UPLC-MS/MS 同時測定煙草中5 種新煙堿殺蟲劑殘留

熊 巍，張海燕，靳冬梅，韶濟民，陶曉秋，龐 夙

（四川省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，四川 成都 640001）

新煙堿類殺蟲劑是一種硝基亞甲基雜環(huán)化合物，主要用于防治同翅目，鞘翅目、雙翅目和鱗翅目昆蟲，通過影響昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸、阻止神經(jīng)細(xì)胞間的傳遞而起效。在煙草中廣泛應(yīng)用的新煙堿殺蟲劑有吡蟲啉和啶蟲脒等。2015 年，中國煙葉公司將吡蟲啉和啶蟲脒列為推薦農(nóng)藥。國際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）2013 年制定的農(nóng)用化學(xué)品指導(dǎo)性殘留限量（GRLs）將吡蟲啉和啶蟲脒納入限量類別，煙葉中吡蟲啉和啶蟲脒的限量值分別為5 和2.5 mg/kg[1]。

目前，已報道的新煙堿殺蟲劑檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[2]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[3]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法（CE-MS）[4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[5-6]，涉及的樣品基質(zhì)主要有蜂蜜[7-11]、飲用水[12]、谷物[13]、蔬果[14]、茶葉[15]以及血液、尿液[16]、奶[17]和組織[18]等生物基質(zhì)樣品。煙葉中的新煙堿殺蟲劑殘留量也受到廣泛關(guān)注，2011 年的煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YC/T405.1—2011）將啶蟲脒和吡蟲啉納入測定范圍[19]。前期也有煙草科技工作者較為關(guān)注煙葉中新煙堿殺蟲劑殘留量的檢測方法研究。何慶等[20]建立了20%甲醇水溶液超聲萃取、石墨化碳柱固相萃取、LC-MS/MS 同時測定煙葉中5 種新煙堿類殺蟲劑殘留的方法，檢出限范圍為0.005～0.009 μg/mL。王駿等[21]通過乙酸-乙腈提取、基質(zhì)固相萃取凈化，再采用UPLC-MS/MS 法測定了31 個烤煙煙葉樣品中的啶蟲脒、吡蟲啉殘留量，發(fā)現(xiàn)煙葉樣品中啶蟲脒檢出率為1/5、檢出量為0.015 5～0.243 1 μg/g，吡蟲啉檢出率約1/4、檢出量為0.022 4～0.179 5 μg/g。

雖然煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)已將啶蟲脒和吡蟲啉納入檢測范疇，但標(biāo)準(zhǔn)方法需要同時測定73 種農(nóng)藥，為照顧多種農(nóng)藥的萃取效率與回收率，選擇乙腈作為萃取劑，而前期的報道表明正己烷或異丙醇溶劑對新煙堿殺蟲劑的萃取效果較好[8]。因此，筆者針對5 種新煙堿殺蟲劑，對QuEChERS 提取法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了同位素內(nèi)標(biāo)定量的UPLC-MS/MS 同時快速分析煙草中5種新煙堿殺蟲劑殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品來源于Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers（化學(xué)純度≥98.5%，Augsburg，德國），內(nèi)標(biāo)噻蟲胺-d3來源于加拿大TRC（化學(xué)純度98%，同位素純度98%，多倫多，加拿大）；甲酸 （HPLC 級，德國Sigma 公司），異丙醇、乙腈、正己烷（色譜純，美國Thermo-Fisher公司）；安捷倫農(nóng)殘試劑包（包含0.5 g 檸檬酸二氫鈉、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉和4 g 無水硫酸鎂）和N-丙基乙二胺（PSA）購自安捷倫公司（美國），水為超純水。63 個煙葉樣品選自全國煙葉農(nóng)殘普查分析樣品（國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心提供），無農(nóng)藥殘留煙葉樣品由CORESTA 提供。

主要儀器設(shè)備有Waters ACQUITYTM 超高效液相色譜，Xevo TQ 質(zhì)譜儀（美國Waters 公司），渦旋振蕩器（VtexMixer 230VeU，美國Labnet 公司），離心機（Sigma 3K15，德國Sigma 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取新煙堿殺蟲劑的標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.000 1 g）各10 mg，用乙腈溶解定容至10 mL，制得1.0 mg/mL 的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃避光保存；精密量取新煙堿殺蟲劑儲備液各100 μL 于10 mL 容量瓶，用乙腈定容，配制成10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，-20℃避光保存。準(zhǔn)確配置噻蟲胺-d3（0.99 mg/mL）氘代內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的各內(nèi)標(biāo)儲備液進(jìn)行混合，用乙腈定容，配制成10 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液，-20℃避光保存。

1.2.2 樣品的提取和凈化 樣品前處理方法參照已報道文獻(xiàn)[19]，具體步驟：煙葉樣品粉碎后，稱取2 g 樣品于50 mL 旋蓋離心管中，加入10 mL 超純水，振蕩到樣品被水充分浸潤，靜置10 min。加入10 mL 異丙醇（常規(guī)的QuEChERS 法一般選取乙腈作為提取溶劑，考慮到異丙醇對于新煙堿殺蟲劑的溶解性更好，在水浸潤后更有利于反萃取出新煙堿殺蟲劑[8]，且提取后的冷凍過程異丙醇不容易發(fā)熱結(jié)塊，前期試驗結(jié)果也顯示采用異丙醇為提取溶劑對5 種新煙堿殺蟲劑有較好的回收率），并加入200 μL 內(nèi)標(biāo)（10 μg/mL），渦漩振蕩2 min（2 000 r/min），-18℃條件下冷凍10 min；向離心管中加入0.5 g 檸檬酸二氫鈉，1 g 氯化鈉，1 g檸檬酸鈉和4 g 無水硫酸鎂，漩渦振蕩2 min（2 000 r/min），離心5 min（6 000 r/min）；移取1.0 mL 上清液于1.5 mL 旋蓋離心管，加入25 mg PSA 吸附劑和150 mg 無水硫酸鎂，漩渦振蕩2 min（2 000 r/min），離心5 min（6 000 r/min）。上清液過有機相濾膜（孔徑為0.22 μm），移取200 μL 濾液于1.8 mL 旋蓋色譜瓶，加入800 μL 用超純水，混勻后用于LC-MS/MS 分析測定。

1.2.3 LC-MS/MS 條件優(yōu)化 （1）色譜條件：采用Atlantis UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm，1.8 m） 反相色譜柱；柱溫35℃；樣品室溫度4℃；進(jìn)樣體積2 μL?？疾炝朔聪嗌V常用流動相乙腈/水體系、甲醇/ 水體系以及加入不同濃度甲酸的2 種體系對5 種目標(biāo)化合物色譜保留行為的影響。（2）質(zhì)譜條件：為實現(xiàn)目標(biāo)化合物的痕量分析，選取MRM 定量模式。首先，在流動注射狀態(tài)下，分別將0.5 μg/mL 的單標(biāo)溶液在正離子和負(fù)離子的模式下進(jìn)行全掃描，以選擇合適的分子離子峰和電離方式，然后對毛細(xì)管電壓、霧化氣溫度、錐孔電壓、碰撞能等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用1.2.2 中方法處理空白煙葉樣品，提取空白煙葉基質(zhì)，配制質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的空白煙葉基質(zhì)樣品，采取優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行檢測，以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值y 對相應(yīng)濃度x （μg/mL）進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3 倍信噪比確定方法的檢出限（S/N＞3）。

1.2.5 檢測方法驗證 分別在空白煙葉樣品中加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得新煙堿殺蟲劑的添加量分別為50、250、1 000 μg/kg，按試驗優(yōu)化的條件進(jìn)行處理和測定，開展加標(biāo)回收試驗，以驗證方法的重復(fù)性和精密度。

1.2.6 分析檢測方法的應(yīng)用 采用優(yōu)化后的樣品處理和檢測分析方法測定了國內(nèi)外63 個煙葉樣品中的5種新煙堿殺蟲劑殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件 以乙腈/水和甲醇/水為流動相時，新煙堿殺蟲劑的峰寬稍寬且有一定的拖尾現(xiàn)象，這可能是由于新煙堿殺蟲劑的叔胺基團與色譜柱固定相上殘余硅醇基作用的結(jié)果。由于新煙堿殺蟲劑擁有含氮基團，且具有弱堿性，在流動相中加入適量的甲酸會促進(jìn)其電離，并為陽離子提供必要的質(zhì)子來源，從而提高離子化效率。同時，流動相中甲酸的加入也有助于色譜柱固定相中硅醇基的質(zhì)子化，較好地消除固定相與目標(biāo)分析物的相互作用，從而減少拖尾現(xiàn)象，改善色譜峰形。研究結(jié)果顯示，添加0.1%的甲酸時，色譜峰形較好，且不會產(chǎn)生離子抑制現(xiàn)象。與乙腈相比，甲醇作為流動相時，響應(yīng)值稍高。因此，確定流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為0.1%甲酸甲醇溶液；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序為：0～2 min，90%～50% A；2～2.4 min，50%～30% A；2.4～4.0 min，30%～20% A；4.0～6.0 min，20%～90% A，6.0～ 8.0 min，90%～90% A。

2.1.2 質(zhì)譜條件 研究結(jié)果顯示，正離子模式下，[M+H]+為最強峰，選擇其作為母離子進(jìn)行下一步的碰撞電離；選擇豐度較高、干擾較小的2 對子離子作為定性離子，豐度最高的作為定量離子，另一個為定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如下：電離方式為電噴霧正離子模式；毛細(xì)管電壓為2.6 kV；霧化氣溫度350 ℃；霧化氣流量為1 000 L/h；錐孔氣流量為50 L/h；碰撞氣流量為0.15 mL/min；碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮氣；駐留時間為30 ms，采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行采集。5 種新煙堿殺蟲劑的質(zhì)譜參數(shù)和多反應(yīng)監(jiān)測色譜結(jié)果分別見表1 和圖1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下5 種農(nóng)藥及其內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)和保留時間

圖1 5 種新煙堿殺蟲劑以及內(nèi)標(biāo)的加標(biāo)樣品多反應(yīng)監(jiān)測色譜結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

由表2 可知，采用改進(jìn)的QuEChERS 法提取，色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化后，5 種新煙堿殺蟲劑的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，可以滿足定量分析的需要；以3 倍信噪比確定方法的檢出限（S/N＞3），吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲胺5 種新煙堿殺蟲劑的檢出限分別為1.12、0.76、1.56、1.94、1.70 μg/kg。

表2 5 種新煙堿殺蟲劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.3 方法的回收率及精密度

如表3 所示，加標(biāo)回收試驗中5 種新煙堿殺蟲劑的平均回收率為69.3%～115.9%，RSD 在1.9%～11.9%之間，可以滿足煙葉樣品中殘留農(nóng)藥的分析要求。

2.4 實際煙葉樣本檢測結(jié)果

由表4 可知，部分樣品的吡蟲啉和啶蟲脒有檢出，其平均含量分別為0.146 和0.120 μg/g，檢出率分別為11.1%和6.3%，其余農(nóng)藥未檢出。所有樣品的農(nóng)藥殘留量均未超出CORESTA 于2013 年發(fā)布的指導(dǎo)性殘留限量[1]。與王駿等[21]報道的結(jié)果相比，煙葉中吡蟲啉和啶蟲脒檢出率有所下降，檢出量較為一致。

表3 煙草中5 種新煙堿殺蟲劑的加標(biāo)回收率和精密度（n=5）

表4 檢出樣品中新煙堿殺蟲劑的殘留量 （μg/g）

3 結(jié) 論

采用UPLC-MS/MS 對煙草中5 種新煙堿殺蟲劑殘留量進(jìn)行同時快速分析，以改良的基質(zhì)分散固相萃取法（QuEChERS）提取凈化樣品，氘代內(nèi)標(biāo)定量，吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲胺5 種新煙堿殺蟲劑的檢出限分別為1.12、0.76、1.56、1.94、1.70 μg/kg，總分析時間為8 min。與報道的方法相比[20]，此方法前處理更為簡單，檢測限更低。利用建立的方法測定了國內(nèi)外63 個煙葉樣品，其中部分樣品中吡蟲啉和啶蟲脒有檢出，檢出率分別為11.1%和6.3%，平均含量分別為0.146 和0.120 μg/g。這表明該方法可用于煙葉中5 種新煙堿殺蟲劑的快速測定。