熊 巍,張海燕,靳冬梅,韶濟(jì)民,陶曉秋,龐 夙
(四川省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站,四川 成都 640001)
新煙堿類殺蟲劑是一種硝基亞甲基雜環(huán)化合物,主要用于防治同翅目,鞘翅目、雙翅目和鱗翅目昆蟲,通過影響昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸、阻止神經(jīng)細(xì)胞間的傳遞而起效。在煙草中廣泛應(yīng)用的新煙堿殺蟲劑有吡蟲啉和啶蟲脒等。2015 年,中國煙葉公司將吡蟲啉和啶蟲脒列為推薦農(nóng)藥。國際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)2013 年制定的農(nóng)用化學(xué)品指導(dǎo)性殘留限量(GRLs)將吡蟲啉和啶蟲脒納入限量類別,煙葉中吡蟲啉和啶蟲脒的限量值分別為5 和2.5 mg/kg[1]。
目前,已報(bào)道的新煙堿殺蟲劑檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[2]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[3]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法(CE-MS)[4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[5-6],涉及的樣品基質(zhì)主要有蜂蜜[7-11]、飲用水[12]、谷物[13]、蔬果[14]、茶葉[15]以及血液、尿液[16]、奶[17]和組織[18]等生物基質(zhì)樣品。煙葉中的新煙堿殺蟲劑殘留量也受到廣泛關(guān)注,2011 年的煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(YC/T405.1—2011)將啶蟲脒和吡蟲啉納入測定范圍[19]。前期也有煙草科技工作者較為關(guān)注煙葉中新煙堿殺蟲劑殘留量的檢測方法研究。何慶等[20]建立了20%甲醇水溶液超聲萃取、石墨化碳柱固相萃取、LC-MS/MS 同時測定煙葉中5 種新煙堿類殺蟲劑殘留的方法,檢出限范圍為0.005~0.009 μg/mL。王駿等[21]通過乙酸-乙腈提取、基質(zhì)固相萃取凈化,再采用UPLC-MS/MS 法測定了31 個烤煙煙葉樣品中的啶蟲脒、吡蟲啉殘留量,發(fā)現(xiàn)煙葉樣品中啶蟲脒檢出率為1/5、檢出量為0.015 5~0.243 1 μg/g,吡蟲啉檢出率約1/4、檢出量為0.022 4~0.179 5 μg/g。
雖然煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)已將啶蟲脒和吡蟲啉納入檢測范疇,但標(biāo)準(zhǔn)方法需要同時測定73 種農(nóng)藥,為照顧多種農(nóng)藥的萃取效率與回收率,選擇乙腈作為萃取劑,而前期的報(bào)道表明正己烷或異丙醇溶劑對新煙堿殺蟲劑的萃取效果較好[8]。因此,筆者針對5 種新煙堿殺蟲劑,對QuEChERS 提取法進(jìn)行了改進(jìn),建立了同位素內(nèi)標(biāo)定量的UPLC-MS/MS 同時快速分析煙草中5種新煙堿殺蟲劑殘留量的方法。
吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品來源于Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers(化學(xué)純度≥98.5%,Augsburg,德國),內(nèi)標(biāo)噻蟲胺-d3來源于加拿大TRC(化學(xué)純度98%,同位素純度98%,多倫多,加拿大);甲酸 (HPLC 級,德國Sigma 公司),異丙醇、乙腈、正己烷(色譜純,美國Thermo-Fisher公司);安捷倫農(nóng)殘?jiān)噭┌ò?.5 g 檸檬酸二氫鈉、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉和4 g 無水硫酸鎂)和N-丙基乙二胺(PSA)購自安捷倫公司(美國),水為超純水。63 個煙葉樣品選自全國煙葉農(nóng)殘普查分析樣品(國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供),無農(nóng)藥殘留煙葉樣品由CORESTA 提供。
主要儀器設(shè)備有Waters ACQUITYTM 超高效液相色譜,Xevo TQ 質(zhì)譜儀(美國Waters 公司),渦旋振蕩器(VtexMixer 230VeU,美國Labnet 公司),離心機(jī)(Sigma 3K15,德國Sigma 公司)。
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取新煙堿殺蟲劑的標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.000 1 g)各10 mg,用乙腈溶解定容至10 mL,制得1.0 mg/mL 的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液,-20℃避光保存;精密量取新煙堿殺蟲劑儲備液各100 μL 于10 mL 容量瓶,用乙腈定容,配制成10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,-20℃避光保存。準(zhǔn)確配置噻蟲胺-d3(0.99 mg/mL)氘代內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液,儲存于棕色玻璃瓶中,-20℃保存。取一定量的各內(nèi)標(biāo)儲備液進(jìn)行混合,用乙腈定容,配制成10 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液,-20℃避光保存。
1.2.2 樣品的提取和凈化 樣品前處理方法參照已報(bào)道文獻(xiàn)[19],具體步驟:煙葉樣品粉碎后,稱取2 g 樣品于50 mL 旋蓋離心管中,加入10 mL 超純水,振蕩到樣品被水充分浸潤,靜置10 min。加入10 mL 異丙醇(常規(guī)的QuEChERS 法一般選取乙腈作為提取溶劑,考慮到異丙醇對于新煙堿殺蟲劑的溶解性更好,在水浸潤后更有利于反萃取出新煙堿殺蟲劑[8],且提取后的冷凍過程異丙醇不容易發(fā)熱結(jié)塊,前期試驗(yàn)結(jié)果也顯示采用異丙醇為提取溶劑對5 種新煙堿殺蟲劑有較好的回收率),并加入200 μL 內(nèi)標(biāo)(10 μg/mL),渦漩振蕩2 min(2 000 r/min),-18℃條件下冷凍10 min;向離心管中加入0.5 g 檸檬酸二氫鈉,1 g 氯化鈉,1 g檸檬酸鈉和4 g 無水硫酸鎂,漩渦振蕩2 min(2 000 r/min),離心5 min(6 000 r/min);移取1.0 mL 上清液于1.5 mL 旋蓋離心管,加入25 mg PSA 吸附劑和150 mg 無水硫酸鎂,漩渦振蕩2 min(2 000 r/min),離心5 min(6 000 r/min)。上清液過有機(jī)相濾膜(孔徑為0.22 μm),移取200 μL 濾液于1.8 mL 旋蓋色譜瓶,加入800 μL 用超純水,混勻后用于LC-MS/MS 分析測定。
1.2.3 LC-MS/MS 條件優(yōu)化 (1)色譜條件:采用Atlantis UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 m) 反相色譜柱;柱溫35℃;樣品室溫度4℃;進(jìn)樣體積2 μL??疾炝朔聪嗌V常用流動相乙腈/水體系、甲醇/ 水體系以及加入不同濃度甲酸的2 種體系對5 種目標(biāo)化合物色譜保留行為的影響。(2)質(zhì)譜條件:為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的痕量分析,選取MRM 定量模式。首先,在流動注射狀態(tài)下,分別將0.5 μg/mL 的單標(biāo)溶液在正離子和負(fù)離子的模式下進(jìn)行全掃描,以選擇合適的分子離子峰和電離方式,然后對毛細(xì)管電壓、霧化氣溫度、錐孔電壓、碰撞能等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。
1.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用1.2.2 中方法處理空白煙葉樣品,提取空白煙葉基質(zhì),配制質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的空白煙葉基質(zhì)樣品,采取優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行檢測,以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值y 對相應(yīng)濃度x (μg/mL)進(jìn)行線性回歸分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3 倍信噪比確定方法的檢出限(S/N>3)。
1.2.5 檢測方法驗(yàn)證 分別在空白煙葉樣品中加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使得新煙堿殺蟲劑的添加量分別為50、250、1 000 μg/kg,按試驗(yàn)優(yōu)化的條件進(jìn)行處理和測定,開展加標(biāo)回收試驗(yàn),以驗(yàn)證方法的重復(fù)性和精密度。
1.2.6 分析檢測方法的應(yīng)用 采用優(yōu)化后的樣品處理和檢測分析方法測定了國內(nèi)外63 個煙葉樣品中的5種新煙堿殺蟲劑殘留量。
2.1.1 色譜條件 以乙腈/水和甲醇/水為流動相時,新煙堿殺蟲劑的峰寬稍寬且有一定的拖尾現(xiàn)象,這可能是由于新煙堿殺蟲劑的叔胺基團(tuán)與色譜柱固定相上殘余硅醇基作用的結(jié)果。由于新煙堿殺蟲劑擁有含氮基團(tuán),且具有弱堿性,在流動相中加入適量的甲酸會促進(jìn)其電離,并為陽離子提供必要的質(zhì)子來源,從而提高離子化效率。同時,流動相中甲酸的加入也有助于色譜柱固定相中硅醇基的質(zhì)子化,較好地消除固定相與目標(biāo)分析物的相互作用,從而減少拖尾現(xiàn)象,改善色譜峰形。研究結(jié)果顯示,添加0.1%的甲酸時,色譜峰形較好,且不會產(chǎn)生離子抑制現(xiàn)象。與乙腈相比,甲醇作為流動相時,響應(yīng)值稍高。因此,確定流動相A 為0.1%甲酸水溶液,流動相B 為0.1%甲酸甲醇溶液;流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?~2 min,90%~50% A;2~2.4 min,50%~30% A;2.4~4.0 min,30%~20% A;4.0~6.0 min,20%~90% A,6.0~ 8.0 min,90%~90% A。
2.1.2 質(zhì)譜條件 研究結(jié)果顯示,正離子模式下,[M+H]+為最強(qiáng)峰,選擇其作為母離子進(jìn)行下一步的碰撞電離;選擇豐度較高、干擾較小的2 對子離子作為定性離子,豐度最高的作為定量離子,另一個為定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如下:電離方式為電噴霧正離子模式;毛細(xì)管電壓為2.6 kV;霧化氣溫度350 ℃;霧化氣流量為1 000 L/h;錐孔氣流量為50 L/h;碰撞氣流量為0.15 mL/min;碰撞氣為氬氣,其余氣體為氮?dú)?;駐留時間為30 ms,采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)進(jìn)行采集。5 種新煙堿殺蟲劑的質(zhì)譜參數(shù)和多反應(yīng)監(jiān)測色譜結(jié)果分別見表1 和圖1。
表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下5 種農(nóng)藥及其內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)和保留時間
圖1 5 種新煙堿殺蟲劑以及內(nèi)標(biāo)的加標(biāo)樣品多反應(yīng)監(jiān)測色譜結(jié)果
由表2 可知,采用改進(jìn)的QuEChERS 法提取,色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化后,5 種新煙堿殺蟲劑的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2≥0.99,可以滿足定量分析的需要;以3 倍信噪比確定方法的檢出限(S/N>3),吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲胺5 種新煙堿殺蟲劑的檢出限分別為1.12、0.76、1.56、1.94、1.70 μg/kg。
表2 5 種新煙堿殺蟲劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限
如表3 所示,加標(biāo)回收試驗(yàn)中5 種新煙堿殺蟲劑的平均回收率為69.3%~115.9%,RSD 在1.9%~11.9%之間,可以滿足煙葉樣品中殘留農(nóng)藥的分析要求。
由表4 可知,部分樣品的吡蟲啉和啶蟲脒有檢出,其平均含量分別為0.146 和0.120 μg/g,檢出率分別為11.1%和6.3%,其余農(nóng)藥未檢出。所有樣品的農(nóng)藥殘留量均未超出CORESTA 于2013 年發(fā)布的指導(dǎo)性殘留限量[1]。與王駿等[21]報(bào)道的結(jié)果相比,煙葉中吡蟲啉和啶蟲脒檢出率有所下降,檢出量較為一致。
表3 煙草中5 種新煙堿殺蟲劑的加標(biāo)回收率和精密度(n=5)
表4 檢出樣品中新煙堿殺蟲劑的殘留量 (μg/g)
采用UPLC-MS/MS 對煙草中5 種新煙堿殺蟲劑殘留量進(jìn)行同時快速分析,以改良的基質(zhì)分散固相萃取法(QuEChERS)提取凈化樣品,氘代內(nèi)標(biāo)定量,吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲胺5 種新煙堿殺蟲劑的檢出限分別為1.12、0.76、1.56、1.94、1.70 μg/kg,總分析時間為8 min。與報(bào)道的方法相比[20],此方法前處理更為簡單,檢測限更低。利用建立的方法測定了國內(nèi)外63 個煙葉樣品,其中部分樣品中吡蟲啉和啶蟲脒有檢出,檢出率分別為11.1%和6.3%,平均含量分別為0.146 和0.120 μg/g。這表明該方法可用于煙葉中5 種新煙堿殺蟲劑的快速測定。