水稻抗紋枯病接種鑒定方法評(píng)價(jià)

賀 宏，黎瑞瑩，劉傳佳，陳佳琪，歐陽(yáng)林娟，李煒星，賀浩華，朱昌蘭，孫曉棠

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045）

【研究意義】水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染引起的一種世界性水稻病害[1]。培育和種植抗病水稻品種是防治水稻紋枯病最經(jīng)濟(jì)有效的措施之一，而抗源的鑒定篩選與評(píng)價(jià)又是選育抗病良種的前提和關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】水稻紋枯病的抗性鑒定易受環(huán)境中溫度、濕度及水稻株高和生育期等的影響[2-7]。近年來(lái)，紋枯病的接種鑒定在國(guó)內(nèi)外已得到廣泛研究，研發(fā)了多種鑒定方法[8-13]。國(guó)內(nèi)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“三大作物紋枯病綜合防控技術(shù)研究與示范”推薦了2種接種鑒定方法，2007）[9,13]:苗期霧室法和成株期田間嵌入法；Jia等[10]在riceprotocols書中推薦了5種，包括離體葉片法、苗期微室法、苗期Parafilm小袋法、成株期霧室法和成株期鋁箔包裹法。在實(shí)際應(yīng)用中，國(guó)內(nèi)主要采用田間成株期嵌入法[2,14-22]；國(guó)外則主要采用田間成株期谷殼散布法[3,18,23-24]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同學(xué)者在水稻抗紋枯病鑒定和遺傳研究中采用不同的接種鑒定方法，這不僅不利于不同研究結(jié)果間的橫向比較，也降低育種界對(duì)這些研究結(jié)果的認(rèn)同度。本研究以已知抗、感差異明顯的8個(gè)水稻品種為試驗(yàn)材料，綜合評(píng)價(jià)了前人研發(fā)的8種水稻抗紋枯病接種鑒定方法，旨在確定最為簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確、客觀的抗紋枯病鑒定技術(shù)方法，為抗病種質(zhì)資源挖掘和抗病遺傳育種研究提供依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】水稻紋枯病的抗性鑒定易受環(huán)境溫度、濕度及水稻株高和生育期等的影響，篩選適宜大規(guī)模水稻抗性鑒定和遺傳分析的接種鑒定方法至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

已知對(duì)紋枯病抗、感差異明顯的8個(gè)水稻品種用于抗紋枯病接種鑒定方法的評(píng)價(jià)。其中C418、Jas‐mine85、特青和明恢63屬于公認(rèn)的相對(duì)抗紋枯病的品種[25-26]，武育粳3號(hào)、日本晴、珍汕97、Lemont為相對(duì)感病的品種[13-14,25,27]?？剐约?jí)別由高到低依次為C418、Jasmine85、特青、武育粳3號(hào)和Lemont[28]。

供試水稻紋枯病菌為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）AG-1-IA菌株GD118，屬?gòu)?qiáng)致病力菌株[28]，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 接種物的培養(yǎng)

在無(wú)菌條件下，將紋枯病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，倒置放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿白色菌絲后備用。

帶菌0.8 mm牙簽[9]:將木質(zhì)牙簽剪成0.8～1.0 cm長(zhǎng)，均勻地鋪在培養(yǎng)皿底部，加入適量PDA培養(yǎng)液，液面高度剛好淹沒牙簽，滅菌后接種新鮮接種體，培養(yǎng)5～7 d，待菌絲密集地布滿培養(yǎng)基時(shí)用于接種。

帶菌稻谷[28]:將稻谷、稻殼按1∶2混合后放在盆里加清水浸泡1～2 d，每天早、中、晚3次更換清水后，分裝到組培瓶中，稻谷裝量為組培瓶的1∕2～2∕3，121 ℃滅菌2 h，滅菌3次。接菌后光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d后備用。

1.3 接種鑒定方法

1.3.1 離體葉片法 按Jia等[10]方法，在水稻分蘗末期，每個(gè)品種取4株水稻，剪倒2葉中間段16 cm長(zhǎng)置托盤中，托盤內(nèi)放置用無(wú)菌水浸潤(rùn)的濾紙。將直徑7 mm的新鮮菌絲塊放在葉片背軸面中部附近，24 ℃保濕培養(yǎng)。72 h后進(jìn)行病情調(diào)查，測(cè)量最遠(yuǎn)病斑間的長(zhǎng)度（cm）。

1.3.2 苗期微室法 水稻種子浸種催芽后，選擇芽長(zhǎng)一致的種子點(diǎn)播到直徑13 cm的塑料盆中。待各大部分秧苗長(zhǎng)至2～3葉時(shí)，間苗保留3株。參考Jia等[10]方法，控制溫室溫度約為28 ℃，濕度為90%左右，接種后5～7 d，以測(cè)量的病斑高度（LH），最高病斑高度到土壤表面的距離）與植株高度（pH），植株最高處到土壤表面的距離）作為病情指標(biāo)，計(jì)算相對(duì)病級(jí)（DR）=（病斑高度∕株高）×9級(jí)[29]，用DR表示植株發(fā)病情況，每個(gè)編號(hào)測(cè)量3～5株，以4次生物學(xué)重復(fù)的平均值代表該株系的抗病水平。

1.3.3 苗期霧室法 參考王子斌等[13]方法，于水稻4～5葉期接種，將接種稻苗移入霧室。接種后5～7 d，將育苗盤搬出霧室以阻止病情進(jìn)一步的發(fā)展并進(jìn)行病情調(diào)查。以3個(gè)單株的發(fā)病狀況的平均值代表該株系的抗病性，最終以3次生物學(xué)重復(fù)的平均值代表該株系的抗病水平。其余同1.3.2。

1.3.4 苗期Parafilm小袋法 水稻種子浸種催芽播種方法同1.3.2。按Jia等[10]方法，于水稻4～5葉期，將直徑7 mm的新鮮菌絲塊嵌入封口膜做成的10 cm×2.5 cm的小袋內(nèi)，圍在倒2葉葉片中間。接種7～10 d后測(cè)量病斑長(zhǎng)度（cm），以3株4次重復(fù)的平均值代表該株系的抗病水平。

1.3.5 成株期嵌入法 試驗(yàn)在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行，2年重復(fù)試驗(yàn)。每年5月15日播種，6月15日移栽，單本栽插。按22.5 cm×12.0 cm規(guī)格栽插，每品種分別栽植3行，每行10株，隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。小區(qū)四周種植保護(hù)行2行，按常規(guī)管理，不專門針對(duì)病害施殺菌劑。參考Zuo等[14]方法，在水稻分蘗末期，7月15日）用鑷子將8 mm帶菌牙簽嵌入倒3葉葉鞘內(nèi)側(cè)，此時(shí)該葉鞘不再伸長(zhǎng)，接種后葉鞘抱莖狀態(tài)基本未被改變。每品種接種中間一行的中間3株，每株接種3個(gè)主分蘗。始穗后30 d，進(jìn)行病情調(diào)查。將接種單株中發(fā)病最嚴(yán)重的分蘗齊地割斷，將每個(gè)株系的3個(gè)單株收集編號(hào)。按修改的Rush病級(jí)[9]，以3個(gè)分蘗的發(fā)病平均值代表該株系的抗性級(jí)別，最終以3個(gè)田間重復(fù)的平均值代表該株系的抗病水平。

1.3.6 成株期谷殼散布法 試驗(yàn)在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行，于水稻分蘗末期，在每個(gè)單株的分蘗基部放置約5 g帶菌稻谷，每品種接種中間一行的中間5株。其余同1.3.5。

1.3.7 成株期霧室法 試驗(yàn)在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地控溫室進(jìn)行。水稻苗移栽于直徑13 cm的塑料盆中，每品種5盆，每盆1株，置網(wǎng)室水池培養(yǎng)。接種前1天搬入控溫室中的霧室，霧室與苗期霧室相同，但高為2 m。按Jia等[10]方法，在水稻分蘗末期將直徑7 mm的新鮮菌絲塊貼于植株主分蘗基部，每株接種3個(gè)主分蘗?？刂旗F室內(nèi)溫度約為28 ℃，濕度為80%～90%。10 d后移出溫室，繼續(xù)在網(wǎng)室的水池中生長(zhǎng)5 d后，再移回到霧室內(nèi)保濕10 d后，進(jìn)行病情調(diào)查。其余同1.3.5。

1.3.8 成株期鋁箔包裹法 參考Park等[11]方法，在水稻分蘗末期將5 mm菌絲球嵌入倒3葉葉鞘內(nèi)側(cè)，接種后馬上用鋁箔紙包裹接種部位，每品種每株接種3個(gè)分蘗，共3株。溫度控制在28 ℃左右，濕度90%左右。3 d后拆除鋁箔，約18 d后待感病對(duì)照Lemont大多數(shù)植株感病時(shí)進(jìn)行病情調(diào)查。其余同1.3.5（圖1）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS19進(jìn)行各品種病級(jí)差異顯著性單因素方差分析和LSD法多重比較。

1.5 抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

水稻品種抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照陳夕軍等[28]的方法劃分，分為高抗（HR，DR≤1.5）、抗病（R，1.6＜DR≤3.0）、中抗（MR，3.1＜DR≤4.5）、中感（MS，4.6＜DR≤6.0）、感?。⊿，6＜DR≤7.5）、高感（HS，DR≥7.6），6個(gè)等級(jí)。

圖1 水稻抗紋枯病鑒定的不同接種方法Fig.1 Different inoculation methods for identification of rice resistance to Sheath blight

2 結(jié)果與分析

2.1 接種后已知抗、感品種發(fā)病嚴(yán)重度

采用8種不同水稻抗紋枯病鑒定方法對(duì)8個(gè)已知抗、感紋枯病的水稻品種進(jìn)行接種鑒定，發(fā)病情況見表1。由表1可知，各方法均能使所有水稻品種發(fā)病，但發(fā)病程度有較大差異，其中成株期田間谷殼散布法相對(duì)于其它方法發(fā)病較輕，平均病級(jí)為4.2，其它方法均達(dá)到5.0以上。

8種方法接種目前最常見的抗、感紋枯病對(duì)照品種Jasmine85和Lemont后，兩者的病級(jí)差異都達(dá)到顯著水平，但對(duì)其它6個(gè)已知抗、感水稻品種感病結(jié)果不一致。其中苗期微室法、苗期霧室法、成株期田間嵌入法、成株期霧室法和成株期鋁箔包裹法接種后抗、感品種發(fā)病程度存在顯著差異，能有效將抗病和感病品種區(qū)分開。而成株期田間谷殼散布法、離體葉片法和苗期Parafilm小袋法對(duì)大部分抗病和感病品種不存在顯著差異，不能有效區(qū)分抗、感品種（圖2）。

圖2 不同接種鑒定方法水稻品種感紋枯病抗性狀況Fig.2 Resistance to Sheath blight of rice varieties with different inoculation methods

2.2 不同鑒定方法的相關(guān)性分析

苗期微室法、苗期霧室法、成株期田間谷殼散布法、成株期田間嵌入法、成株期霧室法和成株期鋁箔包裹法之間的相關(guān)性都達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），離體葉片法和苗期Parafilm小袋法之間具有極顯著的相關(guān)性，但和其它6種接種方法幾乎不具有顯著的相關(guān)性（表2）。

2.3 不同接種鑒定方法的綜合評(píng)價(jià)

水稻紋枯病主要是葉鞘病害，離體葉片法雖然操作簡(jiǎn)單，但基于葉片部位接種的離體葉片法和Para‐film小袋法與其它6種接種方法都不具顯著相關(guān)性，這2種方法不能真正的反應(yīng)抗、感對(duì)照品種對(duì)紋枯病的抗性。因此，離體葉片法和Parafilm小袋法不適合水稻紋枯病的抗性鑒定。成株期谷殼散布法操作粗放，發(fā)病不一致且重復(fù)性較差，只適合前期大規(guī)模材料或品種抗病的初步篩選，但不適合表型鑒定等要求準(zhǔn)確量化的抗病QTL定位研究。成株期霧室法和成株期鋁箔包裹法雖然表型鑒定較準(zhǔn)確，但操作繁瑣，需要精確的控溫、控濕和光照設(shè)備，因此也不適合大量材料或品種的表型抗性鑒定。

通過綜合評(píng)價(jià)認(rèn)為，苗期微室法、苗期霧室法、成株期田間嵌入法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，接種后已知抗、感品種的感病程度差異顯著，與多數(shù)方法具有顯著相關(guān)性，適合大規(guī)模抗性篩選鑒定。建議可以采用苗期微室法或苗期霧室法進(jìn)行抗病品種初篩，然后結(jié)合多次重復(fù)的成株期田間嵌入法進(jìn)行復(fù)篩，對(duì)少量材料可以采用成株期霧室法或成株期鋁箔包裹法最終確定材料抗性水平。

表1 8種接種方法處理后不同抗性水稻品種紋枯病發(fā)生相對(duì)病級(jí)（DR）Tab.1 The relative disease grade（DR）of sheath blight of rice varieties with different resistance after eight inoculation methods

表2 8種接種鑒定方法之間的相關(guān)性Tab.2 Correlation of eight different methods for the fungal inoculation and disease evaluation

3 討論與結(jié)論

水稻紋枯病已經(jīng)上升為我國(guó)水稻生產(chǎn)的主要病害，盡管全世界對(duì)水稻抗紋枯病的鑒定、研究已達(dá)十幾萬(wàn)份材料，但至今未發(fā)現(xiàn)高抗或免疫品種。近幾年，國(guó)內(nèi)外圍繞紋枯病的接種鑒定進(jìn)行了廣泛研究，先后提出成株期谷殼散布法、成株期注射法、成株期嵌入法、成株期霧室法、苗期霧室法、苗期微室法、成株期鋁箔包裹法、苗期Parafilm小袋法和離體葉片法等。其中一些方法操作簡(jiǎn)易，如谷殼散布法操作粗放，發(fā)病不一致，重復(fù)性較差；成株期嵌入法最早由揚(yáng)州大學(xué)潘學(xué)彪教授課題組提出，目前已被成功應(yīng)用于水稻抗病QTL定位的群體抗性鑒定中。本研究也證明該方法可使植株充分發(fā)病，試驗(yàn)具有較好的重演性和可靠性。然而，成株期抗性鑒定易受環(huán)境（溫濕度、光照等）、株高和水稻生育期等的影響，需要多年重復(fù)鑒定，且較精確的嵌入法接種鑒定工作量大，難以應(yīng)用于勞動(dòng)力昂貴地區(qū)的大規(guī)模接種鑒定試驗(yàn)。近幾年提出的成株期霧室法和成株期鋁箔包裹法雖然可以有效的控制環(huán)境溫度和濕度，但操作較為繁瑣，不適于大規(guī)模的接種鑒定試驗(yàn)。

為了彌補(bǔ)成株期抗性鑒定工作量大、易受環(huán)境溫度和濕度影響等缺陷，研究者嘗試過多種方法進(jìn)行水稻抗紋枯病鑒定。離體葉片法便是其中一種[10]，但水稻紋枯病主要是葉鞘病害，葉片的抗性不可能完全代表葉鞘的抗性。此外，器官離體后會(huì)激發(fā)一系列反應(yīng)，防衛(wèi)系統(tǒng)可能會(huì)被啟動(dòng)，代謝處于紊亂狀態(tài)。因此，離體葉片法雖然操作簡(jiǎn)單，但抗性鑒定的結(jié)果參考價(jià)值有限。本研究也發(fā)現(xiàn)離體葉片與基于葉片接種的苗期Parafilm小袋法[10]具有相關(guān)性外，與其它接種方法都不具顯著相關(guān)性，且不能區(qū)分已知抗、感品種。

苗期抗性鑒定早期是將水稻幼苗置于接近飽和的濕度下進(jìn)行的，結(jié)果表明，菌絲體迅速包裹幼苗，導(dǎo)致幼苗腐爛死亡，據(jù)此認(rèn)為水稻對(duì)紋枯病不存在品種間抗性差異。也有研究者認(rèn)為，苗期抗性鑒定的結(jié)果與田間鑒定結(jié)果相關(guān)性低，最終放棄了苗期鑒定方法。2007年Jia等[12]提出了苗期微室接種鑒定方法，主要是采用2～3 L的透明塑料瓶，去除底部后罩在水稻幼苗上，創(chuàng)造一個(gè)適合水稻紋枯病菌生長(zhǎng)和侵染的“微室”環(huán)境。“微室”內(nèi)的相對(duì)空氣濕度在80%左右，能有效鑒別品種間抗性，目前這一新方法已廣泛用于水稻紋枯病抗病基因表達(dá)和QTL定位研究[18,31-32]。本研究結(jié)果也證明該方法能有效地降低環(huán)境和形態(tài)學(xué)因素的干擾影響，試驗(yàn)周期短，環(huán)境相對(duì)可控，結(jié)果具有較好的重復(fù)性和可靠性。苗期霧室接種鑒定法也是由潘學(xué)彪教授課題組提出[13]，通過調(diào)節(jié)霧室的高度和室內(nèi)溫度來(lái)維持霧室內(nèi)的濕度，構(gòu)建了一個(gè)相對(duì)較大的保濕環(huán)境，能有效的鑒別品種間抗性差異。無(wú)論是苗期微室法還是苗期霧室法，影響抗性鑒定準(zhǔn)確性的最重要因素是環(huán)境的濕度。溫度相對(duì)較好控制，26～32 ℃均能使紋枯病有效發(fā)病，但相對(duì)濕度較難控制，濕度在80%以下，所有品種發(fā)病較輕，抗、感品種差異較小；濕度達(dá)到95%以上，所有品種又統(tǒng)統(tǒng)嚴(yán)重發(fā)病，只有濕度在85%～90%，品種才能較好的表現(xiàn)出不同的抗性。從濕度控制來(lái)說，微室法相比霧室法較易控制，微室法本身創(chuàng)造了一個(gè)小環(huán)境，外界環(huán)境對(duì)其影響較小。本研究進(jìn)行霧室法接種時(shí)，濕度很難準(zhǔn)確控制在85%～90%，經(jīng)過多次調(diào)整霧室高度最終才能達(dá)到濕度要求。但是，一旦材料高度或密度變化，霧室的高度又需重新調(diào)整，濕度控制在85%左右是苗期接種鑒定方法成功的關(guān)健。

雖然水稻紋枯病苗期接種鑒定方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果具有重復(fù)性，但不能取代田間成株期抗性鑒定。因?yàn)椴煌痉N子發(fā)芽、出苗及苗期生長(zhǎng)勢(shì)可能不同，這些因素導(dǎo)致的差異在苗期對(duì)鑒定結(jié)果可能具有明顯的影響，長(zhǎng)勢(shì)好的水稻苗相對(duì)抗病，而弱苗相對(duì)感病，造成抗性結(jié)果的誤判。但隨著植株的生長(zhǎng)，這些影響在成株期會(huì)減小或忽略不計(jì)。此外，有些品種苗期和成株期抗性可能并不一致。因此，苗期鑒定結(jié)果需要在成株期進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證。

本研究以已知抗、感差異明顯的8個(gè)水稻品種為試驗(yàn)材料，綜合評(píng)價(jià)了離體葉片法、苗期微室法、苗期霧室法、苗期Parafilm小袋法、成株期谷殼散布法、成株期田間嵌入法、成株期霧室法和成株期鋁箔包裹法，8種水稻抗紋枯病接種鑒定方法。其中苗期微室法、苗期霧室法和成株期田間嵌入法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，接種后已知抗感、品種抗性差異顯著，品種抗、感趨勢(shì)基本一致，且3種方法之間的相關(guān)性均達(dá)極顯著水平，適宜大規(guī)模水稻品種的抗性篩選鑒定。