髓細胞觸發(fā)受體2對大鼠顱腦創(chuàng)傷后認知功能障礙的影響

趙 莉,孫中磊,楊 齊,劉英富,張 賽,3

(1.中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學中心,天津,300162;2.山東省棗莊礦業(yè)集團中心醫(yī)院,山東 棗莊,277000; 3.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復重點實驗室,天津,300162; 4.滄州醫(yī)學高等?？茖W校納米抗體研究所,河北 滄州,061001)

創(chuàng)傷后認知功能障礙是一種進行性和致命性的神經(jīng)退行性疾病，因其漸進性的記憶喪失、認知困難和思想意識損害，嚴重影響患者日常活動[1-2]。神經(jīng)病理學的特征包括細胞內高磷酸化的tau聚集和細胞外β-淀粉樣斑塊形成，與阿爾茨海默病(AD)先天免疫的激活、突觸功能障礙和神經(jīng)元丟失相一致[3]。髓樣細胞2(TREM2)是一種免疫球蛋白(Ig)超家族受體，其表達增加對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)具有保護作用，主要表現(xiàn)為對小膠質細胞高度特異性，且已經(jīng)在各種鼠模型中進行了研究[4]。神經(jīng)元自噬已被證實在神經(jīng)退行性疾病中有助于清除錯誤折疊的蛋白和減少炎癥細胞因子[5]。目前，關于小膠質細胞自噬作用機制的研究仍較少。研究[6]表明，小膠質細胞自噬有助于β淀粉樣蛋白(Aβ)的清除，抑制炎性小體3(NLRP3)的激活，改善認知功能障礙。已有研究[7]表明TREM2影響小鼠的小膠質細胞表型和激活狀態(tài)，但TREM2相關的小膠質細胞自噬對大鼠顱腦創(chuàng)傷(TBI)后認知功能作用機制尚未闡明。本研究通過建立過表達TREM2大鼠TBI模型，探討TREM2相關的小膠質細胞自噬作用，以期為TBI后認知功能障礙尋找新的治療方向，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

雄性SD大鼠24只,28～32月齡，體質量600～700 g(軍事醫(yī)學科學院)。所有動物實驗程序均按照醫(yī)院批準的動物規(guī)程和指南進行?？贵w Aβ1-42、tau、TREM2、LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、β-actin(美國Abcam公司)，AAVrh.10 TREM2和AAVrh.10Null(濟南思科生物科技有限公司)。SYBR Green實時PCR預混試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 TBI模型與分組:大鼠TBI模型采用皮質撞擊致傷法建立[8],術前8 h禁食禁飲,2%異氟烷吸入麻醉后備皮，沿矢狀縫切開皮膚，剝離骨膜，在前囟右后外側3 mm處行顱鉆鉆孔(直徑約4 mm),顯露硬腦膜，俯臥位固定于立體定向儀上，將eCCI打擊臂調整至與垂直方向呈20°角，使用3 mm打擊帽精確打擊大腦皮層。打擊參數(shù)為(AP為-2.5 mm,R為2.5 mm,H為3 mm),打擊速率均為5 m/s,打擊最低點持續(xù)時間均為200 ms。試驗過程中，大鼠均未出現(xiàn)需安樂死的嚴重并發(fā)癥。

將24只大鼠隨機分為sham組(假手術)、TBI組和TBI并TREM2組(TREM2過表達)，每組8只。其中TBI組和TBI并TERM2組采用皮質打擊構建大鼠TBI模型,sham組僅開骨窗;TREM2過表達模型采用腺病毒相關病毒(AAVrh.10)AAVrh.10 TREM2腦室注射構建,sham組和TBI組注射等量AAVrh.10衣殼AAVrh.10Null。實驗28 d,采用Morris水迷宮實驗評估各組大鼠學習記憶功能，取腦組織，采用免疫印跡法(Western blot)評估TREM2和認知相關蛋白表達水平，Western blot法和免疫熒光評估自噬蛋白表達水平。

1.2.2 慢病毒載體治療:將小鼠麻醉并固定在立體定位框架上，以前囟為坐標原點，將慢病毒載體注射到右側腦室(立體定位坐標:向外1.7 mm,向后1.2 mm,硬腦膜下方3.0 mm,中線附近1.0 mm,前囟后0.2 mm,顱骨以下3.0 mm),將33號針頭的Hamilton 710系列注射器(1～5 μL)固定在立體定向儀的注射泵上，針頭緩慢進入目標結構，停留1 min,向雙側腦室分別注射載體(每個部位2 μL，速度0.5 μL/min),注射后，針頭停留2 min以減少回流，然后緩慢撤回。注射后，縫合皮膚，觀察小鼠麻醉恢復及神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥情況。

1.2.3 Morris水迷宮實驗:實驗第24～28天，通過Morris水迷宮實驗觀察大鼠學習記憶功能。水迷宮直徑150 cm,高60 cm,放滿水，通過添加脫脂奶粉使其不透明，控制水溫25 ℃左右。在第一象限水面下1 cm設置平臺。將小鼠分別從水池4個象限放入水池中，開始計時，觀察并記錄小鼠從不同象限放入后找到平臺的時間，即逃避潛伏期時間。

1.2.4 Western blot實驗:將左半腦組織破碎后，使用RIPA緩沖液從腦組織中收集蛋白質,BCA法測定蛋白總濃度，使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉移至聚偏二氟乙烯膜上。使用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h,然后在4 ℃下分別與一抗(TREM2、iNOS、Arg-1、Aβ1-42、tau和β-actin)孵育過夜。用洗膜緩沖液(TBST)洗滌后將膜與山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。使用增強的化學發(fā)光系統(tǒng)(ECL試劑盒)檢測免疫反應性條帶，并使用ImageJ 1.42q軟件程序分析圖像。

1.2.5 免疫熒光檢測:采用4%多聚甲醛將右半腦組織固定48 h后，石蠟切片，切片在磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST) (含0.1% Triton X-100/PBS) 中洗滌30 min,用5% 牛血清白蛋白(BSA)和10%正常驢血清阻斷60 min。LC3-Ⅱ/DAPI熒光標記染色。切片首先與兔抗LC3-Ⅱ一抗孵育(1∶5 000),4 ℃過夜。隨后用PBS沖洗切片并孵育二抗(與紅色熒光團結合的驢抗兔IgG)(1∶1 000),室溫孵育1 h。DAPI染色后使用hoechest33342染色。所有切片均在共聚焦顯微鏡下觀察。通過計算掃描軟件對陽性熒光個數(shù)進行量化。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 TREM2過表達促進TBI大鼠小膠質細胞自噬

與sham組相比,TBI組大鼠腦組織TREM2表達水平升高，自噬標記物(LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)表達水平升高,P62表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與TBI組相比,TBI并TREM2組大鼠腦組織TREM2表達水平升高，自噬標記物(LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)表達水平升高,P62表達水平下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

A:TREM2、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62免疫印跡條帶;B:TREM2表達水平量化;C:LC3Ⅱ表達水平量化;D:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平量化;E:P62表達水平量化;F:LC3Ⅱ免疫熒光陽性點斑數(shù);G:LC3Ⅱ免疫熒光和hoechest33342染色(綠色熒光標記小膠質細胞，藍色熒光標記細胞核，黃色箭頭標記自噬小體陽性點斑，放大倍數(shù)50倍)。與sham組比較,*P<0.05;與TBI組比較,#P<0.05。

2.2 TREM2治療改善了TBI大鼠學習記憶功能

在第28天的定位航行實驗中，與sham組相比,TBI組大鼠逃避潛伏期延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與TBI組相比,TBI并TREM2的逃避潛伏期縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 TREM2過表達減少TBI誘導的Aβ1-42、tau蛋白表達

與sham組相比,TBI組Aβ1-42、tau蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與TBI組比,TBI并TREM2組Aβ1-42、tau蛋白水平下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

AD的神經(jīng)免疫情況非常復雜，相關研究[9-10]表明神經(jīng)膠質細胞(尤其是小膠質細胞)在疾病中起關鍵作用。AD的疾病風險主要為TREM2突變功能喪失，促進TREM2表達可能是治療AD的有效方法[4]。研究[11]表明，在骨髓細胞中異位表達TREM2后，將其體內注射可以改善實驗性自身免疫性腦脊髓炎。但直接的TREM2治療會發(fā)生毒性作用，因此可增加其表達或蛋白質水平，使更多的TREM2可響應適當?shù)膬仍葱源碳ぃ@可能是治療AD和TBI后認知功能障礙的方法[12]。本研究結果表明，大鼠TBI后腦組織中TREM2表達增加，體內過表達TREM2 治療后,TBI介導的tau、Aβ1-42表達顯著減少，且認知功能評分顯著提高，這說明促進適量的TREM2表達可有益于治療TBI后認知功能障礙。人類遺傳數(shù)據(jù)表明,TREM2在AD中發(fā)揮作用，但并未闡明在臨床AD階段激活TREM2和小膠質細胞是否有益。TREM2可能只在淀粉樣蛋白積累的早期或預示著tau病理和神經(jīng)元喪失的淀粉樣蛋白積累早期，可增加小膠質細胞的活性，但一旦變性開始，此做法可能是有害的。因此，本研究選擇在TBI后立即干預TREM2表達。

既往研究[4]表明，在TREM2缺陷型AD小鼠中，最一致的表型是明顯缺乏小膠質細胞活化。當缺少TREM2時，淀粉樣蛋白在AD小鼠模型誘導的小膠質細胞基因表達譜被高度靜默[13]。此外，在小鼠腦中，與TREM2完整的小膠質細胞相比,TREM2沉默小膠質細胞，增加淀粉樣斑塊附近的細胞凋亡[14]。AD小鼠模型和AD患者的一個顯著特征是小膠質細胞聚集在斑塊周圍，在神經(jīng)元和Aβ之間提供保護性屏障，從而防止神經(jīng)元營養(yǎng)不良[15]。小膠質細胞可通過TREM2依賴性機制控制淀粉樣斑塊的結構，并在斑塊和相鄰的神經(jīng)纖維之間形成屏障。在小膠質細胞保護的區(qū)域，斑塊周圍營養(yǎng)不良軸突的形成減少了70%，這表明小膠質細胞和TREM2活性可減弱斑塊環(huán)境的神經(jīng)毒性[16-17]。

已知自噬與AD相關，沉默Beclin1基因可減少原代神經(jīng)元自噬，并增加AD模型中的Aβ沉積[18]。雷帕霉素介導的mTOR抑制可導致海馬Aβ42水平降低，并能通過增加自噬來改善記憶缺陷[19]。上述研究表明神經(jīng)元自噬在AD進展中起保護作用。本研究表明,TREM2過表達促進神經(jīng)細胞自噬，與相關研究結果一致。本研究采用免疫熒光標記小膠質細胞，結果表明TREM2過表達也可促進TBI后小膠質細胞自噬反應。但有研究[7]表明，TREM2在減弱小膠質細胞自噬中發(fā)揮作用，TREM2抑制的小膠質細胞含有更多的自噬囊泡。TREM2缺陷型小膠質細胞自噬增加是由于小膠質細胞試圖用自噬作為生存機制補償mTOR缺陷。從TREM2沉默小鼠中發(fā)現(xiàn)，小膠質細胞的mTOR信號轉導受損,TREM2維持小膠質細胞處于高代謝狀態(tài)是通過增強mTOR途徑激活[20]。研究[21]表明，小膠質細胞通過清除髓鞘和細胞碎片等神經(jīng)元源性成分來維持大腦穩(wěn)態(tài)，保護神經(jīng)功能。研究[22]提出，大鼠TBI后，靶向小膠質細胞自噬可能為治療腦外傷的一種策略。

綜上所述,TREM2過表達可能通過調節(jié)小膠質細胞自噬來改善TBI后認知功能障礙。