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    黏質(zhì)沙雷菌磷脂酶A1輔助蛋白S對(duì)表達(dá)宿主菌大腸桿菌抑制作用機(jī)制

    2021-05-19 02:22:06甘玉飛薛正蓮
    食品科學(xué) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:電子顯微鏡磷脂酶細(xì)胞膜

    甘玉飛,薛正蓮,2,3,,周 杰,王 芳,王 洲,2,3,劉 艷,2,3

    (1.安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,安徽 蕪湖 241000;2.安徽省工業(yè)微生物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室,安徽 蕪湖 241000;3.微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心,安徽 蕪湖 241000)

    磷脂酶A1是一類專一水解磷脂sn-1位酰基的水解酶[1],目前磷脂酶A1在食品、醫(yī)療、紡織等行業(yè)用途十分廣泛,如被應(yīng)用在油脂脫膠[2-6]、生產(chǎn)溶血磷脂[7]、加工卵黃等[8]中。磷脂酶A1在微生物中主要由沙雷氏菌屬、假單胞菌、曲霉屬和埃希氏桿菌屬等產(chǎn)生。

    Song[9]和Fu Jianhong[10]等將來源于沙雷氏菌MK1和沙雷氏菌xjF1的磷脂酶A1在大腸桿菌中表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)沙雷氏菌磷脂酶A1基因下游有一段基因與磷脂酶A1在大腸桿菌中高活性的表達(dá)密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),一株來源于黏質(zhì)沙雷菌的磷脂酶A1基因下游有一段編碼序列,該基因序列的存在也能提高磷脂酶A1在大腸桿菌中的表達(dá)活性,并將該基因編碼蛋白命名為磷脂酶A1輔助蛋白S(phospholipase A1 accessory protein S,PlaS)。但無論是磷脂酶A1與PlaS共表達(dá),還是PlaS單獨(dú)表達(dá),都表現(xiàn)出對(duì)宿主大腸桿菌生長的抑制作用[11-12]。目前國內(nèi)外對(duì)于PlaS的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

    PlaS能提高磷脂酶A1的表達(dá)活性,但抑制宿主菌生長的作用又限制了磷脂酶A1酶活力的進(jìn)一步提高。所以研究PlaS抑制宿主菌的生長機(jī)理具有重要意義。N端截短技術(shù)被廣泛用于菌株分子改造和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究中[13-15]。朱昊等[15]將PlaS的N端區(qū)域的前35 個(gè)氨基酸截掉之后,發(fā)現(xiàn)PlaS對(duì)宿主細(xì)胞生長的抑制作用消失。同時(shí)也有研究表明Sr35蛋白過表達(dá)導(dǎo)致了煙草細(xì)胞死亡,而Sr35的截短突變體不會(huì)觸發(fā)細(xì)胞死亡[16]。因此本研究將從PlaS的N端進(jìn)行分析,進(jìn)行N端截短菌株構(gòu)建。掃描電子顯微鏡常用于細(xì)胞顯微觀察[17];流式細(xì)胞術(shù)是一門快速對(duì)單個(gè)細(xì)胞定性定量的技術(shù),可以檢測細(xì)胞所發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化[18],許多學(xué)者將其應(yīng)用到抑菌殺菌實(shí)驗(yàn)研究中[19-20]。

    本實(shí)驗(yàn)通過N端截短來尋找PlaS對(duì)宿主菌生長抑制的關(guān)鍵氨基酸序列,同時(shí)采用生長曲線檢測對(duì)截短結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,并用掃描電子顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測大腸桿菌,以探究其抑制機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、材料與試劑

    大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒pET28a(+)為實(shí)驗(yàn)室保存。P28工程菌是將質(zhì)粒pET28a(+)直接導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中;SP28工程菌是以質(zhì)粒pET28a(+)為載體,插入plaS基因,導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌中。

    限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、XhoI和T4連接酶美國賽默飛世爾科技公司;卡那霉素(kanamycin,Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)、TaqDNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)純化試劑盒和瓊脂糖上海生工生物技術(shù)有限公司;其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;引物合成及DNA測序由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行。

    1.2 儀器與設(shè)備

    T100 PCR儀 美國Bio-Rad公司;TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;S4800掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司;CytoFLEX流式細(xì)胞儀 美國貝克曼庫爾特公司。

    1.3 方法

    1.3.1 培養(yǎng)基及反應(yīng)緩沖液的配制

    LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g,滅菌水溶解后定容至1 L,調(diào)pH值至7.0,高溫高壓滅菌后4 ℃保存。

    Kan溶液:0.5 g Kan溶解與8 mL滅菌水中,定容至10 mL。用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾除菌,分裝(每份1 mL)后-20 ℃保存。

    IPTG溶液:稱取1.19 g IPTG溶解于40 mL滅菌水中,定容至50 mL。用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾除菌,分裝(每份1 mL)后-20 ℃保存。

    磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)(pH 7.4):稱取Na2HPO42.2 g、NaH2PO40.2 g、NaCl 8.5 g,滅菌水定容至1 L。

    1.3.2 PlaS氨基酸序列分析

    利用生物信息學(xué)網(wǎng)站對(duì)PlaS進(jìn)行信號(hào)肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、疏水結(jié)構(gòu)(https://web.expasy.org/protscale/)以及跨膜區(qū)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線分析。

    1.3.3 PlaS N端截短菌株構(gòu)建

    通過生物信息學(xué)網(wǎng)站分析,設(shè)計(jì)各個(gè)截短菌株(dS23P28、dS24P28、dS25P28、dS26P28、dS27P28,以dS23P28為例,即表達(dá)PlaS N端截短前23 個(gè)氨基酸后的蛋白的菌株,其他菌株以此類推)的上游引物,以及它們共同的下游引物(表1),利用PCR技術(shù),以SP28質(zhì)粒為模板,對(duì)截短輔助蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,34 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。然后選用XhoI和BamH I為限制性內(nèi)切酶,分別對(duì)膠回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物和pET28a(+)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,再用T4連接酶將二者4 ℃過夜連接構(gòu)成重組質(zhì)粒,經(jīng)過化學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)法將質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中,恢復(fù)培養(yǎng)后涂布于50 μg/mL Kan篩選平板培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜,隨后挑取單克隆,接種到含50 μg/mL Kan的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng),然后用培養(yǎng)好的菌液提取質(zhì)粒,并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,驗(yàn)證條帶準(zhǔn)確的菌株送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

    表1 N端截短菌株P(guān)CR擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences used for polymerase chain reaction for construction of N-terminal truncated mutants

    1.3.4 生長曲線測定

    將生長至對(duì)數(shù)生長期的菌液稀釋至OD600nm為0.2,按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量接到100 mL LB+50 μg/mL Kan培養(yǎng)基中培養(yǎng),待菌液OD600nm為0.6左右時(shí)加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),整個(gè)期間每隔2 h取樣一次,用紫外-可見分光光度計(jì)測定OD值,以空載菌株P(guān)28為對(duì)照,培養(yǎng)條件為37 ℃、200 r/min。構(gòu)建菌株的生長曲線均按照此方法進(jìn)行測定。

    1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察

    用掃描電子顯微鏡觀察菌株P(guān)28、SP28、dS27P28的顯微形態(tài),以空載菌株P(guān)28為對(duì)照。將各個(gè)菌株過夜活化后接種于LB+Kan培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.6左右,加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。之后分別取誘導(dǎo)0、4、8、12 h的菌液,用離心法收集菌體沉淀至綠豆大小,用PBS(pH 7.4)洗滌后在4 ℃下與體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛混合6 h進(jìn)行固定。固定后的菌體在PBS中沖洗兩次,每次20 min,再用乙醇(體積分?jǐn)?shù)依次為30%、50%、70%、85%、95%、100%)進(jìn)行梯度脫水,每次20 min。用無水丙酮置換出乙醇后,將細(xì)菌沉淀用二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法干燥,鍍金,掃描電子顯微鏡觀察。

    1.3.6 細(xì)胞膜通透性檢測

    將菌株過夜活化后接種于LB+Kan培養(yǎng)基中,在37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.6左右,加入終濃度0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)0、4、8、12 h時(shí)取1 mL菌液,4 ℃、4 000 r/min下離心10 min。用PBS(pH 7.4)洗3 次。將碘化丙啶(propidium iodide,PI)染料加入重懸的菌液,4 ℃避光下染色30 min。染色后將菌液過200 目的尼龍篩,放置于流式細(xì)胞儀中檢測。檢測以10 μL/min低速率記錄100 000 個(gè)細(xì)胞,用488 nm激發(fā)光檢測紅色熒光轉(zhuǎn)化的數(shù)字信號(hào)。

    1.3.7 PlaS N端27肽理化性質(zhì)分析

    使用在線程序ExPASyp-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)和Heliquest(http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py)對(duì)PlaS N端27肽的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、凈電荷、疏水性、疏水力矩進(jìn)行分析。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Origin軟件進(jìn)行圖表繪制。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 生物信息學(xué)分析PlaS氨基酸序列信息

    圖1 PlaS氨基酸信息分析Fig.1 Amino acid sequence analysis of PlaS

    對(duì)PlaS進(jìn)行信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn),該蛋白存在信號(hào)肽,為前23 個(gè)氨基酸(圖1A)。有研究表明,在原核表達(dá)過程中,外源信號(hào)肽的存在會(huì)影響蛋白質(zhì)的正常表達(dá)[21-23],如郭磊周等[24]研究發(fā)現(xiàn)耐輻射異常球菌疏水性LEA5C家族蛋白(DrwH)含有信號(hào)肽序列,DrwH蛋白過量表達(dá)抑制了大腸桿菌的生長。通過跨膜區(qū)及蛋白疏水性在線分析,發(fā)現(xiàn)蛋白前7~26 個(gè)氨基酸為典型的跨膜區(qū)域(圖1B),第10~27個(gè)氨基酸為疏水區(qū)(圖1C),有研究表明截去蛋白疏水區(qū)可高效穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白[25-26]。綜上,推測PlaS前23~27 個(gè)氨基酸有可能與PlaS在大腸桿菌中的表達(dá)特性及其對(duì)大腸桿菌生長抑制現(xiàn)象有關(guān)。

    2.2 PlaS N端截短菌株構(gòu)建結(jié)果

    對(duì)1.3.3節(jié)構(gòu)建的菌株進(jìn)行測序,測序結(jié)果和plaS全長基因進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)dS23P28、dS24P28、dS25P28、dS26P28、dS27P28都缺少了它們各自需要截短的氨基酸,且未截短部位突變少,相似度高,這表明PlaS N端截短菌株構(gòu)建成功。圖2為PlaS N端截短菌株的N端序列比對(duì)結(jié)果,使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)。

    圖2 PlaS N端截短菌株測序比對(duì)Fig.2 Sequence comparison of PlaS N-terminal truncated strains

    2.3 不同PlaS N端截短突變株異源表達(dá)生長特性變化

    圖3 PlaS N端截短菌株生長曲線Fig.3 Growth curves of PlaS N-terminal truncated strains

    以菌株SP28和構(gòu)建成功的N端截短系列菌株進(jìn)行了生長曲線測定,結(jié)果如圖3所示。在未加誘導(dǎo)劑IPTG時(shí)菌株生長狀況一致,在加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后dS27P28菌株生長情況良好,一直呈現(xiàn)指數(shù)增長狀態(tài),而表達(dá)PlaS的菌株SP28呈現(xiàn)相反情況,生長最慢,其他截短菌株在蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后均出現(xiàn)不同程度的生長抑制,由此可推測前27 個(gè)氨基酸的存在對(duì)其表達(dá)宿主大腸桿菌的生長有抑制作用。

    2.4 PlaS N端截短對(duì)大腸桿菌形貌的影響

    圖4 PlaS表達(dá)菌株掃描電子顯微鏡圖Fig.4 SEM images of PlaS expression strains

    細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞能導(dǎo)致細(xì)菌死亡。為了探討PlaS是否通過破壞細(xì)胞膜來抑制大腸桿菌的生長,采用掃描電子顯微鏡對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行了觀察。如圖4所示,在細(xì)胞生長過程中,對(duì)照組P28菌株有完整、光滑、規(guī)則的形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖4A~D)。相反,表達(dá)PlaS的菌株SP28隨時(shí)間變化的最顯著特征是細(xì)菌變形、破損。在4 h出現(xiàn)了褶皺、干枯(圖4F),在8 h出現(xiàn)部分細(xì)胞破損、壓縮(圖4G),在12 h出現(xiàn)細(xì)胞大量破損,細(xì)胞形態(tài)變得不完整(圖4H)。而表達(dá)截短N(yùn)端27 個(gè)氨基酸的PlaS菌株dS27P28又恢復(fù)了完整、光滑、有規(guī)則的形態(tài)結(jié)構(gòu),且隨時(shí)間延長未出現(xiàn)破損情況(圖4J~L)。這些現(xiàn)象說明PlaS對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜具有嚴(yán)重的損傷作用,也進(jìn)一步說明了PlaS N端前27 個(gè)氨基酸的存在對(duì)其表達(dá)宿主大腸桿菌的生長有抑制作用。

    2.5 PlaS N端截短對(duì)大腸桿菌細(xì)胞通透性影響

    為了進(jìn)一步探究PlaS對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的破壞情況,采用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行了定量分析。熒光染料PI能夠進(jìn)入細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞與核酸結(jié)合,而有完整細(xì)胞膜的細(xì)胞則不會(huì)被染色。用PI染料分別對(duì)誘導(dǎo)0、4、8 h的SP28和dS27P28菌株染色,并進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果可以看出,隨著時(shí)間推移,SP28菌株細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞比例在0 h時(shí)為9.54%(圖5A),4 h時(shí)為48.72%(圖5B),8 h時(shí)達(dá)到了66.92%(圖5C);相比之下,如圖5D~F所示,dS27P28菌株細(xì)胞膜損傷率增長則慢的多,8 h時(shí)為13.69%。這說明了PlaS對(duì)細(xì)胞膜有損傷影響,而PlaS的N端截短27 個(gè)氨基酸后則損傷現(xiàn)象消失,與掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果一致。

    圖5 流式細(xì)胞儀檢測的細(xì)胞膜完整性Fig.5 Detection of cell membrane integrity by FCM

    2.6 PlaS N端27肽的理化性質(zhì)分析結(jié)果

    PlaS N端27肽序列為MPEGRRLRRA LAIALLALAAVTGLLMM。ExPASyp-ProtParam tool軟件顯示該蛋白質(zhì)序列分子式為C128H231N39O31S3、分子質(zhì)量為2 908.66 Da、等電點(diǎn)為12。Heliquest軟件分析得到該肽凈電荷為+3、疏水性值為0.621 11、疏水力矩為0.147 12、疏水面為ALLLL,螺旋投影圖由Heliquest軟件得到(圖6)。根據(jù)軟件分析結(jié)果,PlaS N端27肽為帶陽離子正電荷的疏水性肽。Lin Yanlan等[27]通過設(shè)計(jì)分析一組新型陽離子抗菌肽,以進(jìn)一步了解抗菌肽與細(xì)胞膜的脂質(zhì)的相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)疏水性強(qiáng)的抗菌肽與細(xì)胞膜親和性強(qiáng);Hollmann等[28]選擇了兩種多肽——P5和P6.2進(jìn)行進(jìn)一步研究,發(fā)現(xiàn)它們對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌具有殺傷活性,同時(shí)破壞了兩株菌的細(xì)胞膜的完整性。因此PlaS對(duì)大腸桿菌的抑制作用可能是N端前27 個(gè)氨基酸陽離子的疏水性導(dǎo)致的。這27 個(gè)氨基酸組成肽的具體功能后續(xù)將做進(jìn)一步的研究。

    圖6 PlaS N端27肽螺旋投影圖Fig.6 Spiral projection of first 27 N-terminal amino acids of PlaS

    3 討 論

    本究結(jié)果顯示PlaS在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)后對(duì)其生長有較強(qiáng)的抑制作用,同時(shí)通過N端截短技術(shù)發(fā)現(xiàn)其抑制作用關(guān)鍵區(qū)域?yàn)镻laS N端前27 個(gè)氨基酸,且通過生長曲線測定、掃描電子顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜通透性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論。

    掃描電子顯微鏡觀察到PlaS表達(dá)菌株在4 h出現(xiàn)了褶皺、干枯,在8 h時(shí)出現(xiàn)部分細(xì)胞破損、壓縮,在12 h時(shí)相比出現(xiàn)大量破損,結(jié)構(gòu)變得不完整。這初步揭示了PlaS主要通過破壞大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)的完整性抑制其生長。很多學(xué)者研究表明細(xì)胞膜的完整性對(duì)于細(xì)菌生長至關(guān)重要,細(xì)胞損傷直接抑制了細(xì)菌的生長[29-32],而一般細(xì)胞破損會(huì)引起離子(K+、Na+、Ca2+)的泄漏[33],這會(huì)影響細(xì)胞正常的生命活動(dòng),其存活所需的各種生物酶也將不會(huì)被合成。流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)顯示在SP28菌株誘導(dǎo)表達(dá)8 h時(shí)細(xì)胞膜損傷率達(dá)到66.92%,也進(jìn)一步驗(yàn)證了PlaS對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜有損傷作用。

    對(duì)PlaS N端前27 個(gè)氨基酸組成的多肽進(jìn)行了理化分析,結(jié)果顯示其為陽離子疏水性多肽。微生物膜通常呈現(xiàn)陰離子表面,富含脂質(zhì)(如磷脂酰甘油),而陽離子與疏水性非常適合與微生物膜作用[34-35]。根據(jù)這個(gè)特點(diǎn)此27肽有望開發(fā)成新型抗菌肽。

    PlaS對(duì)其表達(dá)宿主大腸桿菌生長抑制及細(xì)胞損傷的分子機(jī)理還有待后續(xù)深入研究,可通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)技術(shù)比較SP28菌株和PlaS N端截短菌株之間與細(xì)胞膜合成有關(guān)基因(如oppA、ompA、lpxT、plsB等[36]及與細(xì)胞壁合成有關(guān)基因Pal、MtgA、NagA等[37])的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。

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