胡蘿卜類黃酮含量的測定及DcCHS基因家族的鑒定分析

張新業(yè)，王雨欣，孫艷香，朱 姝，王聰艷，李文靜

(1.廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊 065000；2.河北省動(dòng)物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊 065000； 3.廊坊市細(xì)胞工程與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊 065000)

類黃酮(flavonoids)，又稱黃酮類化合物，是一類重要的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，包括查爾酮(chalcones)、黃酮(flavones)、黃酮醇(flavonols)、花青素(anthocyanins)等[1]。類黃酮具有廣泛的生理作用，能夠參與植物色素的形成[2-3]，協(xié)助植物抵御非生物脅迫，并調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育[4]。此外，類黃酮還具有一定的藥理功能，如抗氧化、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤等[5]。因此，植物類黃酮的研究越來越受到重視。

查爾酮合成酶(chalconesynthase,CHS)屬于植物聚酮合酶超家族[6]，是類黃酮合成過程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，能夠催化三分子丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)與一分子香豆酰輔酶A(p-Coumaroyl-CoA)縮合形成柚皮素查耳酮(naringeninchalcone)，該產(chǎn)物是其他黃酮類物質(zhì)合成的基礎(chǔ)[7-8]。CHS基因首次從歐芹細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得[9]。近年來，隨著基因組測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，小立碗蘚(Physcomitrellapatens)[10]、番茄(Solanumlycopersicum)[11]、辣椒(Capsicumannuum)[12]、葡萄(Vitisvinifera)[13]、玉米(Zeamays)[14]和香蕉(Musaacuminate)[15]中的CHS基因家族被陸續(xù)鑒定。由于物種的不同，CHS基因家族成員的數(shù)目會(huì)有所差異。盡管如此，不同物種來源的CHS基因在結(jié)構(gòu)上較為保守，通常含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，外顯子1可編碼37～64個(gè)氨基酸殘基，外顯子2編碼約340個(gè)氨基酸殘基[16]。此外，分子進(jìn)化可能會(huì)引起CHS基因的內(nèi)含子數(shù)目發(fā)生變化[17]。CHS基因表達(dá)量的改變不僅能夠影響類黃酮的含量，而且可以調(diào)節(jié)植物花色、育性及抗逆性。Sun等[18]在矮牽牛(Petuniahybrida)中過表達(dá)香雪蘭(Freesiahybrida)CHS基因，使矮牽牛的類黃酮含量及花色均發(fā)生改變。邵莉等[19]研究表明，矮牽牛中CHS基因的轉(zhuǎn)錄被抑制后，不僅影響花色，還可導(dǎo)致雄性不育。Chen等[20]在煙草(Nicotianatabacum)中過表達(dá)紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)EaCHS1基因，除可提高煙草的類黃酮含量外，還增強(qiáng)了其抗鹽能力。

胡蘿卜(Daucuscarotasubsp.sativus)屬傘形科，是一種塊根作物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[21]，其營養(yǎng)豐富，含有大量的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素，是維生素K和維生素B6的良好來源[22]。到目前為止，胡蘿卜CHS基因家族還未見報(bào)道。胡蘿卜基因組測序的完成，為在全基因組水平上研究其CHS基因家族奠定基礎(chǔ)。本研究測定不同發(fā)育時(shí)期胡蘿卜根和葉中類黃酮的含量，同時(shí)利用生物信息學(xué)的方法鑒定胡蘿卜CHS基因家族，并對其進(jìn)行染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化樹構(gòu)建等分析，可為進(jìn)一步研究CHS基因家族在胡蘿卜類黃酮代謝過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 類黃酮含量測定

胡蘿卜品種‘橘紅一號(hào)’種子經(jīng)浸種后，種植于混合基質(zhì)[V(蛭石)∶V(營養(yǎng)土)=1∶1]中，置于人工氣候室內(nèi)(25 ℃光照14 h，18 ℃黑暗 10 h，光照強(qiáng)度為240 μmol·m-2·s-1)進(jìn)行培養(yǎng)。于苗期和收獲期分別采集胡蘿卜的根和葉， 105 ℃殺青15 min，70 ℃烘干至恒量。將烘干的胡蘿卜組織粉碎，過40目篩，稱取約0.05 g樣品，加入1 mL含量為60%的乙醇，60 ℃超聲提取30 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，用相同濃度的乙醇溶液定容至1 mL，即為樣品待 測液。

利用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法進(jìn)行類黃酮含量的測定(北京迪信泰檢測科技有限公司)。取60 μL樣品待測液于1.5 mL離心管中，加入 15 μL含量5%的亞硝酸鈉溶液，混勻，室溫靜置 5 min；加入15 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液，混勻，室溫靜置5 min；加入120 μL含量為4%的氫氧化鈉溶液和90 μL含量為60%的乙醇溶液，混勻，37 ℃水浴45 min，10 000 g離心10 min，取200 μL上清于微量比色皿中測定470 nm處吸光度，以蒸餾水作為空白對照。類黃酮含量表示為 mg·g-1。

以蘆丁為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取蘆丁 1 mg，加入含量為60%的乙醇溶液配制成 0.036 mg·mL-1、0.024 mg·mL-1、0.016 mg·mL-1、0.008 mg·mL-1和0.004 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定方法同上。

1.2 胡蘿卜CHS基因家族成員的鑒定

胡蘿卜基因組序列文件(Daucus_carota.ASM162521v1.dna.toplevel.fa)、CDS序列文件(Daucus_carota.ASM162521v1.cds.all.fa)、蛋白質(zhì)序列文件(Daucus_carota.ASM162521v1.pep.all.fa)及gff3數(shù)據(jù)格式文件(Daucus_carota.ASM162521v1.42.gff3)等均下載自EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)。

在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中以“chalcone synthase”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得CHS蛋白保守結(jié)構(gòu)域Chal_sti_synt_N及Chal_sti_synt_C的Pfam號(hào)PF00195和PF02797，下載各Pfam號(hào)對應(yīng)的隱馬爾科夫模型(Hidden Markov Model,HMM)文件(Chal_sti_synt_N.hmm和Chal_sti_synt_C.hmm)。利用hmmsearch程序?qū)蓚€(gè)HMM文件在胡蘿卜蛋白質(zhì)序列文件中進(jìn)行檢索，并將兩個(gè)HMM文件的檢索結(jié)果合并，剔除無完整讀碼框的序列，同時(shí)具有Chal_sti_synt_N和Chal_sti_synt_C兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白即為胡蘿卜CHS蛋白，然后利用NCBI數(shù)據(jù)庫中CD-Search工具對篩選到的胡蘿卜CHS蛋白進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。利用perl程序從胡蘿卜蛋白質(zhì)序列文件中提取CHS基因家族各成員的蛋白序列，使用在線工具ExPASy ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)對胡蘿卜CHS蛋白的氨基酸序列進(jìn)行等電點(diǎn)分析及分子質(zhì)量預(yù)測等。

1.3 胡蘿卜CHS基因的結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

從gff3文件中獲得胡蘿卜CHS基因外顯子和內(nèi)含子在染色體上的位置信息，并利用工具GSDS(Gene Structure Display Server)繪制基因結(jié)構(gòu)圖[23]。

利用perl程序從胡蘿卜gff3文件中獲取CHS基因家族在染色體上的位置信息，然后根據(jù)相應(yīng)染色體的長度信息，利用MapChart繪制CHS基因的染色體定位圖[24]。

1.4 胡蘿卜CHS蛋白性質(zhì)分析

利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、SignalP 4.1 Server[25](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和CELLO v.2.5[26](http://cello.life.nctu.edu.tw/)對胡蘿卜CHS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)和亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測 分析。

1.5 胡蘿卜CHS蛋白的結(jié)構(gòu)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用DNAMAN對鑒定到的胡蘿卜CHS蛋白進(jìn)行多序列比對，并利用MEGA6軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建胡蘿卜CHS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，bootstrap設(shè)置1 000次重復(fù)，其他參數(shù)均使用默認(rèn)設(shè)置[27]。使用MEME軟件在胡蘿卜CHS蛋白序列中搜索保守基序，將參數(shù)中的預(yù)測數(shù)目設(shè)置為10，長度設(shè)置為 6～100，其他參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置，同時(shí)利用PfamScan(https://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/)對鑒定到的保守基序進(jìn)行注釋[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜不同組織部位的類黃酮含量測定

測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品在470 nm處的吸光度，以蘆丁濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。求得回歸方程為y=11.564x-0.008 1，決定系數(shù)R2= 0.999 1，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度較高(圖1-A)。

類黃酮含量的測定結(jié)果表明，苗期胡蘿卜根和葉中的類黃酮含量分別為3.99 和19.69 mg·g-1，收獲期根和葉中的類黃酮含量分別為3.50和19.60 mg·g-1。無論在苗期還是收獲期，葉中的類黃酮含量均高于根中的含量，且達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。葉中的類黃酮含量在不同發(fā)育時(shí)期差異不顯著，而根中的類黃酮含量在不同發(fā)育時(shí)期差異顯著(P<0.05)(圖1-B)。

2.2 胡蘿卜CHS基因家族的鑒定

利用生物信息學(xué)的方法，從胡蘿卜基因組中鑒定到12個(gè)CHS基因家族成員，命名為DcCHS1～DcCHS12。分析家族成員的序列發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列長度為253～398 aa，其中DcCHS4及DcCHS5的氨基酸序列最長，DcCHS10最短；DcCHS蛋白分子質(zhì)量為26.91～44.00 ku，等電點(diǎn)為5.13～7.13。DcCHS基因的外顯子為1～3個(gè)，內(nèi)含子為0～2個(gè)(表1，圖2)。

從CHS基因在胡蘿卜基因組中的分布看，除DcCHS12未被定位到染色體上外，其余11個(gè)成員分布于胡蘿卜的5條染色體上。5號(hào)染色體上的基因數(shù)目最多(5個(gè))，4和6號(hào)染色體上的基因個(gè)數(shù)最少(1個(gè))，7號(hào)和9號(hào)染色體上均有2個(gè)基因。這表明CHS基因家族成員分布并不均勻，DcCHS2～6具有明顯的成簇分布現(xiàn)象[28](圖3，表1)。

2.3 胡蘿卜CHS蛋白的結(jié)構(gòu)分析

胡蘿卜CHS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主，分別占38.34%(DcCHS10)～ 48.34%(DcCHS9)和30.39%(DcCHS8)～ 36.80%(DcCHS2)；伸展鏈和β-轉(zhuǎn)角的占比較低，分別為13.81%(DcCHS9)～19.37%(DcCHS10)和5.63%(DcCHS9)～8.70%(DcCHS10)。經(jīng)預(yù)測，胡蘿卜CHS蛋白不含信號(hào)肽及跨膜區(qū)，且均定位于細(xì)胞質(zhì)中(表2)。對各成員的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果表明DcCHS1、DcCHS8和DcCHS10的N端存在大片段缺失，其他成員間序列長度差異不大(圖4，表1)；DcCHS7和DcCHS10之間一致性最低為 25.32%，而DcCHS4和DcCHS5的序列完全一致，可能是同一基因的兩個(gè)拷貝(表3)。此外，各成員均含有CHS蛋白的催化位點(diǎn)、底物特異性殘基、丙二酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)及CHS特征序列[18](圖4)。

表1 胡蘿卜CHS基因家族成員信息Table 1 Information of CHS gene family in carrot

表2 胡蘿卜CHS蛋白的結(jié)構(gòu)分析Table 2 Structure analysis of CHS protein in carrot

表3 CHS基因家族的氨基酸序列一致性Table 3 Identity of amino acid sequences of CHS gene family in carrot

2.4 胡蘿卜CHS蛋白系統(tǒng)發(fā)育及蛋白保守基序分析

為明確胡蘿卜CHS基因家族成員間的進(jìn)化關(guān)系，利用CHS基因家族的蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。胡蘿卜CHS蛋白被分為兩類：ClassⅠ和ClassⅡ，除DcCHS7、DcCHS12屬于ClassⅡ外，其余成員均屬于ClassⅠ。此外，ClassⅠ還可以被進(jìn)一步劃分為兩個(gè)亞類：SubclassⅠ和SubclassⅡ(圖5-A)。

利用MEME軟件對胡蘿卜CHS蛋白進(jìn)行保守基序分析，并對鑒定到的保守基序進(jìn)行功能注釋。在胡蘿卜CHS蛋白中共鑒定到10種保守基序，分別命名為motif1～motif10，其中motif1、4、6、7均為CHS蛋白N端結(jié)構(gòu)域，motif2、3、8均為CHS蛋白C端結(jié)構(gòu)域，motif3含有丙二酰輔酶A結(jié)合部位及CHS特征序列(圖5-B)。DcCHS7和DcCHS12所含motif的種類相同，DcCHS4、DcCHS5、DcCHS6、DcCHS9所含motif的種類相同，盡管不同家族成員的蛋白序列中所包含的保守基序的種類及數(shù)量有所差異，但所有成員均含有CHS蛋白的N端和C端結(jié)構(gòu)域(圖5-A)。

3 討 論

胡蘿卜是世界上分布廣泛的傘形科蔬菜，所含的黃酮類化合物(如山奈酚、槲皮素和木犀草素)使其具有較好的抗氧化、抗癌作用，并能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及減輕炎癥損傷[29]。陳建福等[30]利用響應(yīng)面法對胡蘿卜葉中類黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取條件：72%乙醇溶液作為提取劑，料液比為1∶15，超聲溫度和時(shí)間分別為 71 ℃和40 min，并利用NaNO2-Al(NO3)3比色法測得總黃酮含量為42.13 mg·g-1。本研究以60%乙醇作為提取劑，料液比為1∶20，60 ℃超聲提取30 min，采用同樣的方法測得苗期和收獲期葉中類黃酮的含量分別為19.69和19.60 mg·g-1，與前者結(jié)果不同，可能與提取條件及植物材料基因型的不同有關(guān)[31-32]。此外，本研究測得苗期和收獲期胡蘿卜根中類黃酮的含量分別為 3.99和3.50 mg·g-1，二者差異顯著，表明不同的測定時(shí)期也會(huì)影響類黃酮的含量[33]。

CHS是植物次生代謝產(chǎn)物類黃酮合成過程中的限速酶，是類黃酮代謝研究的熱點(diǎn)，通過調(diào)控CHS基因的表達(dá)可以有效改良類黃酮含量[34]。CHS主要以基因家族的形式存在于植物基因組中。前人已在小立碗蘚、番茄、辣椒、葡萄、玉米和香蕉基因組中分別鑒定到17、8、7、9、14和20個(gè)CHS基因家族成員[10-15]。本研究利用生物信息學(xué)的方法，從胡蘿卜基因組中鑒定到12個(gè)CHS基因家族成員。CHS基因通常含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子[16]，但不同物種間CHS基因的外顯子、內(nèi)含子數(shù)目會(huì)有所不同。胡蘿卜CHS基因的外顯子數(shù)為1～3個(gè)，內(nèi)含子數(shù)為0～2個(gè)，與番茄[11]、辣椒[12]中的結(jié)果類似，而香蕉MaCHS03、MaCHS13基因的內(nèi)含子4個(gè)，MaCHS05的內(nèi)含子則多達(dá)5個(gè)[15]。DcCHS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、伸展鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲構(gòu)成，含量分布為α-螺旋>無規(guī)卷曲>伸展鏈>β-轉(zhuǎn)角，且全部定位于細(xì)胞質(zhì)中，推測DcCHS蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能。香蕉中多數(shù)MaCHS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量分布及亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果與DcCHS蛋白類似[15]。DcCHS蛋白均含有CHS的保守序列，但氨基酸水平上的序列一致性變化幅度較大，為25.32%～100%，表明成員序列之間具有較高的遺傳多樣性。此外，DcCHS蛋白大都含有CHS蛋白的催化位點(diǎn)、底物特異性殘基及丙二酰輔酶A結(jié)合部位等與CHS蛋白功能密切相關(guān)的位點(diǎn)或序列，有助于后續(xù)進(jìn)一步研究胡蘿卜DcCHS蛋白的催化機(jī)理和酶活特性[6,18]。進(jìn)化分析表明，胡蘿卜CHS蛋白分為兩類，與番茄[11]和辣椒[12]中的研究結(jié)果一致。CHS基因的表達(dá)及CHS蛋白的積累在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯后水平均會(huì)受到調(diào)節(jié)[35]。CHS基因的表達(dá)通常受紫外線、植物病原菌侵染等因素的誘導(dǎo)，從而引起類黃酮含量的增加[6]，而參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子主要包括R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子或MYB-bHLH-WD40(MBW)蛋白復(fù)合體[36]。不同植物間CHS翻譯后調(diào)節(jié)的分子機(jī)理不盡相同。在擬南芥中，含Kelch結(jié)構(gòu)域的F-box蛋白-KFBCHS能夠介導(dǎo)CHS的泛素化降解[8]，而芍藥屬(Paeonia)植物則可通過鋅指結(jié)構(gòu)蛋白-PhRING-H2使PhCHS泛素化，并介導(dǎo)其降解[35]。

本研究測定了胡蘿卜不同發(fā)育時(shí)期、不同組織部位的類黃酮含量，并在全基因組水平上對類黃酮合成過程中的關(guān)鍵酶基因CHS進(jìn)行鑒定和分析。在后續(xù)的工作中，筆者將對DcCHS基因家族成員進(jìn)行表達(dá)分析，并探明DcCHS基因表達(dá)量與胡蘿卜類黃酮含量之間的關(guān)系，以期為今后進(jìn)一步研究DcCHS基因的表達(dá)調(diào)控及其在類黃酮合成過程中的作用奠定基礎(chǔ)。