15 份魔芋資源的生物學(xué)特性和ISSR 分析

董 坤，陳 玲，盧 俊，張曉玲，鄭立飛,4，楊柱瓊，余學(xué)堂，曾黎瓊

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院富源魔芋研究所，云南 富源 655500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223； 3.威信縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南 昭通 657900；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201）

魔芋是天南星科多年生草本植物，其球莖中含有大量葡甘露聚糖，該物質(zhì)具有高吸水性和高膨脹性，在醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。中國是魔芋的原產(chǎn)地之一，栽培和利用魔芋歷史悠久。云南省特有的地形和氣候條件，是發(fā)展魔芋產(chǎn)業(yè)的適宜 區(qū)域[1-2]。尤其是近年來，隨著國家鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的實(shí)施，魔芋產(chǎn)業(yè)成為山區(qū)扶貧的重要項目之一，農(nóng)民種植魔芋的積極性日益高漲。目前，關(guān)于魔芋的研究多集中在栽培技術(shù)[3-5]、病蟲害防治[6-7]等方面。也有學(xué)者就魔芋的形態(tài)學(xué)開展了一系列研究[8-10]，制定了相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)[11]，為魔芋種質(zhì)資源的鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。在分子標(biāo)記方面，RAPD、AFLP、ISSR等技術(shù)都被應(yīng)用于魔芋種質(zhì)資源研究[12-16]，為魔芋屬植物分類以及種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析提供了依據(jù)。筆者利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)，對富源縣金地魔芋種業(yè)有限公司收集和自育的15 份魔芋資源的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，旨在為不同魔芋資源的鑒定及其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

15 份魔芋資源編號為1～15 號，其中，1、5～7、11 號來源于云南富源，2 號來源于云南普洱，3 號來源于云南楚雄，4 號來源于云南文山，8 號（遠(yuǎn)雜1 號）來源于湖北恩施，9、12 號來源于云南臨滄，10、13、14、15 號分別來源于云南會澤、貴州威寧、云南昭通、云南瀘西。收集后于2019 年種植在富源縣金地魔芋種業(yè)有限公司魔芋種植基地。

1.2 調(diào)查方法

參考NT-T2500—2013 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 魔芋觀測記錄魔芋植株葉柄、葉片、球莖、花、果的形態(tài)特征。播種時測定種芋重量，膨大期測量其株高、葉柄周長、葉柄長度、開展度，倒苗后挖出球莖測定其重量。

1.3 ISSR 分析

采用Magen（美基）生物公司DNA 提取試劑盒提取供試材料單株葉片基因組DNA。DNA 純化后用0.8%瓊脂糖凝膠檢測，以確定其質(zhì)量。利用紫外分光光度計將DNA 濃度調(diào)整為10 ng/μL，存于-20℃冰箱備用。

PCR 反應(yīng)體系總體積為15 μL：天根2×Taq PCR MasterMPCR 7.5 μL，引物（10 μmol/L）1 μL（所用引物由上海生工合成，詳見表1），模板DNA（10 ng/μL）2 μL，ddH2O 4.5 μL，最后加1 滴石蠟油防止蒸發(fā)。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50～55℃復(fù)性30 s（溫度因引物不同而異，具體溫度如表1 所示），72℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上以5 V/cm 恒壓電泳，選用DL 1 000 marker （寶生物工程大連有限公司）作為對比，通過凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 和SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析比較；運(yùn)用Popgeng-32 軟件計算各材料間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋資源的生物學(xué)特性

表1 ISSR 引物名稱，序列及其退火溫度

15 份魔芋資源的形態(tài)特征詳見圖1 和表2。1、3、15、5、13、9 號樣品具有花魔芋形態(tài)特征，它們的主要區(qū)別在于葉柄主色、葉柄斑紋顏色和形狀的不同。1、3、15、5、13、9 號樣品球莖肉色都為白色，其中15號樣品白色球莖肉色中有紅絲，與其他樣品明顯不同。1、3、15、13、9 號魔芋的肉穗狀花序長度高于佛焰苞位置；5 號魔芋的肉穗狀花序長度約等于佛焰苞位置。6、7、14、8 號樣品具有白魔芋形態(tài)特征，植株較矮小，主要區(qū)別是葉柄主色、葉柄斑紋形狀和顏色不同。6 號魔芋葉柄綠色，細(xì)小點(diǎn)狀灰白色斑紋；7號魔芋葉柄綠色，塊狀斑紋；14 號魔芋葉柄綠色，點(diǎn)狀斑紋；8 號魔芋葉柄淺粉紅色，塊狀墨綠色斑紋。2號魔芋植株相對較大，球莖肉色為黃色，附屬器淺紫色且有皺褶，果序?yàn)樗{(lán)色，鑒定為勐海魔芋。4 號魔芋植株分叉處有株芽，植株較大，球莖肉色為粉紅色，佛焰苞內(nèi)側(cè)紅色，外側(cè)粉紅色，果序?yàn)槌燃t色，是一種珠芽魔芋。10 號魔芋和11 號魔芋鑒定為滇魔芋，主要區(qū)別是葉柄和葉柄斑顏色不同，11 號魔芋的葉柄主色更深，斑點(diǎn)更多，果序?yàn)樗{(lán)色。12 號魔芋植株較大，叢生性強(qiáng)，球莖上芽點(diǎn)較多，根系發(fā)達(dá)，球莖肉色為橙色，鑒定為甜魔芋，開花后干枯死亡，未見結(jié)子。

圖1 15 份魔芋相關(guān)器官的形態(tài)特征

表2 樣品來源及形態(tài)比較

2.2 魔芋植株的長勢

如表3 所示，2、4 號魔芋的平均株高、葉柄長、開展度、葉柄周長數(shù)值較大，6、7、8、14 號魔芋的平均株高、葉柄長、開展度、葉柄周長數(shù)值較??；生長系數(shù)最大的是5 號魔芋，為5.78。

2.3 ISSR 分析

提取15 份魔芋葉片基因組DNA 進(jìn)行了ISSR分析。從41 條引物中篩選出31 條引物可擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性高的條帶，圖2 為引物UBC822 的電泳圖譜。結(jié)果顯示，以15 份魔芋葉片基因組DNA 作為模板，31 條引物共擴(kuò)增出490 條DNA帶，其中多態(tài)性條帶共489 條，占99.80%。

利用Popgen 32 軟件計算不同魔芋材料間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，結(jié)果見表4。可見，15 份魔芋材料之間的遺傳相似系數(shù)在0.555 1～0.942 9，遺傳距離在0.058 8～0.588 6，其中1 號花魔芋與3 號花魔芋之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.942 9，遺傳距離最小，為0.058 8；3 號花魔芋與11 號滇魔芋芋之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.555 1，遺傳距離最大，為0.588 6。聚類分析結(jié)果見圖3，15 份魔芋材料在遺傳相似系數(shù)為0.69 的位置處分成6 大類：第一類包括1、3、15、5、13、9 號樣品，具有花魔芋形態(tài)特征；第二類包括6、7、14、8 號樣品，具有白魔芋形態(tài)特征；第三類包括2 號樣品（勐海魔芋）；第四類包括4 號樣品（珠芽魔芋）；第五類包括10、11 號樣品，具有滇魔芋的形態(tài)特征；第六類包括12 號樣品，具有甜魔芋的形態(tài)特征。可見，15 份魔芋的遺傳聚類與形態(tài)外觀調(diào)查分析結(jié)果基本一致。

表3 15 份魔芋材料的生長情況

圖2 ISSR 分析電泳圖（引物UBC822）

表4 15 份魔芋材料的的遺傳相似系數(shù)（—以上）和遺傳距離（—以下）

3 小結(jié)與討論

在同樣的種植條件下觀察不同魔芋種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀，可以看出曲靖市富源縣竹園鎮(zhèn)的氣候環(huán)境不是白魔芋、勐海魔芋、珠芽魔芋、滇磨芋和甜魔芋的最佳生長條件，導(dǎo)致這些魔芋植株長勢稍差。從生長系數(shù)看，5 號魔芋更適合在當(dāng)?shù)胤N植。

圖3 15 份魔芋材料的聚類結(jié)果

對15 份魔芋材料的葉、球莖、花、果等進(jìn)行了觀察記載和農(nóng)藝性狀分析調(diào)查，并利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)分析了它們的遺傳多樣性，聚類分析結(jié)果顯示，花魔芋、白魔芋、勐海魔芋、珠芽魔芋、滇魔芋、甜魔芋各自聚為一類，遠(yuǎn)雜1 號在遺傳上更接近于白魔芋，為今后魔芋種質(zhì)資源鑒定和保護(hù)利用提供了依據(jù)。

ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)能夠揭示植物的遺傳多態(tài)性，有效反映出品種間的親緣關(guān)系。任盤宇等[14]對云南南部5 種魔芋屬植物居群遺傳結(jié)構(gòu)的分析中，通過PCR 擴(kuò)增9 個ISSR 引物共獲得95 條條帶，其中多態(tài)性條帶占總條帶數(shù)的100%。在該研究中，15 份魔芋材料通過31 個引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增共獲得490 條條帶，其中多態(tài)性條帶489 條，占總條帶數(shù)的99.80%。遺傳相似系數(shù)是比較不同品種或群體間遺傳多樣性的重要指標(biāo)。任盤宇等[14]利用ISSR 技術(shù)對云南南部5 種魔芋屬植物居群遺傳結(jié)構(gòu)分析的樣品間遺傳相似系數(shù)為0.857 1～0.473 7，宣慢[16]利用ISSR 技術(shù)對49 份魔芋屬資源的多樣性分析，其遺傳相似系數(shù)為1.00～0.68，該研究中15 份魔芋樣品間的遺傳相似系數(shù)為0.555 1～ 0.942 9，居于前二者的研究結(jié)果之間。聚類分析結(jié)果顯示，花魔芋和白魔芋的雜交品種遠(yuǎn)雜1 號的親緣關(guān)系更靠近白魔芋。滕彩珠等[17]進(jìn)行的云南魔芋種質(zhì)資源親緣關(guān)系ISSR 分析發(fā)現(xiàn)甜魔芋與花魔芋聚到一起，與該研究結(jié)果中甜魔芋（12 號樣品）與滇魔芋（10、11 號樣品）聚到一起，有所不同，可能是因?yàn)樵撗芯克x擇的ISSR 引物較少未能全面地反映二者在DNA水平上的差異所致。