人微小病毒 B19熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法的建立

許良云,張其剛,范廣來(lái),趙建華

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院,江蘇 南京,210009; 2.江蘇省淮安市婦幼保健院 基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用示范中心,江蘇 淮安,223002)

人微小病毒B19(HPV B19)屬于微小病毒科、微小病毒亞科、紅病毒屬，最早于1975年被發(fā)現(xiàn)[1-3]。HPV B19呈二十面體，直徑為22～24 nm,是一種無(wú)包膜的單鏈、線性DNA病毒。HPV B19感染可引起胎兒水腫、再生障礙性貧血、腎小球病等[4-5]多種疾病。HPV B19基因組有2個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),左端ORF編碼對(duì)宿主細(xì)胞有細(xì)胞毒性的結(jié)構(gòu)蛋白NS1,該序列高度保守;右端ORF編碼該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2,VP1和VP2序列為高變區(qū)。

HPV B19以呼吸道傳播為主，常在冬季和春季流行，流行病學(xué)爆發(fā)的周期一般為3～5年，但偶發(fā)病例可在全年發(fā)生[6]。HPV B19的檢測(cè)方法主要為特異性免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)血清學(xué)檢測(cè)和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)病毒核酸檢測(cè)。本研究基于NS1保守區(qū)序列，建立HPV B19的通用型熒光定量PCR檢測(cè)方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣本為單純皰疹病毒(HSV) 2型、巨細(xì)胞病毒(CMV)、B族鏈球菌(GBS)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV) 陽(yáng)性DNA樣本以及反復(fù)流產(chǎn)婦女外周血標(biāo)本。

1.2 主要儀器和試劑

Probe qPCR Mix(TakaRa,Code No.RR391A);細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 (北京天根生化公司,Code No.DP305-02);StepOnePlus熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司);Qubit 3核酸/蛋白質(zhì)定量熒光計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher公司);生物安全柜等。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針的設(shè)計(jì):通過(guò)NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢HPV B19 3類基因型代表性的5株序列(GenBank:M13178;AY582162;AY044266;NC_004295;AY582153),運(yùn)用在線工具M(jìn)AFFT(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)比對(duì)NS1區(qū)序列，選取保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物和探針。見(jiàn)表1。

表1 HPV B19實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物及探針

1.3.2 制備質(zhì)粒:按照病毒株M13178的序列，由上海生工生物合成引物擴(kuò)增區(qū)的寡核苷酸序列，將該片段插入到pUC57載體中獲得HPV B19質(zhì)粒，質(zhì)粒全長(zhǎng)為2912 bp。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)凝膠電泳分析及Qubit核酸/蛋白質(zhì)定量熒光計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)質(zhì)粒DNA大小、濃度以及脫氧核苷酸堿基的平均分子量計(jì)算質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)(1 ng≈3.18×108拷貝)。

1.3.3 質(zhì)粒分子適用性鑒定:對(duì)質(zhì)粒DNA分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳分析及Sanger測(cè)序，并與病毒株M13178的序列進(jìn)行序列比對(duì)。以104拷貝/μL的質(zhì)粒DNA為模板，在StepOnePlus熒光定量PCR儀上優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)體系的引物探針比例，每個(gè)組合設(shè)4個(gè)平行重復(fù)，共15組。按照10倍梯度稀釋，將質(zhì)粒分子DNA稀釋至107、106、105、104、103和102拷貝/μL以及20拷貝/μL,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)平行重復(fù)，計(jì)算R2和反應(yīng)效率(E),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)效率E計(jì)算公式為E=10-1/K-1(K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)。以10拷貝/μL和1拷貝/μL質(zhì)粒分子DNA為模板，擴(kuò)增20次反應(yīng)檢測(cè)質(zhì)粒分子用于確定實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的檢測(cè)下限(LOQ)。

1.3.4 反復(fù)流產(chǎn)婦女外周血HPV B19的檢測(cè):使用定量PCR方法對(duì)34份排除了染色體核型異常以及弓形蟲(chóng)(Tox)、風(fēng)疹病毒(RV)、CMV和HSV感染的反復(fù)流產(chǎn)孕婦外周血樣本進(jìn)行HPV B19檢測(cè)。

1.3.5 特異性鑒定:應(yīng)用陽(yáng)性HSV 2型、CMV、GBS、HBV和 EBV確定本研究方法的特異性，同時(shí)設(shè)置陰性、陽(yáng)性對(duì)照(參考質(zhì)粒及HPV B19陽(yáng)性樣本)。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

質(zhì)粒DNA分子PCR擴(kuò)增后電泳條帶單一(圖1)。Sanger測(cè)序結(jié)果對(duì)表明，質(zhì)粒DNA分子的序列與病毒株M13178的序列一致(圖2)。體系優(yōu)化的15組反應(yīng)中，引物/探針體積比為0.4～0.8 μL的4個(gè)重復(fù)CT值最小，擴(kuò)增效率最高,11組與該組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中9組有顯著差異，剩余3組無(wú)差異(圖3A)。因此，本研究中最優(yōu)的引物/探針體積比為0.4～0.8 μL。最終反應(yīng)體系為1×Probe qPCR Mix,上下游10 μmol/L引物各0.4 μL,10 μmol/L探針0.8 μL、1×ROX Reference Dye、模板2 μL、加無(wú)菌水至20 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 20 s;95 ℃ 1 s、60 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。

2.2 HBV B19通用核酸檢測(cè)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以濃度分別為107、106、105、104、103、102拷貝/μL和20拷貝/μL質(zhì)粒DNA分子構(gòu)建相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3B)。各個(gè)濃度擴(kuò)增的線性關(guān)系較好，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)效率E為0.946,R2為0.996。

2.3 敏感性和特異性

質(zhì)粒DNA濃度為10拷貝/μL的20次擴(kuò)增均能被檢出，質(zhì)粒DNA濃度為1拷貝/μL無(wú)法擴(kuò)增。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果表明，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法的檢測(cè)下限為10拷貝/μL,定量下限為20拷貝/μL。本檢測(cè)方法具有較高的敏感性。34份反復(fù)流產(chǎn)婦女外周血標(biāo)本中檢出HPV B19核酸陽(yáng)性1例。陽(yáng)性HSV 2型、CMV、GBS、HBV和EBV及陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，參考質(zhì)粒及HPV B19陽(yáng)性樣本正常擴(kuò)增(圖3C)。本檢測(cè)方法具有較高的特異性。

3 討 論

HPV B19感染可引起多種臨床表現(xiàn)，其與被感染者的年齡和免疫狀態(tài)相關(guān)。HPV B19感染率高，研究[7-9]表明孕期女性血清學(xué)陽(yáng)性率可占47%～65%。此外，中國(guó)血液制品中HPV B19污染情況較為嚴(yán)重。武漢市無(wú)償獻(xiàn)血者血清中HPV B19DNA陽(yáng)性率達(dá)20.9%[10]。相關(guān)研究[11]檢測(cè)了來(lái)自中國(guó)3個(gè)地區(qū)的235份血漿中HPV B19 DNA,結(jié)果表明,71.91%的血漿存在HPV B19污染。因此,HPV B19的檢測(cè)和篩查具有迫切性。

基于分子生物學(xué)特性,HPV B19檢測(cè)方法主要針對(duì)其抗體和核酸，前者包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒、免疫印跡法(Western blot)等對(duì)特異IgM、IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)，后者包括普通PCR法、探針?lè)ā⒊彩絉CR法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。其他方法包括血清電子鏡檢查以及針對(duì)HPV B19抗原檢測(cè)方法。目前，應(yīng)用最廣泛的為針對(duì)特異 IgM、IgG抗體檢測(cè)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。

患者在感染HPV B19 5～10 d,病毒快速?gòu)?fù)制，此時(shí)具有傳染性，血清電子鏡檢查可呈現(xiàn)陽(yáng)性;然而，此時(shí)產(chǎn)生的IgM和IgG較少，且與已快速?gòu)?fù)制的病毒顆粒形成免疫復(fù)合物，故可能無(wú)法檢出IgM和IgG,可呈假陰性[12]。在HPV B19感染10～12 d后，檢測(cè)IgM抗體可為陽(yáng)性，并能持續(xù)數(shù)月。基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法具有最長(zhǎng)的窗口期，從HPV B19的感染初期就能檢出。其中，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、高特異性和敏感性等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于包括HPV B19在內(nèi)的多種病原微生物的檢測(cè)[13-14]。然而，定量PCR檢測(cè)有假陽(yáng)性可能，即檢測(cè)的可能為裸露的病毒DNA,而非具有致病性的病毒顆粒。研究[15]表明,HPV B19也可以通過(guò)涉及熱敏補(bǔ)體因子C1q增強(qiáng)的抗體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。急性感染期伴病毒血癥高水平的HPV B19能以低效率的形式進(jìn)入其他類型細(xì)胞，并在細(xì)胞中持續(xù)存在，當(dāng)這些細(xì)胞死亡時(shí)，裸露的HPV B19 DNA被釋放進(jìn)入血液循環(huán)。

本研究通過(guò)比對(duì)5株代表型HPV B19的NS1區(qū)域序列，針對(duì)保守區(qū)序列設(shè)計(jì)了引物探針，建立了HPV B19通用型實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法，該方法敏感性較高且特異性較強(qiáng)，可應(yīng)用于HPV B19的檢測(cè)和篩查，對(duì)于臨床患者的輔助診斷、高危人群感染的監(jiān)測(cè)以及保障輸血安全具有重要意義。后續(xù)研究中將擴(kuò)大檢測(cè)量，并分析筆者所在地區(qū)育齡期反復(fù)流產(chǎn)女性與HPV B19感染的相關(guān)性;建立可檢測(cè)HPV B19完整病毒顆粒的熒光定量PCR方法，以減少假陽(yáng)性的發(fā)生，同時(shí)可鑒別出為新近感染或慢性既往感染。