UPLC-MS/MS 同時測定煙草中5 種新煙堿殺蟲劑殘留

熊 巍，張海燕，靳冬梅，韶濟(jì)民，陶曉秋，龐 夙

（四川省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，四川 成都 640001）

新煙堿類殺蟲劑是一種硝基亞甲基雜環(huán)化合物，主要用于防治同翅目，鞘翅目、雙翅目和鱗翅目昆蟲，通過影響昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸、阻止神經(jīng)細(xì)胞間的傳遞而起效。在煙草中廣泛應(yīng)用的新煙堿殺蟲劑有吡蟲啉和啶蟲脒等。2015 年，中國煙葉公司將吡蟲啉和啶蟲脒列為推薦農(nóng)藥。國際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）2013 年制定的農(nóng)用化學(xué)品指導(dǎo)性殘留限量（GRLs）將吡蟲啉和啶蟲脒納入限量類別，煙葉中吡蟲啉和啶蟲脒的限量值分別為5 和2.5 mg/kg[1]。

目前，已報(bào)道的新煙堿殺蟲劑檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[2]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[3]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法（CE-MS）[4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[5-6]，涉及的樣品基質(zhì)主要有蜂蜜[7-11]、飲用水[12]、谷物[13]、蔬果[14]、茶葉[15]以及血液、尿液[16]、奶[17]和組織[18]等生物基質(zhì)樣品。煙葉中的新煙堿殺蟲劑殘留量也受到廣泛關(guān)注，2011 年的煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YC/T405.1—2011）將啶蟲脒和吡蟲啉納入測定范圍[19]。前期也有煙草科技工作者較為關(guān)注煙葉中新煙堿殺蟲劑殘留量的檢測方法研究。何慶等[20]建立了20%甲醇水溶液超聲萃取、石墨化碳柱固相萃取、LC-MS/MS 同時測定煙葉中5 種新煙堿類殺蟲劑殘留的方法，檢出限范圍為0.005～0.009 μg/mL。王駿等[21]通過乙酸-乙腈提取、基質(zhì)固相萃取凈化，再采用UPLC-MS/MS 法測定了31 個烤煙煙葉樣品中的啶蟲脒、吡蟲啉殘留量，發(fā)現(xiàn)煙葉樣品中啶蟲脒檢出率為1/5、檢出量為0.015 5～0.243 1 μg/g，吡蟲啉檢出率約1/4、檢出量為0.022 4～0.179 5 μg/g。

雖然煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)已將啶蟲脒和吡蟲啉納入檢測范疇，但標(biāo)準(zhǔn)方法需要同時測定73 種農(nóng)藥，為照顧多種農(nóng)藥的萃取效率與回收率，選擇乙腈作為萃取劑，而前期的報(bào)道表明正己烷或異丙醇溶劑對新煙堿殺蟲劑的萃取效果較好[8]。因此，筆者針對5 種新煙堿殺蟲劑，對QuEChERS 提取法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了同位素內(nèi)標(biāo)定量的UPLC-MS/MS 同時快速分析煙草中5種新煙堿殺蟲劑殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)品來源于Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers（化學(xué)純度≥98.5%，Augsburg，德國），內(nèi)標(biāo)噻蟲胺-d3來源于加拿大TRC（化學(xué)純度98%，同位素純度98%，多倫多，加拿大）；甲酸 （HPLC 級，德國Sigma 公司），異丙醇、乙腈、正己烷（色譜純，美國Thermo-Fisher公司）；安捷倫農(nóng)殘?jiān)噭┌ò?.5 g 檸檬酸二氫鈉、1 g 氯化鈉、1 g 檸檬酸鈉和4 g 無水硫酸鎂）和N-丙基乙二胺（PSA）購自安捷倫公司（美國），水為超純水。63 個煙葉樣品選自全國煙葉農(nóng)殘普查分析樣品（國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供），無農(nóng)藥殘留煙葉樣品由CORESTA 提供。

主要儀器設(shè)備有Waters ACQUITYTM 超高效液相色譜，Xevo TQ 質(zhì)譜儀（美國Waters 公司），渦旋振蕩器（VtexMixer 230VeU，美國Labnet 公司），離心機(jī)（Sigma 3K15，德國Sigma 公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取新煙堿殺蟲劑的標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.000 1 g）各10 mg，用乙腈溶解定容至10 mL，制得1.0 mg/mL 的單一標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃避光保存；精密量取新煙堿殺蟲劑儲備液各100 μL 于10 mL 容量瓶，用乙腈定容，配制成10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，-20℃避光保存。準(zhǔn)確配置噻蟲胺-d3（0.99 mg/mL）氘代內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于棕色玻璃瓶中，-20℃保存。取一定量的各內(nèi)標(biāo)儲備液進(jìn)行混合，用乙腈定容，配制成10 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)工作液，-20℃避光保存。

1.2.2 樣品的提取和凈化 樣品前處理方法參照已報(bào)道文獻(xiàn)[19]，具體步驟：煙葉樣品粉碎后，稱取2 g 樣品于50 mL 旋蓋離心管中，加入10 mL 超純水，振蕩到樣品被水充分浸潤，靜置10 min。加入10 mL 異丙醇（常規(guī)的QuEChERS 法一般選取乙腈作為提取溶劑，考慮到異丙醇對于新煙堿殺蟲劑的溶解性更好，在水浸潤后更有利于反萃取出新煙堿殺蟲劑[8]，且提取后的冷凍過程異丙醇不容易發(fā)熱結(jié)塊，前期試驗(yàn)結(jié)果也顯示采用異丙醇為提取溶劑對5 種新煙堿殺蟲劑有較好的回收率），并加入200 μL 內(nèi)標(biāo)（10 μg/mL），渦漩振蕩2 min（2 000 r/min），-18℃條件下冷凍10 min；向離心管中加入0.5 g 檸檬酸二氫鈉，1 g 氯化鈉，1 g檸檬酸鈉和4 g 無水硫酸鎂，漩渦振蕩2 min（2 000 r/min），離心5 min（6 000 r/min）；移取1.0 mL 上清液于1.5 mL 旋蓋離心管，加入25 mg PSA 吸附劑和150 mg 無水硫酸鎂，漩渦振蕩2 min（2 000 r/min），離心5 min（6 000 r/min）。上清液過有機(jī)相濾膜（孔徑為0.22 μm），移取200 μL 濾液于1.8 mL 旋蓋色譜瓶，加入800 μL 用超純水，混勻后用于LC-MS/MS 分析測定。

1.2.3 LC-MS/MS 條件優(yōu)化 （1）色譜條件：采用Atlantis UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm，1.8 m） 反相色譜柱；柱溫35℃；樣品室溫度4℃；進(jìn)樣體積2 μL?？疾炝朔聪嗌V常用流動相乙腈/水體系、甲醇/ 水體系以及加入不同濃度甲酸的2 種體系對5 種目標(biāo)化合物色譜保留行為的影響。（2）質(zhì)譜條件：為實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的痕量分析，選取MRM 定量模式。首先，在流動注射狀態(tài)下，分別將0.5 μg/mL 的單標(biāo)溶液在正離子和負(fù)離子的模式下進(jìn)行全掃描，以選擇合適的分子離子峰和電離方式，然后對毛細(xì)管電壓、霧化氣溫度、錐孔電壓、碰撞能等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用1.2.2 中方法處理空白煙葉樣品，提取空白煙葉基質(zhì)，配制質(zhì)量濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的空白煙葉基質(zhì)樣品，采取優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行檢測，以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值y 對相應(yīng)濃度x （μg/mL）進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3 倍信噪比確定方法的檢出限（S/N＞3）。

1.2.5 檢測方法驗(yàn)證 分別在空白煙葉樣品中加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得新煙堿殺蟲劑的添加量分別為50、250、1 000 μg/kg，按試驗(yàn)優(yōu)化的條件進(jìn)行處理和測定，開展加標(biāo)回收試驗(yàn)，以驗(yàn)證方法的重復(fù)性和精密度。

1.2.6 分析檢測方法的應(yīng)用 采用優(yōu)化后的樣品處理和檢測分析方法測定了國內(nèi)外63 個煙葉樣品中的5種新煙堿殺蟲劑殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件 以乙腈/水和甲醇/水為流動相時，新煙堿殺蟲劑的峰寬稍寬且有一定的拖尾現(xiàn)象，這可能是由于新煙堿殺蟲劑的叔胺基團(tuán)與色譜柱固定相上殘余硅醇基作用的結(jié)果。由于新煙堿殺蟲劑擁有含氮基團(tuán)，且具有弱堿性，在流動相中加入適量的甲酸會促進(jìn)其電離，并為陽離子提供必要的質(zhì)子來源，從而提高離子化效率。同時，流動相中甲酸的加入也有助于色譜柱固定相中硅醇基的質(zhì)子化，較好地消除固定相與目標(biāo)分析物的相互作用，從而減少拖尾現(xiàn)象，改善色譜峰形。研究結(jié)果顯示，添加0.1%的甲酸時，色譜峰形較好，且不會產(chǎn)生離子抑制現(xiàn)象。與乙腈相比，甲醇作為流動相時，響應(yīng)值稍高。因此，確定流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為0.1%甲酸甲醇溶液；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?～2 min，90%～50% A；2～2.4 min，50%～30% A；2.4～4.0 min，30%～20% A；4.0～6.0 min，20%～90% A，6.0～ 8.0 min，90%～90% A。

2.1.2 質(zhì)譜條件 研究結(jié)果顯示，正離子模式下，[M+H]+為最強(qiáng)峰，選擇其作為母離子進(jìn)行下一步的碰撞電離；選擇豐度較高、干擾較小的2 對子離子作為定性離子，豐度最高的作為定量離子，另一個為定性離子。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如下：電離方式為電噴霧正離子模式；毛細(xì)管電壓為2.6 kV；霧化氣溫度350 ℃；霧化氣流量為1 000 L/h；錐孔氣流量為50 L/h；碰撞氣流量為0.15 mL/min；碰撞氣為氬氣，其余氣體為氮?dú)?；駐留時間為30 ms，采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行采集。5 種新煙堿殺蟲劑的質(zhì)譜參數(shù)和多反應(yīng)監(jiān)測色譜結(jié)果分別見表1 和圖1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測模式下5 種農(nóng)藥及其內(nèi)標(biāo)的部分質(zhì)譜參數(shù)和保留時間

圖1 5 種新煙堿殺蟲劑以及內(nèi)標(biāo)的加標(biāo)樣品多反應(yīng)監(jiān)測色譜結(jié)果

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

由表2 可知，采用改進(jìn)的QuEChERS 法提取，色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化后，5 種新煙堿殺蟲劑的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99，可以滿足定量分析的需要；以3 倍信噪比確定方法的檢出限（S/N＞3），吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲胺5 種新煙堿殺蟲劑的檢出限分別為1.12、0.76、1.56、1.94、1.70 μg/kg。

表2 5 種新煙堿殺蟲劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.3 方法的回收率及精密度

如表3 所示，加標(biāo)回收試驗(yàn)中5 種新煙堿殺蟲劑的平均回收率為69.3%～115.9%，RSD 在1.9%～11.9%之間，可以滿足煙葉樣品中殘留農(nóng)藥的分析要求。

2.4 實(shí)際煙葉樣本檢測結(jié)果

由表4 可知，部分樣品的吡蟲啉和啶蟲脒有檢出，其平均含量分別為0.146 和0.120 μg/g，檢出率分別為11.1%和6.3%，其余農(nóng)藥未檢出。所有樣品的農(nóng)藥殘留量均未超出CORESTA 于2013 年發(fā)布的指導(dǎo)性殘留限量[1]。與王駿等[21]報(bào)道的結(jié)果相比，煙葉中吡蟲啉和啶蟲脒檢出率有所下降，檢出量較為一致。

表3 煙草中5 種新煙堿殺蟲劑的加標(biāo)回收率和精密度（n=5）

表4 檢出樣品中新煙堿殺蟲劑的殘留量 （μg/g）

3 結(jié) 論

采用UPLC-MS/MS 對煙草中5 種新煙堿殺蟲劑殘留量進(jìn)行同時快速分析，以改良的基質(zhì)分散固相萃取法（QuEChERS）提取凈化樣品，氘代內(nèi)標(biāo)定量，吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺、噻蟲啉、噻蟲胺5 種新煙堿殺蟲劑的檢出限分別為1.12、0.76、1.56、1.94、1.70 μg/kg，總分析時間為8 min。與報(bào)道的方法相比[20]，此方法前處理更為簡單，檢測限更低。利用建立的方法測定了國內(nèi)外63 個煙葉樣品，其中部分樣品中吡蟲啉和啶蟲脒有檢出，檢出率分別為11.1%和6.3%，平均含量分別為0.146 和0.120 μg/g。這表明該方法可用于煙葉中5 種新煙堿殺蟲劑的快速測定。