非小細(xì)胞肺癌組織中活化蛋白-1、多瘤促活化因子表達(dá)對患者預(yù)后的影響

王 齊,周向東,韓 忠,劉 暢

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,海南 ?？?570000)

肺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)均較高，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%[1]。雖然近年來NSCLC的臨床診療技術(shù)已取得較大進(jìn)展，但由于該病早期癥狀缺乏特異性，絕大多數(shù)患者確診時已處于肺癌中晚期，主要采用化療為主的綜合治療模式進(jìn)行治療，5年生存率較低，因此尋找能夠早期診斷和預(yù)后評估的指標(biāo)非常重要[2]?；罨鞍?1(AP-1)是由Fos蛋白和Jun蛋白等多種蛋白組成的同源或異源二聚體，通過亮氨酸拉鏈與DNA結(jié)合[3]。研究[4-5]發(fā)現(xiàn),AP-1參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程，與癌癥等多種疾病的發(fā)生有關(guān)。多瘤促活化因子(PEA3)屬于Ets家族PEA3亞家族的重要成員，參與哺乳動物細(xì)胞、組織、器官的生長發(fā)育過程，在多種腫瘤細(xì)胞的增殖分化過程中具有重要作用[6]。本研究探討了NSCLC患者腫瘤組織中AP-1、PEA3表達(dá)水平對預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年7月—2015年2月本院收治的75例NSCLC患者肺癌組織及距癌組織>5 cm處的癌旁組織石蠟標(biāo)本。NSCLC患者納入標(biāo)準(zhǔn):① 經(jīng)組織病理學(xué)診斷確診為NSCLC者;② 一般資料完整且同時具有癌組織和癌旁組織標(biāo)本者;③自愿配合調(diào)查研究及遠(yuǎn)期隨訪，并能完成臨床記錄者。排除標(biāo)準(zhǔn):① 妊娠期婦女;② 意識不清或精神障礙無自主生活能力者;③ 合并其他惡性腫瘤者;④ 合并嚴(yán)重心、腎功能障礙者;⑤合并其他傳染性疾病者。本組患者年齡31～79歲，平均(60.25±10.58)歲;男43例，女32例;病理組織學(xué)分型為鱗癌41例，腺癌34例;腫瘤直徑≥3 cm者49例,<3 cm者26例;TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期35例,Ⅲ～Ⅳ期40例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，無轉(zhuǎn)移者26例;分化程度為中、低分化43例，高分化32例;胸膜轉(zhuǎn)移者28例，無轉(zhuǎn)移者47例。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 常用試劑及儀器

二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號P0010S,上海碧云天有限公司);兔源c-Jun抗體(貨號ab40766，美國Abcam公司)，鼠源PEA3抗體[貨號sc-166629,圣克魯斯生物技術(shù)(上海)有限公司]，甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號AM4300,美國英杰生命技術(shù)有限公司)，二抗羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)、羊抗兔IgG(貨號分別為B-2752、15135,美國英杰生命技術(shù)有限公司);日本Olympus IX73倒置熒光顯微鏡等。

1.3 方法

1.3.1 AP-1、PEA3蛋白表達(dá)檢測:采用免疫組化法(SP)檢測AP-1磷酸化活化蛋白c-Jun[7]、PEA3蛋白表達(dá)。將石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，脫蠟至水，抗原修復(fù)，添加兔抗人c-Jun(1∶200)和鼠抗人PEA3(1∶100),4 ℃孵育過夜，添加二抗羊抗兔(鼠)IgG,DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，封片。

1.3.2 結(jié)果判定:細(xì)胞核或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性。采用免疫反應(yīng)積分(IRS)法進(jìn)行評分:染色強(qiáng)度(SI)積分，無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分;陽性染色細(xì)胞百分比(PP)<1%記0分,1%～<11%記1分,11%～<51%記2分,51%～<76%記3分,76%～100%記4分。IRS=SI×PP,IRS≥3分為陽性,IRS<3分為陰性。2名資深病理醫(yī)師按雙盲法對結(jié)果進(jìn)行半定量評分。

1.3.3 隨訪:對出院后NSCLC患者進(jìn)行電話隨訪或門診隨訪，每月1次，隨訪時間5年，以5年內(nèi)患者死亡為預(yù)后不良，生存為預(yù)后良好。以患者死亡日期或2019年2月28日為隨訪截止日期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以[n(%)]描述，比較行χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存曲線分析NSCLC患者癌組織AP-1、PEA3蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，采用Cox回歸分析方法分析NSCLC患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織與癌旁組織中AP-1、PEA3蛋白表達(dá)情況比較

肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白陽性表達(dá)率均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1、圖1。

表1 NSCLC患者癌組織及癌旁組織中AP-1、PEA3蛋白表達(dá)情況比較[n(%)]

2.2 肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白表達(dá)情況與NSCLC患者臨床病理參數(shù)及一般資料的關(guān)系

NSCLC患者肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白陽性表達(dá)與患者吸煙史、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胸膜轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05),見表2。

表2 肺癌組織AP-1、PEA3蛋白表達(dá)情況與NSCLC臨床病理參數(shù)及一般資料的關(guān)系[n(%)]

2.3 肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白表達(dá)情況與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系

NSCLC患者5年總生存率為34.67%,AP-1蛋白陽性表達(dá)組、PEA3蛋白陽性表達(dá)組的5年總生存率為12.50%、15.15%,分別低于AP-1蛋白陰性表達(dá)組、PEA3蛋白陰性表達(dá)組的51.11%、50.00%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

A: AP-1蛋白表達(dá)情況與總生存率的關(guān)系圖; B: PEA3蛋白表達(dá)情況與總生存率的關(guān)系圖。

2.4 NSCLC患者不良預(yù)后危險(xiǎn)因素的Cox回歸分析

以NSCLC患者預(yù)后為因變量，患者臨床病理參數(shù)及肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白表達(dá)為自變量進(jìn)行Cox單因素回歸分析，結(jié)果顯示吸煙史、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜轉(zhuǎn)移、AP-1蛋白陽性表達(dá)、PEA3蛋白陽性表達(dá)是NSCLC患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示,TNM分期高、胸膜轉(zhuǎn)移、AP-1蛋白陽性表達(dá)、PEA3蛋白陽性表達(dá)是NSCLC患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 NSCLC患者不良預(yù)后危險(xiǎn)因素的Cox回歸分析

3 討 論

肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程極其復(fù)雜，受多基因、多分子調(diào)控[8]。相關(guān)研究[9]顯示，患者體液、細(xì)胞或組織中存在多種激素、酶、蛋白質(zhì)、癌基因產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄因子等多種物質(zhì)且與腫瘤生長顯著相關(guān)，對腫瘤診斷、臨床分期、預(yù)后評估等具有重要價(jià)值。

AP-1為一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，是由Jun蛋白和Fos蛋白組成的異源二聚體，一般可用c-Jun蛋白表達(dá)量來反映AP-1表達(dá)水平[7]。AP-1通過高度保守亮氨酸拉鏈與AP-1位點(diǎn)結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，與多種惡性腫瘤及免疫相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。LI S等[12]研究發(fā)現(xiàn),AP-1可通過增加MMP-9基因表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW620的侵襲和轉(zhuǎn)移。王熠等[13]研究表明,AP-1在NSCLC患者肺癌組織中陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，且與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、組織學(xué)類型有關(guān)。PEA3是癌基因Ets家族中PEA3亞家族重要成員之一，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展尤其是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成中發(fā)揮重要作用。朱春蘭等[14]研究發(fā)現(xiàn),PEA3在卵巢癌組織中呈顯著高表達(dá)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及是否浸潤密切相關(guān)。ETS變體4(ETV4)是最主要的PEA3因子,WANG Y等[15]研究表明,ETV4過表達(dá)與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),NSCLC患者肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白陽性表達(dá)率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白陽性表達(dá)可能與NSCLC的發(fā)生有關(guān)。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白表達(dá)情況與NSCLC患者吸煙史、分化程度、TNM分期、胸膜轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與腫瘤直徑、組織學(xué)類型無關(guān)，與王熠等[13]結(jié)果不一致，這可能與本研究選取樣本量少、選擇范圍局限有關(guān)。由此提示,AP-1、PEA3蛋白可能與NSCLC發(fā)生及病情進(jìn)展有關(guān)，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證。抑制AP-1蛋白表達(dá)可增強(qiáng)NSCLC細(xì)胞系NCl-H1975化療敏感性[16],PEA3亞家族蛋白與NSCLC晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有顯著相關(guān)性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白陽性表達(dá)的NSCLC患者5年生存率遠(yuǎn)低于AP-1、PEA3蛋白陰性表達(dá)患者，且AP-1、PEA3蛋白陽性表達(dá)均是NSCLC患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。由此提示，肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白陽性表達(dá)與NSCLC患者不良預(yù)后有關(guān)，有潛力成為NSCLC患者預(yù)后評估的重要指標(biāo)。

綜上所述，NSCLC患者肺癌組織中AP-1、PEA3蛋白陽性表達(dá)是NSCLC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，故肺癌組織中AP-1、PEA3水平可能對NSCLC預(yù)后評估有一定意義。