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    替米考星在豬尿液與體內組織間殘留分布規(guī)律研究及相關性分析

    2021-05-18 00:10:22余軍軍梁立杰藍棋浩陳秋月田通信作者
    畜禽業(yè) 2021年5期
    關鍵詞:考星藥期肺臟

    余軍軍,梁立杰,藍棋浩,陳秋月,章 敏,寧 軍,韋 田通信作者

    (1.溫氏食品集團股份有限公司,廣東 新興 527400;2.廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點實驗室,廣東 新興 527400;3.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東 廣州 510642)

    0 引言

    替米考星(Tilmicosin,TILM)是由泰樂菌素的一種水解產(chǎn)物半合成的畜禽專用抗生素,該藥首先由英國ELanco動物保健品公司在20世紀80年代開發(fā)成功,目前在多個國家批準用于畜禽生產(chǎn)中疾病的預防和治療[1]。替米考星為廣譜抗菌藥,因其體內分布廣、半衰期長、肺部高蓄積等特點,臨床主要用于治療牛、山羊、豬、雞等動物呼吸系統(tǒng)疾病,特別用于治療和控制由雞毒支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌和多殺性巴氏桿菌引起的雞豬呼吸道疾病[2]。替米考星具有肝、腎毒性,并可損害人體前庭和耳蝸神經(jīng),長期使用可引起過敏反應和導致攜帶耐藥因子的菌株擴散。因此,中國對動物源食品中替米考星的最大允許殘留限量(MRL)做了嚴格規(guī)定[3]。目前,監(jiān)控替米考星殘留主要用動物的可食用組織[4],尿液中替米考星殘留的消除未見有相關報道。本試驗旨在研究豬組織和尿液中替米考星殘留分布規(guī)律,探討替米考星殘留量在尿液與體內組織間的相關性,預測體內替米考星消除安全時尿液中替米考星殘留量,為活體快速檢測提供實驗數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 儀器設備與試劑

    液相色譜串聯(lián)質譜儀(QQQ6410B),美國Agilent科技有限公司;組織勻漿機(HM6300),北京Lab Precition科技有限公司;氮吹儀(MV5),北京萊伯泰科儀器有限公司;電子分析天平(BT125D),德國Sartorius集團;冷凍高速離心機(5804R),德國Eppendorf公司;HLB固相萃取小柱(500 mg/6 CC),美國Waters公司。

    替米考星對照品(純度98.0%,德國Dr.公司);甲醇、乙腈和甲酸(色譜純,德國默克公司);正己烷、碳酸鈉、甲酸、甲基叔丁基醚、乙酸銨和甲酸銨(分析純,廣州化學試劑廠);替米考星預混劑(含量20%,廣東溫氏大華農(nóng)科技有限公司)。

    1.1.2 試驗動物的飼養(yǎng)與管理

    選擇健康、體重相近的三元雜商品豬21頭(40.0±1.5 kg),隨機分成2組,分別為對照組1頭、實驗組20頭。實驗組在基礎飼料基礎上添加2 g/kg的替米考星預混劑,連續(xù)飼喂15 d。實驗組自停藥后第5、8、12、15天隨機選擇5頭豬,采集肌肉、肝臟、腎臟、肺臟、皮脂和尿液作為檢測樣品。

    1.2 分析方法

    1.2.1 溶液配制

    替米考星儲備液(1 mg/mL):稱量50 mg替米考星對照品,置于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,置4℃冰箱中保存。使用時配成不同濃度的標準工作液。

    4%磷酸二氫鈉溶液:準確稱取二水合磷酸二氫鈉4 g置于100 mL容量瓶中,用純水溶解定容至刻度,搖勻,即得。

    5%甲醇水溶液:移取50 mL甲醇置1 000 mL容量瓶中,用純水稀釋定容至刻度,搖勻,即得。

    20%乙腈水:移取20 mL乙腈置100 mL容量瓶中,用純水稀釋定容至刻度,搖勻,即得。

    1.2.2 樣品處理

    尿液樣品:取1 mL尿液樣品,加入1 mL 4%磷酸二氫鈉溶液,渦旋混勻30 s,8 000 r/min離心10 min,上清液過經(jīng)甲醇、水活化的HLB萃取小柱,用6 mL 5%甲醇水溶液淋洗,6 mL甲醇洗脫。洗脫液50℃水浴中氮氣吹干,殘渣用1 mL 20%乙腈水溶液復溶,過膜,待測。

    組織樣品:準確稱取4.0 g試樣置于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋30 s,超聲提取20 min,4 500 r/min離心10 min,上清液移入50 mL離心管中。用10 mL乙腈重復提取一次,合并上清液,混勻。取5 mL提取液,50℃下氮氣吹至近干,殘渣加入5 mL 20%乙腈水溶液,5 mL正己烷渦旋混勻后4 000 r/min離心10 min,移除正己烷層,下層液體按尿液樣品項下凈化。

    1.2.3 儀器條件

    色譜條件:色譜柱Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);流動相0.2%甲酸水溶液:0.2%甲酸乙腈溶液(v:v,30:70);流速為0.25 mL/min;柱溫為35℃;進樣體積為5 μL。

    質譜條件:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;掃描方式:多反應監(jiān)測(MRM);毛細管電壓4.0 kV,霧化氣壓力55 psi;脫溶劑氣流速10 L/min;脫溶劑溫度350℃;替米考星的質譜信息,如表1所示。

    表1 替米考星的質譜信息

    2 結果與分析

    2.1 組織中替米考星殘留及消除規(guī)律

    不同時間點各組織中替米考星殘留量如表2所示。結果顯示,20%替米考星預混劑按推薦劑量連續(xù)用藥15 d后,替米考星在肝臟、腎臟和肺臟中的殘留量較高,在肌肉、皮脂中的殘留量低,停藥8 d后,替米考星在各組織中殘留量低于MRL。豬只停藥后替米考星在各組織中殘留消除速度不同,其中肺臟、肝臟和腎臟中的下降速度快,而肌肉、皮脂中的下降趨勢相對平緩,但也都呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢。

    表2 豬停藥后不同時間點體內各組織和尿液中替米考星的殘留濃度量(n=5)

    2.2 休藥期計算

    按照農(nóng)業(yè)部關于替米考星最大殘留限量[3]和歐盟對休藥期計算的有關規(guī)定[5],利用WT1.4軟件按雙單側95%置信區(qū)間計算替米考星在豬組織中休藥期。恩諾沙星在各組織中的休藥期如表3所示。結果顯示,替米考星在豬肺臟中消除最慢,休藥期為16.71 d;肌肉中替米考星消除最快,休藥期為7.25 d。

    表3 替米考星在各組織中休藥期

    2.3 尿液、組織中替米考星殘留量相關性研究

    以停藥后尿液中替米考星含量為橫坐標,各組織中替米考星的含量為縱坐標進行線性回歸分析,結果如圖1所示。結果顯示,停藥后尿液中替米考星殘留量與豬體內各組織中替米考星殘留量相關系數(shù)r>0.96,且p<0.05,表明尿液中與各組織中替米考星殘留具有高度的相關性。

    2.4 尿液中替米考星殘留量區(qū)間預測

    根據(jù)相關性分析得到的回歸方程,利用R軟件中的predict()函數(shù)計算組織中替米考星殘留量為MRL時相對應尿液中替米考星殘留量值的平均值與其置信區(qū)間為0.99的預測區(qū)間[6],計算結果如表4所示。結果顯示,當體內組織中替米考星殘留量為MRL時,尿液中替米考星殘留量預測范圍8.71~398.11 μg·L-1。

    表4 尿液中替米考星殘留量預測范圍

    A—肺臟;B—腎臟;C—肝臟;D—肌肉;E—皮脂

    3 討論

    由于在《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中沒有對肺臟中替米考星的最高殘留限量進行要求[3],考慮到食品安全風險,同時參考肉中替米考星MRL暫定豬肺臟中MRL為100 μg·kg-1,最后計算得休藥期為17 d,與《獸藥典》規(guī)定14 d差異不大[7]。

    在實際生產(chǎn)中,通過對豬活體尿液樣品的檢測,根據(jù)建立的回歸方程,可以間接判斷豬體內替米考星殘留量是否低于最大殘留限量。20世紀末開始已有不少學者采用這種經(jīng)典回歸法來預測組織中藥物的殘留濃度,研究對象除動物尿液[8]、血液[9]外,已擴展到動物毛發(fā)、視網(wǎng)膜以及趾甲等[10],但在研究時均沒有考慮個體間和個體內的差異,試驗的重復性較差。作者在經(jīng)典回歸法的基礎上引入置信區(qū)間預測,考慮了個體間差異,通過計算發(fā)現(xiàn)當組織中替米考星濃度降至MRL時,尿液中替米考星殘留量區(qū)間下限為8.71 μg·L-1,較經(jīng)典回歸法計算的最低濃度11.75 μg·L-1更安全,更符合動物可食組織中殘留研究。

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