E.coli對藏羊EECs相關(guān)凋亡因子表達的影響

王立斌，張興云，王 萌，潘陽陽，胡學(xué)權(quán)，韓金輝， 馬進彪，馬文斌，徐庚全，樊江峰，余四九

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

藏羊是中國綿羊三大品系(蒙古系、藏羊系和哈薩克綿羊系)之一，是青藏高原農(nóng)牧民重要的生產(chǎn)和生活資料，對該地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展具有極其重要的作用[1-3]。長期以來，由于粗放的養(yǎng)殖模式和落后的管理水平，藏羊在分娩及流產(chǎn)后很容易受到E.coli和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的感染[4-7]，使子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率保持較高水平，嚴(yán)重地影響了藏羊的繁殖能力，甚至造成死亡，給當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟發(fā)展和人民的生活水平帶來了很大的影響[8]。研究其子宮內(nèi)膜上皮細胞感染后相關(guān)凋亡因子的表達規(guī)律，對及早診斷和防治該病的發(fā)生具有重要意義。

細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，是細胞維持生命活動的重要過程。細胞凋亡對器官組織的生長發(fā)育、免疫、新陳代謝以及非正常細胞的清除具有重要意義[9-11]。而細胞凋亡的誘導(dǎo)與執(zhí)行需要一系列蛋白分子信號的共同作用，如信號分子、受體、蛋白酶和基因等。已有的研究表明，Caspase-3是最為關(guān)鍵的細胞凋亡執(zhí)行者,它在細胞凋亡的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12-16]。Caspase-3家族是直接導(dǎo)致凋亡細胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細胞凋亡機制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位。一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免[17-18]。Bcl-2蛋白家族是一類凋亡調(diào)控蛋白質(zhì)[19-20]，它是細胞凋亡的抑制基因，與Bax共屬于Bcl-2蛋白家族。而Bax蛋白不僅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，還具有進一步促進細胞凋亡的功能[21-23]。在通過線粒體應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡中Bax起關(guān)鍵作用。Bax大多以單體形式定位于胞漿中，少部分定位于EP等細胞器中。單體Bax不能刺激細胞色素c的釋放，Bax可以形成寡聚體，從細胞漿中轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，和Bcl-2形成多聚體，增強線粒體的通透性，最后導(dǎo)致細胞色素c釋放。另一方面，Bax低聚物在外膜插入形成通道，釋放Ca2+，對Bax有協(xié)同作用。以及后續(xù)的Caspase-9激活，Caspase蛋白酶家族的酶解級聯(lián)激活等，最終導(dǎo)致細胞凋亡[24-25]。

本試驗擬通過酶消化法分離培養(yǎng)藏羊EECs，用不同MOI的E.coli感染EECs后，采用流式細胞術(shù)檢測EECs的凋亡率，用qRT-PCR及WesternBlot在基因和蛋白水平上檢測Caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡因子在EECs上的表達，為揭示感染后細胞的凋亡過程和子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

細胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma3110，美國)，熒光倒置相差顯微鏡(CK41，Olympus，日本)，流式細胞儀(Cytomics FC 500MCL，美國)，qRT-PCR儀(LightCycler 96，德國)。

1.2 主要試劑

DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液(12400-016)、胎牛血清FBS(10099-141)；EGF；青霉素和鏈霉素(Gibco)；胰蛋白酶(Sigma)；YF488A-AnnexinV和(Propidium Iodide，PI)細胞凋亡檢測試劑盒(US EVERBRIGHTINC)；高效RIPA組織/細胞裂解液、4×蛋白上樣緩沖液(Solarbio)；Caspase-3(bs-0081R)、Bcl-2(bs-4563R)、Bax(bs-0127R)多克隆兔抗(Bioss)。

1.3 藏羊EECs培養(yǎng)與鑒定

采集青海省西寧市某屠宰場空懷期健康藏羊子宮10副，參考馬欣等[26]對綿羊子宮內(nèi)膜上皮細胞的純化培養(yǎng)方法，樣品用含雙抗生理鹽水沖洗，將子宮內(nèi)膜與肌肉組織分離，剪成細小組織塊，并用0.2%膠原酶Ⅰ消化，37 ℃震蕩水浴。過篩后離心獲取EECs，用添加50 ng/mLEGF的完全培養(yǎng)基DMEM(20%FBS(體積分?jǐn)?shù)))進行原代培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)將其消化純化；采用細胞免疫熒光方法檢測波形蛋白和角蛋白18在EECs上的表達。

1.4 檢測細胞凋亡

1.4.1E.coli感染藏羊EECs試驗 將細胞調(diào)整密度后接種在6孔板，在5% CO2下，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，PBS清洗后取3孔計數(shù)并取平均值；設(shè)置不同的MOI進行大腸桿菌感染試驗,即設(shè)空白對照組、1∶1組、5∶1組、10∶1組、 20∶1組、50∶1組共6組試驗?zāi)Ｐ?MOI為細菌數(shù)：細胞數(shù))，每孔各加2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并按所設(shè)MOI加入相應(yīng)體積大腸桿菌；37 ℃感染培養(yǎng) 3 h。

1.4.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 各組細胞經(jīng)上述步驟感染3 h后用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)對細胞進行消化，預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次后，用結(jié)合緩沖液重懸細胞，各加入5 μL YF488-AnnexinV和PI工作液，混合后室溫避光孵育15 min，加入400 μL結(jié)合緩沖液于流式細胞儀測定各試驗組細胞發(fā)生凋亡的比例。

1.5 細胞總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

提取感染細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；反應(yīng)體系(20 μL)：ddH2O 7 μL，5×gDNA digester Buffer 2 μL，gDNA digester1 μL，模板RNA1 μL，42 ℃孵育2 min，再加10 μL 2×HonorIISuperMixplus。反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min， 42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.6 引物設(shè)計

在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索羊Caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin基因序列，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計引物，由上海生工基因公司合成，引物序列見表1。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in thistest

1.7 qRT-PCR檢測 Caspase-3、 Bcl-2和Bax的基因表達水平

通過qRT-PCR檢測Caspase-3、Bcl-2和Bax的基因表達，β-actin為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系(20 μL)：TB Green Premix ExTaqⅡ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，cDNA模板2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，每個樣品按基因設(shè)4個重復(fù)組，試驗重復(fù)3次。通過2-△△Ct方法可得出上述基因的相對表達量并繪圖。使用SPSS 25軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.8 Western Blot檢測Caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表達水平

EECs感染3 h后，冰上對EECs進行裂解，10 min后收集；將裂解后的樣品10 000～14 000 g離心3～5 min，取上清；獲得的蛋白質(zhì)樣品與 4×蛋白上樣緩沖液按3∶1混合后于100 ℃條件下煮10 min對蛋白進行變性處理，加至10% SDS-PAGE凝膠樣品孔內(nèi)進行電泳分離(濃縮膠電壓為70 V，分離膠電壓為110 V)，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(轉(zhuǎn)膜條件：電流100 mA，時間60 min)，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，在含Caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin抗體反應(yīng)液中4 ℃孵育過夜，室溫條件下二抗孵育1 h，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光液于成像儀中進行顯影。利用Image J對蛋白表達情況進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏羊EECs培養(yǎng)與鑒定

培養(yǎng)獲得原代細胞(圖1-A)、純化后第3代(圖1-B)及第6代細胞(圖1-C)均長勢良好，呈鵝卵石樣生長；細胞免疫熒光方法檢測顯示，PBS和波形蛋白在上皮細胞質(zhì)上不表達，呈陰性(圖2-A、B)，角蛋白18在上皮細胞中特異性表達，細胞質(zhì)被染成紅色，呈陽性(圖2-C)。鑒定顯示，僅有極少成纖維細胞出現(xiàn)，藏羊EECs純度達到98%，可用于后續(xù)試驗。

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

經(jīng)E.coli感染藏羊EECs 3 h后，各感染組的凋亡率逐步增加，與對照組相比均差異顯著 (P<0.05)；對照組凋亡率為0.3%，MOI為 50∶1時，凋亡率為89%，達到最高；同時，隨著凋亡細胞的增加，活細胞數(shù)逐漸減少(圖3和圖4)。

2.3 qRT-PCR檢測 Caspase-3、 Bcl-2和Bax基因的表達

通過qRT-PCR方法測定Caspase-3、Bcl-2、Bax基因的相對表達量，其結(jié)果如圖5、6、7所示；不同MOI下，各因子基因表達存在差異性，經(jīng)E.coli感染藏羊EECs 3 h后，與對照組相比，當(dāng)MOI為1∶1時，Caspase-3和Bax基因的相對表達量升高不明顯(P>0.05)，但Bcl-2基因的相對表達量達到最高(P<0.05)；隨著MOI增加，除Bcl-2基因外，Caspase-3和Bax基因的相對表達量逐步增加，當(dāng)MOI為20∶1時，Bax基因的相對表達量達到最高(P<0.05)；當(dāng)MOI為 50∶1時，Caspase-3基因的相對表達量達到最高(P<0.05)，而Bcl-2基因的相對表達量最低 (P>0.05)。

2.4 Western Blot檢測 Caspase-3、 Bcl-2和Bax基因的表達

Western Blot方法測定Caspase-3、Bcl-2和Bax基因的表達量，其結(jié)果如圖8、9、10、11所示；Caspase-3、Bcl-2和Bax基因在蛋白合成過程中與其基因的相對表達量成正相關(guān)，即經(jīng)E.coli感染藏羊EECs 3 h后，當(dāng)MOI為1∶1時，Caspase-3和Bax基因的蛋白表達與空白組相比較低(P>0.05)，但Bcl-2基因的蛋白表達達到最高(P<0.05)；隨著MOI增加，除Bcl-2基因外，其余各基因的蛋白表達量逐步增加，當(dāng)MOI為20∶1時，Bax基因的蛋白表達達到最高(P< 0.05)；當(dāng)MOI為50∶1時，Caspase-3基因的蛋白含量達到最高(P<0.05)，而Bcl-2基因的蛋白含量最低(P>0.05)。

3 討 論

3.1 藏羊EECs體外分離培養(yǎng)

研究表明，EGF對細胞生長的影響具有物種差異性和劑量依賴性[27-30]，低劑量EGF可促進增殖，而高劑量EGF可誘導(dǎo)細胞周期停滯和凋亡[31]。本試驗通過酶消化法對藏羊EECs進行體外培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中添加50 ng/mL EGF。王偉[32]用0.25%膠原酶Ⅰ在37 ℃水浴消化奶牛子宮上皮組織3～4 h，得到了98%純度的EECs；馬欣等[26]用0.1%膠原酶Ⅰ在37 ℃消化綿羊子宮上皮組織6 h，得到了70%純度的EECs。本試驗則采用0.2%膠原酶Ⅰ 37 ℃震蕩水浴消化 6 h，依次過100目、200目、400目細胞篩后可得到所需的上皮細胞團，但純度稍低；同時用全培反沖400目過濾篩后可得到純度較高的上皮細胞團。試驗中在培養(yǎng)基中添加了50 ng/mL EGF，從原代細胞開始，細胞表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，細胞用0.25%胰蛋白酶利用差速消化法進行純化，只需30 s即可去除成纖維細胞，90～120 s可使所有細胞變圓漂浮，培養(yǎng)時貼壁情況也很好，可在 3～4次將成纖維細胞以及其他雜細胞快速去除干凈，經(jīng)鑒定可獲得純度在98%以上的藏羊EECs，獲得的細胞可傳至6代以上，并能用于后續(xù)試驗，這也為構(gòu)建藏羊子宮內(nèi)膜體外模型奠定了基礎(chǔ)。

3.2 Caspase-3、 Bcl-2和Bax的表達

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式，可有序、高效地清除受損細胞，如 DNA 損傷或發(fā)育過程中造成的細胞凋亡。細胞凋亡可由來自細胞內(nèi)的信號觸發(fā)，如遺傳毒性應(yīng)激，或由外在信號觸發(fā)，如配體與細胞表面死亡受體的結(jié)合[33]。趙凌[34]用不同濃度的S.aureus、E.coli對奶牛乳腺上皮細胞進行感染后發(fā)現(xiàn)，凋亡率隨菌液濃度的增加而上升，本試驗與其研究結(jié)果一致。細胞凋亡和壞死，這兩個過程可以獨立發(fā)生，也可以同時發(fā)生，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，細胞的死亡并不是單一因素造成的，細胞發(fā)生炎癥反應(yīng)時伴隨著細胞的凋亡和壞死，炎癥反應(yīng)介導(dǎo)了細胞凋亡和壞死的發(fā)生，這對因細菌感染引起的子宮內(nèi)膜炎機制有了更進一步的解釋，對下一步如何防治子宮內(nèi)膜炎有重要意義。

Caspase-3、Bcl-2、Bax是細胞凋亡的重要信號通路之一，其中Caspase激活是啟動凋亡的關(guān)鍵因素。細胞遭受損傷或在傷害性因子刺激下，其線粒體外膜被破壞，通透性增加，導(dǎo)致Cyt-C釋放進入胞質(zhì)，與Caspase-9凋亡蛋白激酶激活因子等相結(jié)合形成凋亡小體，激活Caspase-3，啟動細胞凋亡，Caspase-3可激活特定信號系統(tǒng)，產(chǎn)生核皺縮、DNA片段形成等凋亡現(xiàn)象，最終導(dǎo)致細胞凋亡[35-36]。Nguyen等[37]證明Caspase-3的高表達和細胞凋亡密切相關(guān)。在細胞凋亡過程中，多種因子參與調(diào)控凋亡進程，抑凋亡因子(如Bcl-2、Bcl-xl及survivin等)抑制Caspase級聯(lián)反應(yīng)進而抑制凋亡。促凋亡因子(如Bax、Bak及Bid等)可激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡[38]。Bcl-2蛋白質(zhì)家族之間的相互作用對細胞凋亡的調(diào)控起著重要作用，研究表明Bcl-2在神經(jīng)元細胞的抗凋亡機制中起重要作用，朱旻宇等[39]證明Bcl-2表達可以強力抑制細胞凋亡并且增強細胞活性，Smerage等[40]通過向脊髓損傷大鼠轉(zhuǎn)染Bcl-2基因的試驗發(fā)現(xiàn)Bcl-2基因會轉(zhuǎn)運到Clarke核神經(jīng)元，從而減少細胞萎縮并防止細胞死亡，對細胞凋亡起到抑制作用，Bax基因則促進細胞凋亡進程。本試驗結(jié)果表明，Caspase-3、Bcl-2、Bax基因的mRNA表達量與蛋白的表達量成正相關(guān)，Caspase-3和Bax的表達量隨MOI的增大逐步升高，Bcl-2則逐步降低，與上述研究結(jié)果相似，EECs接種E.coli后，不僅能夠引起EECs的局部感染以及形態(tài)變化，同時也能夠引起EECs對凋亡因子在基因和蛋白水平上表達的變化。因此，上述各凋亡因子可作為識別藏羊子宮內(nèi)膜炎病理程度的重要指標(biāo)。

4 結(jié) 論

在培養(yǎng)液中加入50 ng/mL EGF后用酶消化法可以分離出培養(yǎng)出藏羊EECs，通過波形蛋白及角蛋白18免疫熒光鑒定，EECs純度達到98%以上，為研究藏羊子宮內(nèi)膜生殖生理機制提供體外細胞模型。不同MOI的E.coli感染后，藏羊EECs結(jié)構(gòu)逐漸遭到破壞，且MOI越大，細胞凋亡越嚴(yán)重。Caspase-3和Bax的表達量隨MOI的增大逐步升高，Bcl-2則逐步降低，這些因子可作為識別藏羊子宮內(nèi)膜炎病理程度的重要指標(biāo)。