循環(huán)腫瘤DNA在腦膠質瘤中的研究進展

孫新新 綜述 顧明亮 審校

癌癥的基因組特征對于早期診斷、選擇治療和預后評估至關重要。目前，癌癥的治療已由基于“統(tǒng)一方案”的指導逐步轉向“個性化治療”的新范式，即根據特定的生物分子標記物為每位患者“量體裁衣”制定最優(yōu)化的治療方案。傳統(tǒng)上，通過外科手術或組織活檢可獲得用于腫瘤基因組分析的DNA。然而，此方法獲得的僅是腫瘤在特定時間和空間的有限信息，無法反映其隨時間變化的動態(tài)演化和異質性［1］。近年來，液體活檢作為體外診斷的一個分支，在腦膠質瘤的診斷和監(jiān)測方面得到廣泛應用［2-3］。液體活檢是指通過檢測血液、尿液和腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）等體液中的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤RNA（circulating tumor RNA，ctRNA）、microRNA、蛋白質和微囊（如外泌體），對腫瘤等疾病做出診斷［4］。該方法通過對生物體液中的腫瘤細胞或核苷酸實時取樣，為腫瘤監(jiān)測提供一種侵襲性小、克服重復采樣限制和方便快捷的檢測手段。本文就腦膠質瘤分子標志物、ctDNA檢測方法和研究進展進行綜述。

1 腦膠質瘤的分子標志物

腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，占中樞神經系統(tǒng)惡性腫瘤的80%，在神經系統(tǒng)腫瘤中約占27%，5年死亡率在腫瘤死因順位中居第3位，僅次于胰腺癌和肺癌［5］。2016年世界衛(wèi)生組織（WHO）對腦膠質瘤的分類進行了重大更新，在組織學診斷基礎上附加了一些分子病理學特征。分子生物學標志物對確定分子亞型和進行個體化治療及臨床預后判斷具有重要意義［6］。

70%～80%的低級別腦膠質瘤和大多數(shù)繼發(fā)性膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）發(fā)生IDH 突變。IDH1/2 突變后酶活性發(fā)生改變，將α-酮戊二酸（αketoglutaricacid，α-KG）還原成羥戊二酸［R（2）-2-hydroxyglutarate，2-HG］，導致2-HG 累積。2-HG 的過量產生抑制組蛋白和DNA 去甲基酶活性，導致組蛋白和DNA高甲基化，引起表觀遺傳調控的異常，進而阻礙細胞分化。高濃度的2-HG 也通過抑制脯氨酰羥化酶而避免低氧誘導因子降解，促進細胞對缺氧環(huán)境的適應性，進而促進腫瘤的生長［7］。IDH基因突變時常伴隨1p/19q 聯(lián)合缺失，具有該聯(lián)合缺失的患者預后良好，對PCV（丙卡嗪、洛莫司汀、長春新堿）和替莫唑胺（temozolomide，TMZ）的應答均有改善，因此其為化療反應的一個標志物，但這種聯(lián)合缺失導致的化學敏感性機制仍不清楚［8-9］。MGMT 編碼一種DNA 錯配修復蛋白，該蛋白將腫瘤細胞鳥嘌呤O6位點的甲基轉移至自身的半胱氨酸殘基上，修復受損的鳥嘌呤核苷酸，而MGMT 啟動子特異性CpG 位點的甲基化使MGMT 基因沉默，導致DNA 烷基化修復無效，增強對烷基化療藥物（如TMZ 和洛莫司汀等）的應答［10-11］。MGMT 啟動子甲基化可將使用烷基藥物治療患者的無進展生存期和總生存期延長，因此MGMT 啟動子的甲基化水平可以作為一種預后標志物［10］。EGFR編碼酪氨酸激酶，在GBM患者中較為活躍或過度表達，50%～60%的GBM患者出現(xiàn)EGFR過度表達，30%的GBM 患者EGFRvⅢ發(fā)生突變，EGFR過度表達可導致一些對腫瘤形成至關重要的信號通路的激活，如MPAK和PI3K/AKT，促進腫瘤的生長［12］。

腫瘤細胞通過重新激活端粒酶或端粒選擇性延長來維持其端粒長度。在腦膠質瘤中，TERT啟動子突變導致端粒酶活性增加［13］。在90%的IDH突變型和1p/19q聯(lián)合缺失的少突膠質細胞瘤及80%的IDH野生型GBM中檢測到TERT啟動子突變［14］。ATRX基因編碼的染色質重構蛋白H3.3是整合至端粒中所需要的染色質重構復合物的核心成分，ATRX突變與端粒選擇性延長關系密切相關［15］。彌漫性中線膠質瘤（diffuse midline gliomas，DMG）是一種惡性程度極高的丘腦或腦干膠質瘤，通常發(fā)生于兒童，不能完全切除，臨床預后極差［16］。HIST1H3和H3F3A基因編碼的H3.1K27M和H3.3K27M變異是DMG 最常見的變異，其次是H3F3A 基因編碼的H3.3G34V/R變異［17］。H3變異抑制多梳抑制復合物活性，導致H3在K27位點的三甲基化下降以及腫瘤抑制因子（如p16INK4a）的表觀遺傳異常［18］。

上述分子標志物明顯影響腦膠質瘤的增殖、轉移和侵襲等，進而促進腦膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展，通過對分子標志物的研究不僅有助于進一步全面了解膠質瘤的分子生物學特征，更有利于對腦膠質瘤的精準治療，對臨床應用具有深遠的意義。

2 ctDNA概述

2.1 ctDNA簡介

細胞游離DNA（cell free DNA，cfDNA）是由壞死或凋亡細胞釋放的短片段（通常為130～180 bp）雙鏈DNA，存在于血液和其他體液中［19］。ctDNA由腫瘤細胞通過凋亡、壞死或直接分泌的方式釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，也可能由CTC、轉移灶的腫瘤細胞釋放至循環(huán)系統(tǒng)，其攜帶的分子遺傳學改變與腫瘤細胞具有高度一致性［20］。ctDNA占cfDNA很小的比例，該比例根據疾病負擔、部位和腫瘤生物特征（包括組織學、血管化、增殖和凋亡率）而變化［21］。ctDNA 的半衰期相對較短（小于2 h），利用ctDNA 分析實時監(jiān)測腫瘤反應成為可能［4］。ctDNA不僅易于識別，而且能實時反映腫瘤負荷和最新動態(tài)信息。ctDNA 的應用包括分子診斷、檢測腫瘤反應、發(fā)現(xiàn)微小殘留病灶復發(fā)、跟蹤復發(fā)時縱向基因組演（進）化、指導患者靶向治療、發(fā)現(xiàn)耐藥基因等［22］。

2.2 ctDNA檢測方法

在循環(huán)系統(tǒng)中ctDNA的數(shù)量極少，僅占cfDNA的0.01%～1%，因此ctDNA檢測極具挑戰(zhàn)性，技術要求靈敏度高。近年來ctDNA的檢測策略日趨成熟和完善，根據所依賴的技術平臺，ctDNA檢測方法大致可以分為PCR的技術方法與基于二代測序（next generation sequencing，NGS）的技術方法。這兩類技術包括基于PCR（PCRbased）技術、數(shù)字PCR以及靶向深度測序3個方面，常用的研究方法見表1。

表1 ctDNA檢測常用的檢測方法

表1 ctDNA檢測常用的檢測方法（續(xù)表1）

3 腦膠質瘤與ctDNA

腫瘤的基因組特征對于腫瘤的早期診斷和治療至關重要。因腦膠質瘤的浸潤特征及其敏感的神經解剖學位置，手術風險較高，患者及家屬多不能接受多次手術或開放活檢，在臨床上應用限制性較大［32］。取樣的限制和侵入性危害，通過單一位置的組織無法捕獲瘤內異質性，因此傳統(tǒng)的活檢方法具有較大的局限性。腫瘤切除或活檢通常是在診斷或復發(fā)時進行，而不能在整個疾病過程和治療過程中隨時實施，對腫瘤的縱向監(jiān)測和評估也是一個挑戰(zhàn)［33］。而ctDNA檢測可通過循環(huán)系統(tǒng)采集樣本，無需手術或開放活檢，創(chuàng)傷性較小、允許重復采樣，并可反映腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的時空異質性，因此ctDNA檢測是可靠的腦膠質瘤液體活檢策略。與其他實體腫瘤相比，由于血腦屏障限制了ctDNA進入循環(huán)系統(tǒng)的運輸，大幅降低患者血液中ctDNA濃度，利用液體活檢診斷和監(jiān)測中樞神經系統(tǒng)腫瘤的病情變化依然具有挑戰(zhàn)性［34］。CSF可以與中樞神經系統(tǒng)腫瘤細胞密切接觸，并攜帶腫瘤所釋放的細胞或者核酸，其液體活檢相對于傳統(tǒng)活檢而言，更適合進行中樞神經系統(tǒng)腫瘤的診治［35］。目前ctDNA檢測已經應用于多項腦膠質瘤研究。

3.1 ctDNA在腦膠質瘤患者早期診斷中的應用

由于組織活檢受限于腫瘤的可及性和腫瘤細胞的異質性，ctDNA檢測對于腫瘤的早期診斷和治療具有重要意義。Huang等［3］通過Sanger測序和巢式PCR分析了11例兒童腦瘤患者CSF ctDNA的H3F3A和HIST1H3B突變情況，發(fā)現(xiàn)6例DMG患者中的4例發(fā)生H3.3K27M變異，1例幕上膠質母細胞瘤患者的ctDNA發(fā)生H3.3G34V變異。利用配對的腫瘤組織標本進行Sanger測序或免疫組織化學驗證，發(fā)現(xiàn)ctDNA H3.3在DMG患者中的檢測具有100%的特異性和87.5%的靈敏度，該研究表明對于DMG患者可以考慮收集CSF，分析ctDNA H3.3的突變情況用于診斷，并有可能在不需要腫瘤組織的情況下進行分子分型，以開展分子導向的癌癥治療。Martínez-Ricarte等［32］通過靶向全外顯子測序和ddPCR技術分析了20個彌漫性膠質細胞瘤患者CSF ctDNA的7個基因（IDH1、IDH2、TP53、ATRX、TERTp、H3F3A和HIST1H3B）的突變情況，將彌漫性膠質瘤分為IDH野生型GBM、IDH突變型GBM/彌漫性星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤和彌漫性中線膠質瘤4個亞型。禹金良等［36］利用NGS方法分析了12例腦膠質瘤患者的CSF標本和腫瘤間質液標本的ctDNA，發(fā)現(xiàn)TP53、EGFR或SETD2基因突變，分子水平較影像學發(fā)現(xiàn)復發(fā)時間平均提前2.9個月，同時多個突變基因匹配到靶向潛在獲益藥物或潛在耐藥藥物。Piccioni等［37］利用NGS Panel分析了370例星形膠質細胞瘤和少突膠質細胞瘤的ctDNA，發(fā)現(xiàn)ctDNA突變頻率隨著膠質瘤級別的增加而增加，其中Ⅰ級20%、Ⅱ級28%、Ⅲ級40%和Ⅳ級55%，表明對于低級別腫瘤ctDNA的改變僅在較少部分患者中發(fā)現(xiàn)，因此單純的ctDNA分析可能不足以有效診斷腫瘤的早期階段，需要與影像技術相結合。

3.2 ctDNA可作為腫瘤突變負荷的指標

ctDNA變化有助于判斷腫瘤負荷，Mattos-Arruda等［38］對CSF中的ctDNA數(shù)量是否會隨著時間而變化展開研究，進而通過這種變化了解腦腫瘤的進展。其研究中收集6例GBM、轉移性乳腺癌和肺癌腦轉移患者治療前、治療期間、病情進展或尸檢時的CSF和血漿樣本，發(fā)現(xiàn)所有CSF ctDNA的等位基因突變頻率（mutant allelic frequency，MAF）均高于血漿，并且CSF ctDNA的MAF隨著手術切除和（或）系統(tǒng)治療而降低，隨著腫瘤的惡化而升高。MAFs隨著時間的變化，與腦腫瘤負荷的變化趨勢相同。Panditharatna等［2］收集了48例兒童DMG患者治療前以及治療期間每次MRI檢查時的血液標本和治療前、治療期間或尸檢時的CSF樣本，在88%患者的血漿和CSF ctDNA中檢測到了H3K27M變異。對其中14例兒童彌漫性內生型橋腦膠質瘤患者在放療前后進行了血漿ctDNA含量監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)血漿ctDNA H3K27M的MAF減少≥50%與MRI測定的腫瘤體積減少≥10%之間存在75%的一致性，表明放療后腫瘤負荷顯著下降?？梢姡珻SF和血漿ctDNA可作為腫瘤突變負荷檢測的指標。

3.3 ctDNA可作為對療效實時監(jiān)測的指標

ctDNA檢測可用于監(jiān)測化療、放療等治療手段的治療反應效果。Pentsova 等［39］利用MSK-IMPACT 技術分別在63%的實體瘤腦轉移患者和50%的原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)腫瘤患者中檢測到相關基因突變，在33%接受靶向治療的實體瘤腦轉移患者的CSF ctDNA 中檢測到多種耐藥突變，如EGFR T790M、KRAS G12A等。其中1例肺癌腦轉移患者在治療前的肺癌組織檢測到EGFR L858R突變，厄洛替尼治療44個月后出現(xiàn)腦轉移病情進展，在CSF ctDNA 中檢測到KRAS G12A突變，該突變是EGFR TKI抑制劑的耐藥突變。激酶抑制劑在中樞神經系統(tǒng)的耐藥機制尚不明確，普遍認為是藥物滲透不足引起的。對于小部分中樞神經系統(tǒng)獲得性激酶抑制劑耐藥的患者可以增加藥物劑量或鞘內給藥，以克服藥物滲入中樞神經系統(tǒng)的減少。Miller 等［40］發(fā)現(xiàn)1 例GBM 患者的原始腫瘤DNA 存在高水平的EGFR 擴增和EGFR 錯義突變，而RT/TMZ 治療6 個月病情進展，隨后TMZ/BEV（bevacizumab）治療12 個月復發(fā)時收集CSF，分析發(fā)現(xiàn)CSF ctDNA出現(xiàn)PDGFRA的突變，未發(fā)現(xiàn)原來的GBM 中EGFR 突變；另1 例GBM 患者最初的腫瘤DNA發(fā)生PIK3CA（E545K）突變，而TMZ治療18個月病情進展時的腫瘤組織活檢顯示MET和PDGFRA突變，隨后BEV聯(lián)合輔助治療9個月的CSF ctDNA保留MET 突變并獲得MYC 突變而未發(fā)現(xiàn)PDGFRA 突變。隨著腫瘤組織和腦脊液收集時間間隔的增加，基因圖譜的差異更大，特別是EGFR 通路，這遵循了一種趨同進化的模式，后續(xù)采集的樣本顯示了同一基因或相關信號通路中的其他基因突變，可能導致耐藥性的產生。綜上所述，ctDNA可以作為一種評估腫瘤治療反應的有效方法，用于監(jiān)測腫瘤進展和治療效果。

3.4 ctDNA分析有利于反映腫瘤細胞的異質性

組織活檢可能僅代表被切除部分的腫瘤特征。ctDNA來源于不同部位的腫瘤細胞，ctDNA可以更全面反映腫瘤基因圖譜，再現(xiàn)腫瘤細胞空間和時間異質性［1］。Pan等［41］設計了針對腦腫瘤Panel，對腦干膠質瘤患者CSF 中的ctDNA 進行捕獲后的深度測序，97.3%CSF ctDNA中檢測出腫瘤組織的至少1個突變信息，其中CSF和腫瘤組織突變信息有50%以上的重復一致性達91.9%，完全一致的比例高達83%。CSF ctDNA具有極高的檢測靈敏度，6.4%患者的CSF ctDNA 中發(fā)現(xiàn)了腫瘤組織DNA 無法檢出的突變，如NF1、KIT 和EGFR 突變。Zhao 等［42］比較分析了17 例腦膠質瘤患者的腫瘤組織DNA和CSF ctDNA 的基因變異，研究發(fā)現(xiàn)兩者的基因變異具有高度一致性，而且發(fā)現(xiàn)了16 個僅存在于CSF ctDNA 的基因突變，如ATM、MLH1、SMARCB1、NRAS、CDH1、CDKN2A 等。CSF ctDNA可以克服單一位點取材的局限性，可更加全面地反映腫瘤細胞的異質性。

4 結語

ctDNA作為一種操作簡單、侵害性小和易于動態(tài)監(jiān)測的腫瘤標志物已越來越多地應用于臨床，在腦膠質瘤早期診斷、監(jiān)測治療反應、發(fā)現(xiàn)早期復發(fā)和跟蹤復發(fā)時的縱向基因組演（進）化以及指導患者靶向治療有著巨大的應用潛力。但DNA 含量少，對檢測方法的敏感性和特異性要求高，同時ctDNA檢測缺少統(tǒng)一的標準。此外，目前大多數(shù)隊列研究采用的是回顧性設計，缺少大樣本、前瞻性臨床研究數(shù)據支持，限制了其在臨床的廣泛應用。將來隨著技術方法的不斷改進創(chuàng)新，臨床研究的不斷深入，ctDNA 有望廣泛應用于腦膠質瘤的臨床診療。