籽粕熏蒸對哈密瓜發(fā)病土壤真核微生物群落組成和變化的影響①

彭俊偉，申民翀，董元華，李建剛*

(1 中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

哈密瓜是主要的設(shè)施大棚作物之一，我國的種植面積和產(chǎn)量居世界之首[1]。但由于國內(nèi)大棚栽培管理中存在很多誤區(qū)，對種植中出現(xiàn)的土傳病害尚無有效防治措施，導(dǎo)致了巨大經(jīng)濟(jì)損失。在哈密瓜設(shè)施大棚種植中，連作是產(chǎn)生土傳病害的主要原因，而根際微生物區(qū)系失衡是連作障礙發(fā)生的重要原因[2]。長期連作條件下，作物根系分泌物會持續(xù)誘導(dǎo)病原菌在根系的定殖和侵染，從而造成病害的發(fā)生[3]。哈密瓜的土傳病害主要有枯萎病、蔓枯病、根腐病等[4]，是由土壤中的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、蔓枯病菌(Didymella bryoniae)等侵染所致[5]，其使植物組織受到損傷，對作物生長產(chǎn)生非常不利的影響，極大地降低哈密瓜產(chǎn)量和質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)甚至直接導(dǎo)致作物死亡，造成絕收現(xiàn)象。

目前針對土傳病害問題，主要通過種植管理和土壤消毒兩種方式進(jìn)行防控。種植管理通過抗病品種選育、種苗消毒、嫁接以及農(nóng)藥等措施來降低病害，但并未從根本上解決植物病害的發(fā)生；土壤消毒則以消滅病原物的方式對病害進(jìn)行防控，主要利用氯化苦、棉隆等化學(xué)藥劑在作物種植前對土壤進(jìn)行熏蒸處理。熏蒸技術(shù)高效快捷，得到廣泛的運(yùn)用，但高毒性的熏蒸劑，如氯化苦，往往存在著不容忽視的環(huán)境問題。棉隆雖然屬于低毒類消毒材料，但有研究表明其在土壤中的分解產(chǎn)物會對環(huán)境中生物產(chǎn)生一定毒性，在使用時(shí)存在一定的環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)[6]。另外，也有人認(rèn)為化學(xué)熏蒸劑的使用不利于土壤中有益微生物的群落構(gòu)建，從長遠(yuǎn)來看可能會加劇土壤病害[7]。

油菜籽粕本身作為一種天然綠色有機(jī)物，能為土壤肥力作出貢獻(xiàn)，促進(jìn)土壤碳、氮代謝的調(diào)節(jié)[8]，重要的是其有作為土壤熏蒸劑的潛力來防治土壤病蟲害，很多研究表明籽粕在促進(jìn)作物生長和抑制病原菌方面都具有顯著效果[9-10]。籽粕的熏蒸潛力來源于其富含的硫代葡萄糖苷，此類物質(zhì)水解可產(chǎn)生有廣泛殺菌性的次級產(chǎn)物[11]，因此當(dāng)籽粕作為熏蒸材料加入土壤后，會抑制土壤中病原菌的生命活動(dòng)，從而影響微生物的群落組成。有研究者對籽粕熏蒸處理后的土壤進(jìn)行微生物組成分析，發(fā)現(xiàn)籽粕的加入顯著降低了胡椒枯萎病菌的相對豐度，從而抑制了病害的發(fā)生[12]。此外，與傳統(tǒng)化學(xué)熏蒸劑相比，除了綠色無害，籽粕還能更持久地抑制土壤中某些有害生物，從而更長效地對病害起到防控效果[7]。

為探究籽粕用于哈密瓜土傳病害防治的效果以及對土壤中真核微生物群落的影響，本研究利用十字花科籽粕和傳統(tǒng)化學(xué)熏蒸劑棉隆作為熏蒸材料，對土壤中真核微生物的動(dòng)態(tài)變化過程作了探討，分析了籽粕與棉隆對土壤微生物的影響，并結(jié)合真核微生物群落與作物發(fā)病情況，評估了其相互間的關(guān)系，以為籽粕用于哈密瓜病害防治技術(shù)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地位于安徽省亳州市譙城區(qū)哈密瓜種植基地(33°45′N，115°40′E)，該基地大棚內(nèi)常年連作哈密瓜，多種土傳病害相伴發(fā)生，作物病害嚴(yán)重。

用于試驗(yàn)地熏蒸的籽粕，由油菜籽壓榨油料后的殘?jiān)?jīng)粉碎過篩(2 mm)得到，分為白菜型(Brassica campes)和芥菜型(Brassica juncea)兩種類型，分別購于甘肅省天水市和新疆阿克蘇地區(qū)。用作陽性對照使用的化學(xué)熏蒸農(nóng)藥棉隆(Dazomet，純度98%)購于武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，有廣譜的殺菌和殺蟲作用。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)開始于2019年7月中旬，同年10月底結(jié)束。在哈密瓜種植前翻耕土壤，深度15 cm左右，盡可能碎土以增加土壤孔隙度。翻耕后用水澆透供后續(xù)熏蒸材料更好地發(fā)揮功效，待土壤相對濕度為50% ~ 70%，加入熏蒸材料，白菜型和芥菜型籽粕的用量均為2.2 kg/m2，棉隆根據(jù)當(dāng)?shù)厥褂媒?jīng)驗(yàn)以40 g/m2的用量添加。加料后通過翻耕機(jī)將料物均勻混入土壤中，并立刻用塑料薄膜覆蓋試驗(yàn)地，四邊用土壓實(shí)提供密閉的熏蒸環(huán)境。處理2周后揭膜散氣，后續(xù)哈密瓜種植按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)置4個(gè)處理，分別為對照(CK)、白菜型籽粕(B)、芥菜型籽粕(J)和棉隆(ML)，每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)長6.5 m、寬5.5 m。在整個(gè)土壤處理和后期種植過程中，對土壤共進(jìn)行4次取樣，分別為熏蒸處理前(T1)的混合土壤，熏蒸處理后(T2)的小區(qū)土壤，苗期(T3)的小區(qū)土壤以及成熟期(T4)的根際土壤。并在成熟期(T4)時(shí)隨機(jī)取樣統(tǒng)計(jì)各小區(qū)單果重量，同時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理小區(qū)內(nèi)所有植株的病株率從而計(jì)算防效，計(jì)算方式如下：病株率(%)= 病株數(shù)/總株數(shù)×100，防效(%)= (對照病株率–處理病株率)/ 對照病株率×100[13]。

1.3 真核微生物群落組成測定

DNA提?。翰捎肕P Biomedicals公司的FastDNA Spin Kit for Soil 土壤DNA提取試劑盒提取土壤微生物總DNA，供后續(xù)微生物18S rRNA基因的測序。

測序及分析：DNA樣品經(jīng)檢測、PCR擴(kuò)增、純化、建庫后在NovaSeq平臺對樣品18S rDNA的V4區(qū)域(528F ~ 706R)進(jìn)行測序；測序后的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控和過濾，得到用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)；對有效數(shù)據(jù)以97% 的一致性進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units)聚類，然后對OTUs的序列進(jìn)行物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用OTUs序列數(shù)據(jù)基于加權(quán)Bray-Curtis距離進(jìn)行UPGMA聚類和PCoA主坐標(biāo)分析，評估不同處理下的微生物群落結(jié)構(gòu)；并通過ANOSIM相似分析檢驗(yàn)各處理間的群落結(jié)構(gòu)差異；通過FunGuild對根際微生物進(jìn)行功能預(yù)測；基于t檢驗(yàn)檢測主要微生物的豐度差異，并通過Pearson相關(guān)性分析評估主要微生物與哈密瓜發(fā)病率間的相關(guān)性。分析和繪圖采用SPSS 21.0、R 3.5.3和Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粕處理后哈密瓜的生長和發(fā)病情況

哈密瓜的生長和發(fā)病統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，籽粕的加入能夠顯著降低哈密瓜病株率并增加其產(chǎn)量，而棉隆處理僅對防效有幫助，對增產(chǎn)作用并不顯著(表1)。與對照組51.13% 的病株率相比，經(jīng)白菜型、芥菜型籽粕和棉隆熏蒸處理的哈密瓜病株率均顯著降低，分別僅有25.94%、23.18% 和22.74%，防效達(dá)到了49.26%、54.66% 和55.53%。在作物生長方面，籽粕的加入促進(jìn)了哈密瓜的生長，白菜型和芥菜型籽粕處理后的哈密瓜單果重較對照組分別提高了18.66%和10.04%，而棉隆處理對果實(shí)質(zhì)量的增加并不顯著(P>0.05，表1)，說明相較于棉隆，籽粕作為熏蒸劑對哈密瓜的生長有更好的促進(jìn)作用。

2.2 籽粕對土壤真核微生物多樣性的影響

加入籽粕在前期較棉隆更大程度地降低了土壤中真核微生物的豐富度和多樣性，且在后期有更加明顯的恢復(fù)趨勢(圖1)。白菜、芥菜型籽粕熏蒸處理后土壤(T2)中的物種豐富度和多樣性結(jié)果相似(圖1，P>0.05)，物種數(shù)目和Shannon指數(shù)分別為529、586和3.9、4.5，但均顯著低于對照組(圖1，P<0.05)；苗期(T3)土壤中微生物多樣性結(jié)果變化不大，但在成熟期(T4)的根際土壤中，籽粕處理下的微生物豐富度和多樣性得到了恢復(fù)，白菜、芥菜型籽粕處理下的物種數(shù)目分別上升到691、805，與對照組的差異較前期明顯減小，Shannon指數(shù)也分別上升到了4.48和5.01，與對照組間無顯著性差異(圖1，P>0.05)。棉隆處理對前期(T2、T3)土壤中微生物的多樣性無顯著影響，但顯著影響了物種豐富度；而在成熟期(T4)根際土壤中，棉隆處理對微生物的物種豐富度和多樣性均有顯著影響，物種數(shù)目和Shannon指數(shù)分別僅有569和3.38，顯著低于對照組和籽粕處理組(圖1，P<0.05)。

表1 不同處理哈密瓜的生長和發(fā)病情況Table 1 Growth and incidence of cantaloupe under different treatments

群落多樣性的結(jié)果說明，籽粕和棉隆處理對土壤中微生物的改變方式和過程存在差異，籽粕處理會影響土壤中微生物的豐富度及多樣性，而棉隆處理的影響僅體現(xiàn)在豐富度上，且籽粕處理相較于棉隆處理，存在微生物群落的恢復(fù)過程，不會顯著降低根際微生物的豐富度和多樣性。

2.3 籽粕對土壤真核微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

基于Bray-Curtis距離算法，使用UPGMA聚類和PCoA主坐標(biāo)分析方法評估籽粕和棉隆處理在時(shí)間尺度上對土壤和根際真核微生物群落結(jié)構(gòu)的擾動(dòng)，分析時(shí)間和不同熏蒸處理對群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，在UPGMA聚類樹和PCoA主坐標(biāo)圖中，同一時(shí)間點(diǎn)的處理間距離更近，相似度更高，按照哈密瓜生育期主要可劃分為哈密瓜作物種植前(T1，熏蒸處理前；T2，熏蒸處理后)和種植后(T3，苗期；T4，成熟期)兩大分支(圖2)，說明微生物群落結(jié)構(gòu)在時(shí)間尺度上的區(qū)分更為明顯。進(jìn)一步分析不同熏蒸處理對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)籽粕處理相對于棉隆處理，能更顯著地改變土壤中微生物群落。ANOSIM相似性分析表明，除了T3時(shí)期的芥菜籽粕處理，兩種籽粕處理在熏蒸后(T2)和種植期(T3、T4)均能明顯影響微生物群落結(jié)構(gòu)，與對照組間存在顯著差異(表2，P<0.05)，而棉隆處理的群落結(jié)構(gòu)僅在苗期(T3)與對照組間有顯著差異(表2)。

微生物群落結(jié)構(gòu)的差異結(jié)果說明，籽粕與棉隆處理對真核微生物的擾動(dòng)是存在顯著差異的，白菜和芥菜型籽粕能更顯著地引起土著真核微生物群落的改變，并且這種改變是持續(xù)在整個(gè)生產(chǎn)過程中的。

表2 相似性分析(ANOSIM)評估籽粕和棉隆處理在T2 ~T4時(shí)期對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Analysis of similarities (ANOSIM) to assess effects of seed meals and dazomet on microbial community compisition from T2 to T4 periods

2.4 籽粕對土壤真核微生物群落動(dòng)態(tài)變化和根際真核微生物富集的影響

籽粕和棉隆處理均能引起土壤中真核微生物群落的變化，但其在微生物削減、微生物恢復(fù)和最終的根際微生物定殖方面都有顯著不同。在白菜和芥菜籽粕熏蒸處理后(T2)，土壤中的主要門水平真核微生物較對照發(fā)生了顯著的豐度變化，而棉隆處理下的主要微生物基本沒有呈現(xiàn)明顯的豐度變化。土壤中最主要的微生物群子囊菌門(Ascomycota)相對豐度高達(dá)54.65%，在白菜和芥菜籽粕處理后顯著減少到15.57% 和24.74%，下降了39.08% 和29.91%；另一個(gè)未定義的門(unidentified_Eukaryota)作為主要微生物群，其相對豐度達(dá)到18.86%，在白菜和芥菜籽粕處理下相對豐度也顯著下降了14.19% 和14.37%；而被孢霉門(Mucoromycota)在白菜和芥菜籽粕處理后相對豐度得到大幅提升，在2.79% 的基礎(chǔ)上分別提高了41.45%和44.50%；此外，在棉隆處理中，主要微生物群中僅被孢霉門相對豐度顯著提升了9.00%，其他主要門水平微生物與對照組間無顯著性差異(圖3A)。

熏蒸處理后(T2)到苗期(T3)的這一階段，對照和棉隆處理中主要門水平微生物基本無顯著變化，但白菜和芥菜籽粕處理下的微生物發(fā)生了顯著變化(圖3B)。較熏蒸處理后(T2)，苗期(T3)時(shí)的白菜和芥菜籽粕處理中的子囊菌門(Ascomycota)相對豐度得到了恢復(fù)和顯著提升，分別增加了54.78% 和38.40%；而毛霉菌門(Mucoromycota)和鏈形植物門(Streptophyta)的相對豐度在T2和T3時(shí)的差異雖不顯著，但呈現(xiàn)了降低的變化趨勢(圖3B)。

在哈密瓜成熟期(T 4)的根際土壤中，通過FUNGuild功能預(yù)測對主要微生功能群進(jìn)行分析，在結(jié)果中出現(xiàn)3個(gè)潛在的植物病原菌群，且這3種功能菌群在白菜和芥菜籽粕處理下的含量要明顯低于對照和棉隆處理(圖4)，說明這兩種籽粕處理都有效地抑制了根際相關(guān)病原菌的定殖，有利于根際微生物群落的構(gòu)建。為探究不同熏蒸處理對根際微生物群落構(gòu)建的影響，在屬水平上比較了各熏蒸處理與對照組間的主要微生物豐度差異(圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要有以下屬在熏蒸處理和對照間具有顯著性差異：曲霉菌屬(Aspergillus)、枝孢屬(Cladosporium)、毛殼菌屬(Chaetomium)、殖口蟲屬(Gonostomum)和被孢霉菌屬(Mortierella)。其中曲霉菌屬在白菜和芥菜籽粕處理中的相對豐度高達(dá)26.97% 和19.68%，顯著高于對照組的5.25%；毛殼菌屬的差異僅出現(xiàn)在芥菜籽粕處理與對照組間，相較于對照組中相對含量僅有0.96%，其在芥菜籽粕中的相對豐度上升到了5.13%。這兩個(gè)屬在對病害的防治中起到了重要的作用，在相關(guān)性分析中呈現(xiàn)出了與疾病間顯著的相關(guān)性(表3)。曲霉菌屬與發(fā)病率間呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= –0.526，P= 0.036)，且通過更近一步的物種分析可發(fā)現(xiàn)，曲霉菌屬下的主要種慢性曲霉(Aspergillus lentulus)與發(fā)病率間也呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= –0.505，P= 0.046)；而毛殼菌屬雖然于發(fā)病率間沒有顯著相關(guān)性，但其下種OTU_213與發(fā)病率間呈現(xiàn)了顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。說明慢性曲霉菌和毛殼菌屬下種OTU_213也許能對哈密瓜病害的防治起到關(guān)鍵作用，屬于根際的抗病有益菌。

表3 關(guān)鍵物種與發(fā)病率的Pearson相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation coefficients of key species and incidence rate

3 討論

對土壤進(jìn)行籽粕熏蒸處理后，土壤中某些微生物的生長因其水解產(chǎn)物的毒性作用受到抑制，整體上呈現(xiàn)出豐富度和多樣性顯著下降的趨勢，但這種趨勢在作物成熟時(shí)消失，微生物多樣性恢復(fù)到與對照組同一水平(圖1)。這一結(jié)論與前人的籽粕防病研究結(jié)論相似，籽粕處理下真菌群落微生物與對照間的差異度在作物種植后顯著減小[14]。與棉隆處理對土壤豐富度和多樣性單一的削減不同，籽粕處理對土壤中微生物的變化影響更為復(fù)雜，會經(jīng)歷生物削減和恢復(fù)兩個(gè)過程。

雖然籽粕廣譜的滅生性使微生物多樣性整體下降，但其能抑制作物根際病原菌的定殖并促進(jìn)獨(dú)特微生物的富集，構(gòu)建特異的微生物群落結(jié)構(gòu)[6]，而這種微生物群落可能在一定程度上也會產(chǎn)生揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)，使病原真菌細(xì)胞膜或抗氧化系統(tǒng)功能異常[15]，起到進(jìn)一步的熏蒸抑病效果。盡管在本試驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)哈密瓜主要致病菌(腐霉屬(Pythium)和鐮刀屬(Fusarium)真菌)在處理間的顯著差異，但FunGuild分析結(jié)果表明(圖4)，籽粕處理確實(shí)對一些潛在植物病原菌存在綜合抑制作用，使得根際微生物的病原菌數(shù)量減少，從而達(dá)到抑病效果。油菜籽粕對土壤中多種病原菌有抑制效果[16-17]，而土壤中的籽粕養(yǎng)分含量會驅(qū)動(dòng)微生物群落結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[18]，促進(jìn)一些有益微生物的富集。在籽粕作用下，一類關(guān)鍵真核微生物子囊菌門(Ascomycota)經(jīng)歷了顯著的變化，影響了微生物群落的構(gòu)建，該門經(jīng)過籽粕熏蒸作用后相對豐度先是顯著降低(圖3A)，然后在后續(xù)作物種植過程中又迅速恢復(fù)和擴(kuò)繁，重新占據(jù)了土壤環(huán)境中的主要生態(tài)位(圖3B)。而在哈密瓜生長后期，子囊菌門中的一些特定物種也作為有益微生物參與了根際微生物的構(gòu)建，與病害間呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(表3)。由于籽粕中特有的高碳氮含量會促進(jìn)腐生真菌的繁殖[19]，使得子囊菌門下的曲霉菌屬(Aspergillus)相對豐度得到提升，出現(xiàn)可能可以抑制病原菌的有益微生物。有研究利用曲霉菌屬下的Aspergillus flavus、Aspergillus niger和Aspergillus terreus實(shí)現(xiàn)了對哈密瓜病原菌F.oxysporumf. sp.melonis的抑制[20]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)曲霉菌屬下慢性曲霉(Aspergillus lentulus)與哈密瓜發(fā)病率間呈顯著負(fù)相關(guān)性(表3)，可能是作為有益菌存在于根際中，對有害微生物起到了拮抗作用，從而抑制了相關(guān)功能病原菌群在根際的定殖(圖4)。同樣可能與抑病有關(guān)的還有芥菜型籽粕處理下富集的毛殼菌屬(Chaetomium)，該屬下的一些微生物對病原性鐮刀菌(Fusarium)具有拮抗作用[21-22]，通過深入分析也發(fā)現(xiàn)，本研究中毛殼菌屬下的一個(gè)未知種(OTU_213)與哈密瓜發(fā)病率間具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(表3)，可能也屬于一類有益菌定殖于根際發(fā)揮抗病作用。

在白菜和芥菜籽粕的生物熏蒸過程中，滅生作用以及慢性曲霉和毛殼菌屬下物種OTU_213的富集可能共同促進(jìn)了根際微生物中病原功能菌的減少，從而降低了作物的發(fā)病率。但兩種籽粕在土壤中水解次級產(chǎn)物和養(yǎng)分含量的不同，可能造成了它們具體抑菌效果和群落結(jié)構(gòu)的差異[11]。而相較于不同籽粕類型間的差異，不同熏蒸材料棉隆與籽粕處理間的差異更為明顯，且單一成分的化學(xué)熏蒸劑棉隆在根際對病原菌的抑制和有益微生物的富集方面均不如籽粕，對整體微生物群落結(jié)構(gòu)的改變主要集中在前期熏蒸的環(huán)節(jié)，在后期微生物群落的恢復(fù)以及有益微生物群落的構(gòu)建方面并沒有起到明顯的幫助作用，因此棉隆的化學(xué)熏蒸抑病效果可能沒有籽粕持久，不能像籽粕一樣形成生物屏障抑制土壤病原菌的定殖和二次侵染[23]。此外，棉隆廣譜的殺菌性會降低非靶向微生物活性和數(shù)量，并不利于改善土壤生產(chǎn)力[24-25]，也不利于農(nóng)業(yè)生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展。

4 結(jié)論

白菜型和芥菜型籽粕處理土壤能夠?qū)芄贤羵鞑『ζ鸬斤@著的防治作用，雖然防治效果與棉隆處理相似，但在對微生物群落動(dòng)態(tài)變化的影響上有明顯差異，且在后期根際微生物富集方面，兩種籽粕處理減少植物病原菌群定殖的同時(shí)產(chǎn)生了可抑制病原菌的有益微生物。整體上，兩種籽粕通過對特定土著微生物的滅殺、恢復(fù)和富集過程，實(shí)現(xiàn)了對根際有益微生物的篩選，起到了對哈密瓜病害的防控作用，是一種較傳統(tǒng)熏蒸劑更為綠色科學(xué)的病害防控材料。