0.04 mg/mL DPPH溶液在517 nm波長處測定吸光度，記為Ao，按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率[19]。

1.3.3.2 超氧陰離子自由基清除率測定

鄰苯三酚自氧化速率的測定：取4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）、4.2 mL蒸餾水混勻，25 ℃水浴保溫20 min，取出后立即加入25 ℃預(yù)熱過的3.0 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻后，在325 nm波長處每隔30 s測定其吸光度，計(jì)算線性范圍每分鐘內(nèi)吸光度的增加量，并以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照。

加入不同質(zhì)量濃度澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品樣液后鄰苯三酚自氧化速率的測定：按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入0.1 mL樣品液，蒸餾水相應(yīng)減少0.1 mL。同樣以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照。按照式（2）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率[15]。

式中：ΔA1/Δt為鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速率；ΔA2/Δt為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化反應(yīng)速率。

1.3.3.3 ABTS陽離子自由基清除率測定

取440 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液加入到25 mL 7 mmol/L ABTS溶液中混合，避光反應(yīng)12～16 h。使用前用80%乙醇溶液稀釋100 倍，使405 nm波長處吸光度為0.70±0.02，得到ABTS工作液。然后分別取0.15 mL不同質(zhì)量濃度澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品樣液加入5.7 mL ABTS工作液，混勻，室溫放置10 min，在734 nm波長處測定吸光度。按照式（3）計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率[20]。

式中：AControl為5.7 mL ABTS工作液與0.15 mL 80%乙醇混合后的吸光度；ASample為5.7mL ABTS工作液與0.15 mL樣品液混合后的吸光度。

1.3.3.4 還原力測定

分別取2.5 mL不同質(zhì)量濃度澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品樣液置于10 mL試管中，分別加入2.5 mL磷酸緩沖液（pH 6.6）和1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%鐵氰化鉀溶液，50 ℃反應(yīng)20 min，冰浴。冷卻至室溫后，加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，2 500 r/min離心20 min。取上清液5.0 mL加入4.0 mL蒸餾水，混勻，再加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% FeCl3溶液，室溫靜置10 min，在700 nm波長處測定其吸光度，還原力用樣品吸光度A表示[21]。

1.3.3.5 抗氧化能力評價指標(biāo)的計(jì)算

以澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，抗氧化能力為縱坐標(biāo)，研究其相關(guān)性與變化趨勢，求得線性回歸方程，以50%清除率對應(yīng)質(zhì)量濃度為樣品自由基清除能力半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）（IC50越低，抗氧化能力越強(qiáng)），斜率為增加系數(shù)（增加系數(shù)越大，隨質(zhì)量濃度增加，抗氧化能力增加越快），R2為決定系數(shù)，表示擬合性（R2越接近1，擬合效果越好）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件處理，應(yīng)用方差分析與鄧肯法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用皮爾遜法進(jìn)行相關(guān)性分析；運(yùn)用REG過程進(jìn)行多元線性回歸分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物功能成分分析結(jié)果

表1 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物功能成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of bioactive components in successive solvent extracts from macadamia green husk

酚類、黃酮與多糖等功能成分是植物生長代謝中的次生產(chǎn)物，廣泛存在于其葉、種子、根、莖、皮內(nèi)，是具有抗氧化活性的天然化合物[22]。由表1可知，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物中的總酚、黃酮、多糖與皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異明顯。其中，總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是乙酸乙酯提取物，為（40.36±0.48）%，與其他提取物均有顯著差異（P＜0.05）；其次是正丁醇提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（22.40±0.25）%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的是石油醚提取物，為（12.62±0.49）%。黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的也是乙酸乙酯提取物，為（41.68±0.93）%，與其他提取物均有顯著差異（P＜0.05）；其次是石油醚提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（24.80±0.86）%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的是正丁醇提取物與水溶解物，分別僅為（8.84±0.49）%與（7.55±0.96）%，兩者之間無顯著差異（P＞0.05）。多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是正丁醇提取物，為（22.08±2.09）%，與其他提取物均有顯著差異（P＜0.05）；其次是乙酸乙酯提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（8.78±0.46）%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的是氯仿提取物，僅為（0.74±0.09）%。張明楷等[23]研究表明不同品種澳洲堅(jiān)果青皮中含有5.04%～9.21%的蛋白質(zhì)；施蕊等[24]研究表明澳洲堅(jiān)果青皮乙醇提取物中含有豆腐果苷、熊果苷等皂苷類物質(zhì)。由此推測，本研究制備的澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物還含有皂苷、蛋白質(zhì)等其他成分，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是水溶解物，為（67.27±1.48）%，與其他提取物均有顯著差異（P＜0.05）；其次是80%乙醇提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（62.50±0.79）%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的是乙酸乙酯提取物，僅為（9.17±1.15）%。綜上可知，80%乙醇從澳洲堅(jiān)果青皮中提取了大量的功能成分。其中，乙酸乙酯從其提取物中富集的總酚和黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，正丁醇富集的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，可見它們對澳洲堅(jiān)果青皮中酚類、黃酮與多糖等成分的初步分離是有效的。

2.2 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物的抗氧化活性

2.2.1 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除作用

表2 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除能力Table 2 DPPH radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk at different concentrations

表3 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除效果指標(biāo)Table 3 Linear regression equations of DPPH radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk versus concentration and IC50

DPPH自由基是一種人工合成的、穩(wěn)定的有機(jī)自由基，具有制備方便、實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，其清除率被廣泛用于樣品抗氧化能力的評價[25-26]。由表2、3可知，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除率在不同質(zhì)量濃度間存在顯著差異（P＜0.05），相同質(zhì)量濃度不同提取物間也存在顯著差異（P＜0.05）。在質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，不同提取物對DPPH自由基清除率與其質(zhì)量濃度呈良好的線性正相關(guān)關(guān)系。其中乙酸乙酯提取物清除能力較強(qiáng)，相同質(zhì)量濃度下僅次于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時清除率為（22.50±0.53）%，與其他提取物與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品存在顯著差異（P＜0.05），隨著質(zhì)量濃度的增加，乙酸乙酯提取物清除率增加最快，增加系數(shù)為58.085，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，清除率為（70.09±0.73）%，與其他提取物、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品存在顯著差異（P＜0.05）；其次為正丁醇提取物，在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時清除率為（17.86±0.71）%，隨質(zhì)量濃度的增加，其清除率增加也較快，增加系數(shù)為45.100，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，清除率為（54.03±0.50）%。對DPPH自由基清除能力最差的為80%乙醇提取物，在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時清除率僅為（5.20±0.39）%，與相同質(zhì)量濃度下的水溶解物無顯著差異（P＞0.05），且隨質(zhì)量濃度的增加其清除率增加較慢，增加系數(shù)僅為10.105，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，清除率僅為（13.08±0.62）%。從評價樣品對DPPH自由基清除能力的IC50來看，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對DPPH自由基清除能力的大小順序?yàn)樘J丁標(biāo)準(zhǔn)品（IC500.29 mg/mL）＞乙酸乙酯提取物（IC500.67 mg/mL）＞正丁醇提取物（IC500.92 mg/mL）＞氯仿提取物（IC501.41 mg/mL）＞石油醚提取物（IC502.36 mg/mL）＞水溶解物（IC503.41 mg/mL）＞80%乙醇提取物（IC504.65 mg/mL）。

2.2.2 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對超氧陰離子自由基的清除作用

表4 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對超氧陰離子自由基的清除能力Table 4 Superoxide anion radical scavenging activity of successive solvent extracts from macadamia green husk at different concentrations

表5 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對超氧陰離子自由基的清除效果指標(biāo)Table 5 Linear regression equations of superoxide anion radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk versus concentration and IC50

生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)中，大約有2%～5%的氧會產(chǎn)生超氧陰離子自由基，其是羥基等多種自由基的衍生源，超氧陰離子自由基的清除能力是評價樣品抗氧化能力的一個重要指標(biāo)[27]。由表4、5可知，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對超氧陰離子自由基清除率與其質(zhì)量濃度呈較好的正相關(guān)關(guān)系。其中，正丁醇提取物清除能力最強(qiáng)，相同質(zhì)量濃度下優(yōu)于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及其他提取物，且差異顯著（P＜0.05），在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時清除率便達(dá)到（64.95±0.62）%，隨著質(zhì)量濃度的增加，其清除率增加相對較快，增加系數(shù)為16.290，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，清除率為（90.72±0.49）%；其次為氯仿提取物，在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時清除率為（44.67±0.64）%，與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及其他提取物存在顯著差異（P＜0.05），隨著質(zhì)量濃度的增加，其清除率增加相對較慢，增加系數(shù)為9.800，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，清除率僅為（52.92±0.67）%，與石油醚提取物無顯著差異（P＞0.05）。對超氧陰離子自由基清除能力較差的為80%乙醇提取物與水溶解物，在質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時清除率分別僅為（24.45±0.32）%與（33.84±0.68）%。從評價樣品對自由基清除能力的IC50來看，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對超氧陰離子自由基清除能力的大小順序?yàn)檎〈继崛∥铮↖C500.08 mg/mL）＞蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（IC500.18 mg/mL）＞氯仿提取物（IC500.72 mg/mL）＞石油醚提取物（IC500.89 mg/mL）＞乙酸乙酯提取物（IC501.02 mg/mL）＞水溶解物（IC501.16 mg/mL）＞80%乙醇提取物（IC502.57 mg/mL）。

2.2.3 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對ABTS陽離子自由基的清除作用

表6 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對ABTS陽離子自由基的清除能力Table 6 ABTS cation radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk at different concentrations

表7 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對ABTS陽離子自由基的清除效果指標(biāo)Table 7 Linear regression equations of ABTS cation free radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk versus concentration and IC50

ABTS陽離子自由基是通過過硫酸鉀氧化ABTS產(chǎn)生的一種自由基，其性質(zhì)非常穩(wěn)定，目前被廣泛應(yīng)用于樣品抗氧化能力的測定[28-29]。由表6、7可知，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對ABTS陽離子自由基均有較強(qiáng)的清除作用，且清除率與其質(zhì)量濃度呈良好的正相關(guān)關(guān)系。其中，乙酸乙酯提取物的清除能力較強(qiáng)，在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時，其清除率為（67.08±2.41）%，僅次于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，與其他提取物存在顯著差異（P＜0.05），隨著質(zhì)量濃度的增加，其清除率增加相對較快，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時便達(dá)到（96.99±0.18）%，與其質(zhì)量濃度在0.6、0.8、1.0 mg/mL時的清除率無顯著差異（P＞0.05），優(yōu)于相同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及其他提取物。正丁醇提取物的清除率也較高，在質(zhì)量濃度0.6 mg/mL時便達(dá)到了（97.07±0.18）%，與其質(zhì)量濃度在0.8 mg/mL及1.0 mg/mL時的清除率無顯著差異（P＞0.05），也與相同質(zhì)量濃度的乙酸乙酯提取物無顯著差異（P＞0.05），優(yōu)于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與其他提取物。80%乙醇提取物對ABTS陽離子自由基的清除能力相對較差，在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時的清除率僅為（27.30±2.38）%，但隨著質(zhì)量濃度的增加，其清除率增加較快，增加系數(shù)最大，為77.635，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到1.0 mg/mL時，清除率達(dá)到了（89.14±0.33）%。從評價樣品對自由基清除能力的IC50來看，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對ABTS陽離子自由基清除能力的大小順序?yàn)橐宜嵋阴ヌ崛∥铮↖C500.05 mg/mL）＞蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（IC500.07 mg/mL）＞正丁醇提取物（IC500.12 mg/mL）＞氯仿提取物（IC500.18 mg/mL）＞石油醚提取物（IC500.35 mg/mL）＞水溶解物（IC500.36 mg/mL）＞80%乙醇提取物（IC500.48 mg/mL）。

2.2.4 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物還原力分析結(jié)果

表8 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物的還原力Table 8 Reducing power of successive solvent extracts from macadamia green husk at different concentrations

還原力是評價生物樣品抗氧化活性的一個重要指標(biāo)，吸光度越大還原力越大[30]。由表8、9可知，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品具有較強(qiáng)的還原力，且還原力與其質(zhì)量濃度呈良好的正相關(guān)關(guān)系。其中，乙酸乙酯提取物的還原力最強(qiáng)，在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時便達(dá)到0.994±0.013，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到1.0 mg/mL時，還原力達(dá)到2.362±0.040，均與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及其他提取物存在顯著差異（P＜0.05）；其次為正丁醇提取物，相同質(zhì)量濃度下的還原力僅次于乙酸乙酯提取物，在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時的還原力為0.694±0.010，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到1.0 mg/mL時，還原力達(dá)到1.919±0.032。隨著質(zhì)量濃度的增加，氯仿提取物的還原力增加較快，增加系數(shù)最大，為1.343 0，在質(zhì)量濃度0.2 mg/mL時還原力為0.439±0.005，當(dāng)質(zhì)量濃度增加到1.0 mg/mL時，其還原力達(dá)到1.522±0.036。80%乙醇提取物的還原力相對較低，相同質(zhì)量濃度下還原力低于其他提取物，但在0.6～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的還原力仍高于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品。從評價樣品還原力的IC50來看，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品還原力的大小順序?yàn)橐宜嵋阴ヌ崛∥铮↖C500.09 mg/mL）＞正丁醇提取物（IC500.16 mg/mL）＞氯仿提取物（IC500.19 mg/mL）＞水溶解物（IC500.27 mg/mL）＞石油醚提取物（IC500.36 mg/mL）＞80%乙醇提取物（IC500.53 mg/mL）＞蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（IC500.68 mg/mL）。

2.3 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性及功能成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性分析結(jié)果

2.3.1 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果

表10 澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物各項(xiàng)指標(biāo)的皮爾遜相關(guān)系數(shù)及其相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果Table 10 Pearson coefficients between antioxidant properties and bioactive components and correlation test of successive solvent extracts from macadamia green husk

由表10可知，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性與功能成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)間存在良好的相關(guān)性，其對DPPH自由基的清除率與總酚、黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.803 5、0.775 7與0.544 4；對超氧陰離子自由基的清除率與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.615 9；對ABTS陽離子自由基的清除率與總酚、黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.742 2、0.565 7與0.514 2；還原力與總酚、黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.846 5、0.755 3與0.533 1。其抗氧化指標(biāo)間存在極好的相關(guān)性，其還原力與DPPH自由基、超氧陰離子自由基、ABTS陽離子自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.923 6、0.563 6與0.850 4；對ABTS陽離子自由基的清除率與DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.721 9與0.587 4；對超氧陰離子自由基清除率與DPPH自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.674 8。其功能成分間也存在良好的相關(guān)性，總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.790 5與0.496 6。上述分析結(jié)果表明，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性與其所含有的功能成分種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)密切相關(guān)，但其功能成分對抗氧化活性的貢獻(xiàn)是復(fù)合作用的結(jié)果，需進(jìn)一步進(jìn)行多元回歸分析。

2.3.2 澳洲堅(jiān)果不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性與功能成分多元回歸分析結(jié)果

植物及其不同部位提取物的強(qiáng)抗氧化能力并非單一功能成分的貢獻(xiàn)，而是多種成分共同作用的結(jié)果。不同功能成分聯(lián)用時可能會出現(xiàn)不同的結(jié)果，當(dāng)復(fù)合成分效果大于單獨(dú)成分效果時為協(xié)同作用，等于時為加和作用，而小于時則為拮抗作用[31]。為找出澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物不同功能成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)對其抗氧化活性的作用，分別以DPPH自由基清除率（Y1）、超氧陰離子自由基清除率（Y2）、ABTS陽離子自由基清除率（Y3）與還原力（Y4）為因變量，總酚（X1）、黃酮（X2）、多糖（X3）與皂苷及其他成分（X4）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量進(jìn)行逐步回歸分析，建立多元線性回歸方程（分別為I、II、III、IV），結(jié)果見表11。

表11 澳洲堅(jiān)果不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性與功能成分多元回歸分析結(jié)果Table 11 Results of multiple regression analysis between antioxidant activities and functional components of successive solvent extracts from macadamia green husk

由表11可知，澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除率與其總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的線性關(guān)系經(jīng)逐步回歸分析后，4 個成分變量因?qū)PPH自由基清除率的回歸均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）而被引入方程。同時總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)分別為-0.371 6、1.049 0、0.726 0與-0.160 8，表明其對DPPH自由基清除率作用的大小順序依次為黃酮＞多糖＞總酚＞皂苷及其他成分。經(jīng)方差分析，該模型的F值為93.51，P＜0.000 1，決定系數(shù)R2為0.968 2，說明其有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，效果理想。得到的回歸方程為Y1＝7.634 4-0.071 0X1+0.170 2X2+0.227 6X3-0.013 3X4，它可以把提取物的清除DPPH自由基活性與功能成分之間的關(guān)系量化，表明在共同作用時，其與黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，與總酚、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)。

澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對超氧陰離子自由基的清除率與總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的線性關(guān)系經(jīng)逐步回歸分析后，皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量被剔除，總酚、黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量因?qū)Τ蹶庪x子自由基清除率的回歸達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）而被引入回歸方程。同時總酚、黃酮與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)分別為-1.471 8、1.369 0與1.321 7，表明其對超氧陰離子自由基清除率作用的大小順序依次為總酚＞黃酮＞多糖。經(jīng)方差分析，該模型的F值為24.15，P＜0.000 1，決定系數(shù)R2為0.857 8，說明其有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，效果理想。得到的回歸方程為Y2＝29.024 5-0.405 0X1+0.320 0X2+0.597 2X3，它可以把提取物清除超氧陰離子自由基活性與總酚、黃酮與多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系量化，表明在共同作用時，其與黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，與總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，與皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性不顯著。

澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物對ABTS陽離子自由基的清除率與總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的線性關(guān)系經(jīng)逐步回歸分析后，黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量均被剔除，總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量因?qū)η宄实幕貧w達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量因?qū)η宄实幕貧w達(dá)到顯著水平（P＜0.05）而被引入回歸方程?？偡印⒃碥占捌渌煞仲|(zhì)量分?jǐn)?shù)變量的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)分別為0.717 8與0.267 4，表明其對ABTS陽離子自由基清除率作用的大小順序?yàn)榭偡樱驹碥占捌渌煞帧＝?jīng)方差分析，該模型的F值為22.20，P＜0.000 1，決定系數(shù)R2為0.788 5，說明其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，效果理想。得到的回歸方程為Y3＝40.305 6+0.188 8X1+0.030 4X4，它可以把提取物清除ABTS陽離子自由基活性與總酚、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系量化，表明在共同作用時，其與總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，與皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)，與黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性不顯著。

澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物的還原力與總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的線性關(guān)系經(jīng)逐步回歸分析后，總酚、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量均被剔除，黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量因?qū)€原力的回歸達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）而被引入回歸方程。黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變量的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)分別為0.745 8與0.519 5，表明其對還原力作用的大小順序?yàn)辄S酮＞多糖。經(jīng)方差分析，該模型的F值為71.00，P＜0.000 1，決定系數(shù)R2為0.916 6，說明其具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，效果理想。得到的回歸方程為：Y4＝0.298 2+0.004 5X2+0.006 0X3，它可以把提取物還原力與黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系量化，表明在共同作用時，其與黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，與總酚、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性不顯著。

3 結(jié) 論

澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物中，乙酸乙酯提取物總酚與黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，正丁醇提取物多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品具有較強(qiáng)的清除ABTS陽離子自由基能力與較高的還原力，對DPPH自由基與超氧陰離子自由基有一定的清除作用。其中，乙酸乙酯提取物對DPPH自由基清除能力優(yōu)于其他5 種提取物，但低于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，對ABTS陽離子自由基的清除能力與還原力優(yōu)于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及其他提取物；正丁醇提取物對超氧陰離子自由基的清除能力優(yōu)于蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品及其他提取物。澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物的抗氧化活性與其所含有的功能成分密切相關(guān)，是其共同作用的結(jié)果，對DPPH自由基的清除率與其黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，與總酚、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)；對超氧陰離子自由基的清除率與其黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，與總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，與皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性不顯著；對ABTS陽離子自由基的清除率與其總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，與皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著正相關(guān)，與黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性不顯著；還原力與黃酮、多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著正相關(guān)，與總酚、皂苷及其他成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān)性不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明澳洲堅(jiān)果青皮不同極性溶劑分步提取物尤其是乙酸乙酯提取物與正丁醇提取物具有較好的抗氧化活性，下一步可對其進(jìn)行系統(tǒng)的分離與分析，確定具體的抗氧化物質(zhì)，為澳洲堅(jiān)果青皮的深度開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。