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    四川道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)的分子檢測(cè)及中藥防治研究

    2021-05-18 00:10:20李友英楊丹嬌吳建平張康林
    畜禽業(yè) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:梨形蟲(chóng)病泰勒

    李友英,藍(lán) 嵐,潘 瑤,楊丹嬌,吳建平,張康林,湯 承

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所,四川 康定 626000;3.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041)

    0 引言

    梨形蟲(chóng)病是反芻動(dòng)物中一種重要的蜱傳寄生蟲(chóng)病[1-2]。該病的臨床表現(xiàn)多樣,且多呈非特異性[3],主要以貧血、黃疸、發(fā)燒、血紅蛋白尿、消瘦等為主[4-7]。目前青藏高原地區(qū),公開(kāi)報(bào)道的會(huì)感染牦牛的梨形蟲(chóng)病病原主要有中華泰勒蟲(chóng)、呂氏泰勒蟲(chóng)、環(huán)形泰勒蟲(chóng)、東方泰勒蟲(chóng)等[8-10]。在已報(bào)道的牦牛泰勒蟲(chóng)病原中,環(huán)形泰勒蟲(chóng)對(duì)家畜的危害最為嚴(yán)重,其次是東方泰勒蟲(chóng)、中華泰勒蟲(chóng)等,呂氏泰勒蟲(chóng)其致病性較強(qiáng),嚴(yán)重者可導(dǎo)致患畜死亡,被稱(chēng)為“惡性泰勒蟲(chóng)”[11-13]。道孚縣位于四川西北部,甘孜東北部,整體養(yǎng)殖方式粗放,相關(guān)人員防治意識(shí)淡薄,牦牛梨形蟲(chóng)感染情況嚴(yán)重,給農(nóng)牧民造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。藍(lán)嵐等[9]于2018年6-11月,對(duì)甘孜18個(gè)縣(市)牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況進(jìn)行調(diào)查,采集牦牛全血1 381份,梨形蟲(chóng)平均陽(yáng)性率為31.72%,其中道孚縣為28.99%。目前未有對(duì)該縣牦牛梨形蟲(chóng)流形特點(diǎn)的確切報(bào)道,因此對(duì)道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)流行特點(diǎn)的調(diào)查及防治措施的研究很有必要,對(duì)梨形蟲(chóng)病的早期防控具有重要意義。貝尼爾是目前常用的抗梨形蟲(chóng)藥物[14-15],療效確切,但副作用較大,且易產(chǎn)生耐藥性。中藥有營(yíng)養(yǎng)和藥物的雙重作用,且具有低殘留、低耐藥性的特點(diǎn),是首選的綠色獸藥產(chǎn)品[16-18]。本試驗(yàn)研究了貝尼爾結(jié)合中藥方劑、青蒿、百部對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)病的防治效果,為牦牛梨形蟲(chóng)病的防治提供新的途經(jīng)和有效方法。

    1 材料與方法

    1.1 牦牛血樣采集

    2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月,自道孚縣每月定點(diǎn)采集牦牛全血173份,標(biāo)記時(shí)間、年齡、體重,裝于一次性真空抗凝管置冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。所有的血樣均放在-20℃冰箱保存。

    1.2 蜱蟲(chóng)采集

    于2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月采集牦牛血樣時(shí),采集血樣的牦牛體表如有蜱,采集后裝入收集管,放入75%酒精溶液中,并置于4℃冰箱保存待檢。

    1.3 試驗(yàn)藥物

    貝尼爾(購(gòu)于四川恒通動(dòng)物制藥有限公司,批號(hào) 20180901),中藥購(gòu)自中藥房。

    1.4 牦牛梨形蟲(chóng)的分子檢測(cè)

    1.4.1 全血總 DNA 提取

    采用酚-氯仿法提取牦牛全血總 DNA。

    1.4.2 18S rRNA 引物的設(shè)計(jì)

    采用以18S RNA為靶基因的梨形蟲(chóng)巢式 PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)。引物信息為外上游引物:GATAACCGTGCTAATTGTAGG,外下游引物:ATCGTCTTCGATCCCCTAACT,擴(kuò)增片段大小為 843 bp;內(nèi)上游引物:AATTGTAGGGCTAATACATGTTCG,內(nèi)下游引物:GAAAACATCCTTGGCAAATGCTTTCGC,擴(kuò)增片段大小為 760 bp,靶基因 18SrRNA。

    1.4.3 蟲(chóng)種鑒定

    隨機(jī)挑選部份牦牛梨形蟲(chóng)核酸陽(yáng)性樣本共計(jì)38份的PCR產(chǎn)物送生工(上海)測(cè)序。通過(guò)NCBI上的BLAST對(duì)序列進(jìn)行比對(duì);采用MEGA 7軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值為1000)基于梨形蟲(chóng)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),運(yùn)用Lasergene 7.0軟件對(duì)所測(cè)得的序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析,根據(jù)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)及同源性分析結(jié)果鑒定梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種。

    1.5 媒介蜱的形態(tài)學(xué)鑒定

    采用體式顯微鏡對(duì)蜱初步進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

    1.6 中藥防治研究

    選擇有梨形蟲(chóng)感染,年齡、體型相似的牦牛35頭,隨機(jī)分為5組,每組4~10頭。藥物組1:貝尼爾結(jié)合中藥方劑,貝尼爾,3 mg/(kg體重),臨用前配成5%~7%溶液,肌注;中藥方劑,秦艽散加減方:秦艽30 g、當(dāng)歸25 g、赤芍 25 g、瞿麥20 g、車(chē)前子20 g、焦梔子20 g、大黃20 g、茯苓 20 g、淡竹葉15 g、燈心草15 g、川楝子18 g、甘草20 g,500 mL/頭,灌服,1次/d,連續(xù)給藥3 d。同時(shí)進(jìn)行體外滅蜱。藥物組2:百部,25~30 g/頭,粉為細(xì)末,拌料喂。同時(shí)進(jìn)行體外滅蜱。藥物組3:青蒿藥液,60 g/頭,灌服。同時(shí)進(jìn)行體外滅蜱。陽(yáng)性藥物組:貝尼爾,肌注,3~5 mg/kg,臨用前配成 5%~7% 溶液。同時(shí)進(jìn)行體外滅蜱。空白組:進(jìn)行體外滅蜱。用藥前及用藥后50 d,稱(chēng)重并采集牦牛血液進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè),對(duì)梨形蟲(chóng)病原進(jìn)行檢測(cè),分析中藥防治效果。

    1.7 數(shù)據(jù)分析

    2 結(jié)果

    2.1 道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)整體感染情況

    采集血樣173份,經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增其18S rRNA部分基因序列,其中有59份樣本擴(kuò)增出目的條帶,梨形蟲(chóng)平均陽(yáng)性率為34.10%。部分樣本PCR電泳結(jié)果,如圖1所示。

    M—D2000 DNA Marker;2—陽(yáng)性對(duì)照;1—陰性對(duì)照(去離子水);3~13—牦牛全血樣本

    2.2 不同月份牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

    定點(diǎn)對(duì)道孚縣進(jìn)行為期 6 個(gè)月的跟蹤調(diào)查,發(fā)現(xiàn)各月份均有梨形蟲(chóng)感染,4月、5月、6月、7月、9月、10月平均陽(yáng)性率分別為:28.00%(25/7)、66.67%(15/10)、51.02%(49/25)、34.62%(26/9)、14.63%(41/6)、11.76%(17/2)。5月、6 月牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率均顯著高其高于其他月份(P<0.05),之后成下降趨勢(shì),見(jiàn)圖2,圖2中所標(biāo)字母相異(a~c)表示差異顯著(P<0.05)。

    圖2 牦牛感染梨形蟲(chóng)的季節(jié)動(dòng)態(tài)

    2.3 不同年齡組牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

    各個(gè)年齡段梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率也均不相同。犢牦牛組(0~2 歲)梨形蟲(chóng)平均陽(yáng)性率為 34.48%(29/10),青年牦牛組(2~5 歲)為 45.78%(83/38),成年牦牛組(5 歲以上)為 18.03%(61/11)。由圖3可知,青年組牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率最高,顯著高于犢牦牛組和成年組(P<0.05)。成年組牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率最低,顯著低于犢牦牛組和青年組(P<0.05)。表明青年組牦牛(2~5歲)最易感染牦牛梨形蟲(chóng)病。

    圖3 不同年齡組牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

    2.4 不同體重牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

    對(duì)感染梨形蟲(chóng)牦牛的體重進(jìn)行分析。小于 100 kg、100~200 kg及大于 200 kg的牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率分別為:42.11%(95/40)、28.57(63/18)、6.67%(15/1)。小于 100 kg、100~200 kg 的牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率均顯著高于 200 kg 以上的牦牛(P<0.05),感染梨形蟲(chóng)的牦牛體重明顯下降,如圖4所示。

    圖4 不同體重牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況

    2.5 牦牛梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種檢測(cè)結(jié)果

    從牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性樣本中挑選 38 份樣本PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定蟲(chóng)種,鑒定蟲(chóng)種1個(gè),均為中華泰勒蟲(chóng)?;诶嫘蜗x(chóng)18SrRNA基因序列建立進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行牦牛梨形蟲(chóng)蟲(chóng)種鑒定。由圖5可見(jiàn),中華泰勒蟲(chóng)大枝包括道孚檢測(cè)出的中華泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株 38 株及Genback 中已發(fā)表的甘肅、河南分離株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1),其又分為兩小枝,其中一支為檢測(cè)出的中華泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株 33 株(Yak-32、6-7)與已發(fā)表的甘肅、河南分離株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1),另一支為檢測(cè)出的其他中華泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株5株(5-2、6-13、6-4、5-1、5-3)。

    將檢測(cè)到的蟲(chóng)株在 MegAlign 軟件上進(jìn)行同源性比對(duì)分析,測(cè)出的中華泰勒蟲(chóng)之間的同源性為 94.20%~100.00%,與已發(fā)表的蟲(chóng)株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)之間的同源性為 94.50%~100.00%。

    2.6 蜱蟲(chóng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

    共采集到蜱蟲(chóng)199 只,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定,均為微小扇頭蜱,如圖6所示。

    Yak-32—中華泰勒蟲(chóng)32個(gè)樣本序列;▲—其他樣本序列;■—已發(fā)表的中華泰勒蟲(chóng)蟲(chóng)株

    A—微小扇頭蜱背面;B—微小扇頭蜱腹面

    2.7 中藥防治效果觀(guān)察

    2.7.1 中藥防治對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)感染情況的影響

    對(duì)用藥前后牦牛梨形蟲(chóng)感染情況進(jìn)行檢測(cè)。由表1可知,空白組牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率為100%,各藥物組梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率均呈下降趨勢(shì);藥物組 1、2牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率與陽(yáng)性藥物組相比有所降低。

    2.7.2 中藥防治對(duì)牦牛體重的影響

    對(duì)上述有梨形蟲(chóng)感染的35頭牦牛進(jìn)行防治,由表2可知,各藥物組牦牛的體重均有增加,陽(yáng)性藥物組、藥物組1、2、3 牦牛AG、ADG均比空白組高。藥物組1、2牦牛AG、ADG顯著高于陽(yáng)性藥物組和空白組(P<0.05)。藥物組3牦牛AG高于陽(yáng)性藥物組和空白組,但差異不顯著;ADG顯著高于空白組(P<0.05),較高于陽(yáng)性藥物組,差異不顯著。

    表1 中藥防治對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)感染情況的影響

    表2 中藥防治對(duì)牦牛體重的影響

    2.7.3 中藥防治對(duì)牦牛 RBC、HGB 的影響

    用藥前后對(duì)試驗(yàn)組35頭牦牛血液進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè),用藥前10頭牦牛 RBC、HGB低于參考值。由表3可知,各用藥組牦牛RBC、HGB均有升高,陽(yáng)性藥物組和藥物組1、2、3牦牛RBC、HGB均達(dá)到參考值;空白組牦牛RBC未達(dá)到參考值,HGB達(dá)到參考值。

    表3 中藥防治對(duì)牦牛RBC、HGB的影響

    3 討論

    近年來(lái),陸續(xù)有關(guān)于青藏高原地區(qū)牦牛感染梨形蟲(chóng)的報(bào)道,但目前為止,對(duì)牦牛感染梨形蟲(chóng)規(guī)律的確切報(bào)道較少。本試驗(yàn)正是基于這一現(xiàn)狀,2019年4月、5月、6月、7月、9月、10月定點(diǎn)對(duì)道孚縣牦牛進(jìn)行為期6個(gè)月的跟蹤調(diào)查,首次分析不同月份、年齡段及體重牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況,為道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)病的防治提供依據(jù)。

    18S rRNA具有保守性和高變性,還可對(duì)感染蟲(chóng)種進(jìn)行鑒定,在梨形蟲(chóng)檢測(cè)中廣泛應(yīng)用且效果良好[19,21]。本實(shí)驗(yàn)采用以18S rRNA 為靶基因的梨形蟲(chóng)巢式PCR方法,并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及同源性分析,對(duì)四川省道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)病原及蟲(chóng)種進(jìn)行檢測(cè)。

    本次調(diào)查顯示道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率為34.10%,道孚縣平均海拔約3 245 m,為半農(nóng)半牧業(yè)縣,與純牧業(yè)縣相比,灌木叢較多,良好的自然環(huán)境及較高的生物多樣性,為蜱蟲(chóng)提供了適宜的環(huán)境條件,增加了蜱侵襲牦牛,傳播梨形蟲(chóng)病的概率。5-6月份為感染高峰期,梨形蟲(chóng)是一種由蜱傳播的血液原蟲(chóng)病[20],所以其感染率與蜱蟲(chóng)的活動(dòng)規(guī)律密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)將采集到的蜱蟲(chóng)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,均為微小扇頭蜱。微小扇頭蜱在我國(guó)分布廣泛,主寄生于大家畜體表,如黃牛、牦牛、綿羊等[21],主要生活在農(nóng)區(qū),氣候溫和,雨量充沛的季節(jié)蜱蟲(chóng)活躍度開(kāi)始增高。呈季節(jié)消長(zhǎng)性,一二月寄生數(shù)量不多,3月開(kāi)始數(shù)量逐漸增多,直到6月達(dá)到最高峰,以后數(shù)量又逐漸減少,但終年都存在[22]。道孚縣春夏不分明,冬長(zhǎng)夏短,冬寒干燥,五六月份氣溫開(kāi)始升高,降水量、植被增多,蜱蟲(chóng)開(kāi)始活躍。本實(shí)驗(yàn)牦牛感染梨形蟲(chóng)的季節(jié)動(dòng)態(tài)與微小扇頭蜱活動(dòng)季節(jié)趨于一致。本實(shí)驗(yàn)梨形蟲(chóng)青年組牦牛(2~5歲) 最易感染中華泰勒蟲(chóng)病,與劉道鑫等[23]不同年齡階段牦牛泰勒蟲(chóng)病的調(diào)查結(jié)果:2~3歲牦牛最易感染泰勒蟲(chóng)病,趨于一致,應(yīng)注意該年齡段牦牛梨形蟲(chóng)病的防控。本次檢測(cè)顯示優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為中華泰勒蟲(chóng),與藍(lán)嵐等[9]對(duì)四川甘孜進(jìn)行的牦牛梨形蟲(chóng)感染情況調(diào)查結(jié)果:優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為中華泰勒蟲(chóng)與呂氏泰勒蟲(chóng);以及鐘維等[10]對(duì)四川省阿壩州5個(gè)縣進(jìn)行的牦牛梨形蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果:感染蟲(chóng)種均為中華泰勒蟲(chóng),趨于一致。本次檢測(cè)牦牛均未發(fā)現(xiàn)有明顯的臨床癥狀,說(shuō)明中華泰勒蟲(chóng)為溫和型泰勒蟲(chóng)[24],裂殖體并不起主要作用。但是比較不同體重牦牛梨形蟲(chóng)的感染情況,結(jié)果顯示,感染梨形蟲(chóng)的牦牛體重明顯下降,除此之外對(duì)有梨形蟲(chóng)感染的 35 頭牦牛進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè),10 頭存在貧血現(xiàn)象。梨形病感染會(huì)導(dǎo)致牦牛生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、產(chǎn)肉量下降等[25-26],大大降低了農(nóng)牧民的經(jīng)濟(jì)收入,所以做好梨形蟲(chóng)病的防治工作對(duì)農(nóng)牧民增收有重要的意義。

    目前防治梨形蟲(chóng)病多采用貝尼爾、鹽酸吖啶磺等,但其副作用大,病牛體質(zhì)恢復(fù)較慢且均需肌肉或靜脈注射,一般需要專(zhuān)業(yè)獸醫(yī)人員進(jìn)行操作,目前甘孜牧區(qū)保定設(shè)施及基層獸醫(yī)人員缺乏,臨床普及不易。中藥副作用小,功效獨(dú)特,諸多藥物具有增強(qiáng)免疫力、抗菌驅(qū)蟲(chóng)、保健防病的作用[27-28],對(duì)牦牛感染梨形蟲(chóng)后的體質(zhì)有改善作用。且中藥價(jià)格便宜,多采用拌料或灌服,農(nóng)牧民自己即可操作,較易普及。栗明來(lái)等[29]用三氮瞇結(jié)合中藥方劑同時(shí)應(yīng)用,取得確實(shí)的療效。王守文等[30]對(duì)中西藥治療羊梨形蟲(chóng)病效果進(jìn)行對(duì)比,三氮脒治愈率為 73.5%,采用中西藥物結(jié)合治療,療效確實(shí)顯著,治愈率達(dá)97.6%。國(guó)內(nèi)報(bào)道運(yùn)用中西藥結(jié)合治療梨形蟲(chóng)病的越來(lái)越多。秦艽散具有祛瘀止血,清熱利尿的功能,主治膀胱積熱,努傷尿血[31],本實(shí)驗(yàn)減去秦艽散中黃芩、紅花、蒲黃、大黃、白芍、天花粉,加上赤芍、連翹、茯苓、燈心草、川楝子等清熱涼血、清熱解毒、利水利尿、驅(qū)蟲(chóng)藥物,組成具有清熱利尿、祛瘀止血、補(bǔ)血和中、補(bǔ)氣、驅(qū)蟲(chóng)、健脾生血、增強(qiáng)體質(zhì)功效的中藥方劑。將該方劑結(jié)合貝尼爾對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)進(jìn)行防治,用藥后牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率下降,牦牛 AG、ADG 顯著高于陽(yáng)性藥物組和空白組,且改善了牦牛的貧血現(xiàn)象,說(shuō)明中西藥結(jié)合防治牦牛梨形蟲(chóng)病可大大提高防治效果。百部具有殺蟲(chóng)的功效[31],青蒿具有殺原蟲(chóng)、清熱解毒的功效[31]。鄭海等[32]研究了中藥百部對(duì)羊泰勒焦蟲(chóng)病的防治效,發(fā)現(xiàn)其治療效果優(yōu)于貝尼爾,而預(yù)防效果相同。丁景昌等[33]采用用青篙對(duì)牛雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)病進(jìn)行治療,結(jié)果顯示,其可直接殺滅雙芽巴貝斯焦蟲(chóng),屬于高效抗雙芽巴貝斯焦蟲(chóng)的藥物。本實(shí)驗(yàn)分別采用百部及青蒿對(duì)牦牛梨形蟲(chóng)病進(jìn)行防治,各藥物組梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率均呈下降趨勢(shì)。百部組牦牛梨形蟲(chóng)陽(yáng)性率與陽(yáng)性藥物組相比有所降低,牦牛 AG、ADG 顯著高于陽(yáng)性藥物組和空白組(P<0.05)。青蒿組牦牛 AG 高于陽(yáng)性藥物組和空白組,但差異不顯著;ADG 顯著高于空白組(P<0.05),較高于陽(yáng)性藥物組,差異不顯著。兩組牦牛貧血現(xiàn)象均有改善。說(shuō)明百部與青蒿均有防治牦牛梨形蟲(chóng)病的效果,百部可作為高效防治牦牛梨形蟲(chóng)病的藥物。

    4 結(jié)論

    本試驗(yàn)首次對(duì)道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)不同月份、年齡段及體重的感染情況進(jìn)行調(diào)查,道孚縣牦牛梨形蟲(chóng)感染率較高,不同月份、年齡段、體重間存在差異,優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種為中華泰勒蟲(chóng),主要傳播媒介為微小扇頭蜱。中西藥結(jié)合防治牦牛梨形蟲(chóng)病效果顯著,百部與青蒿均有防治牦牛梨形蟲(chóng)病的效果。百部及青蒿防治梨形蟲(chóng)病,使用方便,農(nóng)牧民自己即可操作,可減輕大群投藥時(shí)的勞動(dòng)強(qiáng)度,易推廣。由于試驗(yàn)樣本數(shù)太少,因此對(duì)于百部及青篙防治梨形蟲(chóng)病的有效成分及其藥理作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

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