貓爪草多糖抗炎作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

朱輝

摘?要：目的：考察不同濃度貓爪草多糖（PRRT）對(duì)早、中、晚期炎癥模型的影響，探索其抗炎機(jī)制方法：將小鼠和大鼠隨機(jī)各分為陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組和PRRT低、中、高劑量組，每組10只。采用二甲苯致耳廓腫脹、醋酸誘發(fā)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高，蛋清致大鼠背部氣囊滑膜炎、棉球誘發(fā)小鼠肉芽腫，探討PRRT的抗炎作用。稱體質(zhì)量測(cè)定各組小鼠耳的炎癥腫脹程度及肉芽增生水平，用化學(xué)方法檢測(cè)各組小鼠腹腔洗滌液中的伊文思藍(lán)含量、滑膜炎滲出液容積、滲出液中的白細(xì)胞（WBC）計(jì)數(shù)和腫瘤壞死因子（TNF）a含量，滲出液和血清中超氧化物歧化酶（S0D）、丙二醛（MDA）含量。結(jié)果：PRRT組分的高劑量組與陰性對(duì)照組相比，可顯著抑制小鼠耳腫脹、降低毛細(xì)血管通透性及肉芽組織增生。結(jié)論：PRRT能夠緩解早、中、晚期炎癥形成，其抗炎機(jī)制可能是PRRT可降低血清和滑膜炎滲出液中的MDA含量，提高SOD活性，進(jìn)而減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

關(guān)鍵詞：貓爪草多糖（PRRT）;腫瘤壞死因子（TNF）a含量;炎癥;超氧化物歧化酶;丙二醛（MDA）;白細(xì)胞計(jì)數(shù);小鼠

Abstract：Objective：To?observe?the?effects?of?different?concentrations?of?Polysaccharide?of?Radix?Ranunculi?Ternati（PRRT）on?inflammatory?models?in?different?stages?and?to?explore?its?possible?mechanism.Methods：Mice?and?rats?were?randomly?divided?into?negative?control?group，positive?control?group?and?PRRT?low，medium?and?high?dose?groups，with?10?rats?in?each?group.Ear?swelling?induced?by?xylene?and?abdominal?cavity?induced?by?acetic?acid?were?usedCapillary?permeability?increased，egg?white?induced?back?balloon?synovitis?in?rats，cotton?ball?induced?granuloma?in?mice，Antiinflammatory?effect?of?PRRT.The?body?weight?was?measured?to?determine?the?inflammatory?swelling?degree?and?granulation?proliferation?level?of?mice?ears?in?each?group.The?Evans?blue?content，synovitis?exudate?volume，white?blood?cell（WBC）count?and?tumor?necrosis?factor（TNF）a?content?in?peritoneal?washing?liquid，and?superoxide?in?exudate?and?serum?of?mice?in?each?group?were?detected?by?chemical?methods.Contents?of?superoxide?dismutase（SOD）and?malondialdehyde（MDA）.Results：Compared?with?the?negative?control?group，the?highdose?PRRT?group?significantly?inhibited?ear?swelling，decreased?capillary?permeability?and?granulation?tissue?proliferation?in?mice.Conclusion：PRRT?can?The?mechanism?may?be?that?PRRT?can?reduce?MDA?in?serum?and?synovitis?exudate?to?reduce?inflammation?formation?in?various?stages.Content，improve?SOD?activity，and?then?reduce?lipid?peroxidation?damage.

Keywords：Polysaccharide?of?Radix?Ranunculi?Ternati（PRRT）;tumor?necrosis;factoralpha;inflammatory;superoxide?dismutase;malondialdehyde;white?blood?cell?count;animal?mice

1?緒論

貓爪草（Radix?Ranunculi?Ternati）為毛莨科植物小毛莨（Ranunculus?Ternatus?Thunb）的塊根，1977年開(kāi)始收載于《中華人民共和國(guó)藥典》。貓爪草甘、辛、溫，入肝、肺經(jīng)，具有清熱解毒、散結(jié)消腫之功效，現(xiàn)安徽、河南、江西、浙江、四川、云南等地均有大量分布[13]。但由于宣傳力度不夠，很多專業(yè)人員及一些專家學(xué)者對(duì)貓爪草不甚了解，導(dǎo)致貓爪草開(kāi)發(fā)利用不夠。貓爪草的現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究起步很晚，目前少有的研究表明其具有如下作用：抗腫瘤[4]、抗菌作用[1]、調(diào)免疫[6]、抗氧化[7]。此外，貓爪草所含的黃酮苷對(duì)動(dòng)物有鎮(zhèn)咳、祛痰消炎作用;對(duì)中樞神經(jīng)、心臟、呼吸系統(tǒng)具有不同程度的抑制作用。

據(jù)報(bào)道，貓爪草的主要化學(xué)成分包括甾醇、內(nèi)酯、不飽和脂肪酸、多糖、微量元素等，而活性部位篩選試驗(yàn)表明多糖是其最重要活性成分之一。多糖是廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物細(xì)胞壁中的一種高分子聚合物，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一。多糖的藥用研究始于40年代，起初可作為廣泛的免疫促進(jìn)劑。經(jīng)過(guò)半個(gè)多世界的發(fā)展，多糖的研究取得了重大進(jìn)展。建立了多糖的提取純化、生物活性測(cè)定和結(jié)構(gòu)分析等一系列方法，研究的廣度和深度不斷加深。大量研究證實(shí)多糖具有多種活性：（1）多糖可通過(guò)激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫力，如香菇多糖能促進(jìn)特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的產(chǎn)生并提高其殺傷活力而提高機(jī)體免疫力;（2）多糖能通過(guò)激活巨噬細(xì)胞來(lái)提高抗腫瘤和抗病毒的能力，如人參多糖及靈芝多糖均可增加小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量;（3）多糖可通過(guò)激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)機(jī)體消滅病原體、排除異物和吞噬老化細(xì)胞的作用，如三七多糖、杜仲多糖及甘草多糖都能顯著增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的活性。此外，許多中藥及植物的多糖也表現(xiàn)出顯著的抗炎活性[812]。

炎癥（Inflammation）是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御反應(yīng)，主要表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙。全球約有數(shù)以億計(jì)的人遭受著炎癥的折磨，是全球性的無(wú)法治愈的病癥之一[13]。炎癥的病理變化目前尚不完全清楚，一般按病理過(guò)程可將其發(fā)展過(guò)程分為三個(gè)階段。早期出現(xiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加;中期表現(xiàn)為血小板吸附及白細(xì)胞游走;晚期則出現(xiàn)肉芽組織增生[14]。炎性介質(zhì)是參與炎癥反應(yīng)的化學(xué)活性物質(zhì)，包括趨化因子和細(xì)胞因子，均可與炎性細(xì)胞相互作用而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。腫瘤壞死因子（TNFα）、氧自由基等也在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮主要作用，目前對(duì)炎癥的治療主要包括非甾體類抗炎藥和腎上腺皮質(zhì)激素類，但存在諸多毒副作用，患者依從性小。因此，開(kāi)發(fā)新型抗炎藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。而多糖優(yōu)異的抗炎作用已引起了人們的關(guān)注。本文考察了貓爪草多糖（PRRT）其對(duì)早、中、晚期炎癥的影響，探討了其可能的抗炎作用機(jī)制，以期為多糖抗炎藥物的開(kāi)發(fā)提供參考和支持。

1.1?實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1?藥品

1.1.2?動(dòng)物

1.1.3?主要試劑

1.1.4?儀器

2?材料和方法

2.1?實(shí)驗(yàn)方法

（1）小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)。采用小鼠甲苯致炎法[15]，選取體重（20±2g）雌性健康小鼠50只，隨機(jī)分為5組，即PRRT低（400mg/kg）、中（800mg/kg）、高劑量（1600mg/kg）組，陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組，每組10只。給藥組分別給予PRRT相應(yīng)劑量，陽(yáng)性對(duì)照組給予阿司匹林，陰性對(duì)照組給予等體積蒸餾水，每日一次，連續(xù)5日。末次給藥1h后將0.03mL二甲苯涂抹于小鼠右耳。2h后處死，取下兩耳并在相同部位用打孔器打孔，稱重。兩耳只差為腫脹度，腫脹抑制率（%）=（對(duì)照腫脹度給藥腫脹度）/對(duì)照腫脹度。

（2）小鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)，用棉球制作小鼠肉芽腫[17]，小鼠于經(jīng)乙醚淺麻醉后，將重量為5mg的滅菌棉球植入小鼠左右腹股溝兩側(cè)皮下，縫合傷口。經(jīng)4h后給藥。每日一次，連續(xù)7日，給藥量同實(shí)驗(yàn)1。末次給藥后于次日處死小鼠，取出棉球肉芽組織，經(jīng)80℃烘干2h，稱重。肉芽組織的重量=取出的棉球肉芽組織重量棉球原重量，腫脹抑制率（%）=（對(duì)照肉芽組織重量-給藥肉芽組織重量）/對(duì)照肉芽組織重量。

（3）小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)。采用醋酸致炎法[16]，實(shí)驗(yàn)用小鼠分組、給藥方法同實(shí)驗(yàn)1.2.1，連續(xù)5日，末次給藥1h后，分別將0.5%伊文斯蘭生理鹽水0.1mL/10g靜脈注射與各鼠尾，再于腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.1mL/10g。20min后處死小鼠，腹腔注射6mL生理鹽水。將腹部剪開(kāi)，吸出洗滌液，加入10mL生理鹽水，離心（3000rpm，15min），取上清液，于590nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

（4）大鼠氣囊滑膜炎實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)后采用蛋清制作大鼠背部氣囊滑膜炎。選取體重（250±10g）雌性健康小鼠50只，分組同實(shí)驗(yàn)1.2.1。第1日將無(wú)菌空氣20mL注射于大鼠背部皮下，形成氣囊;第3日在原氣囊處注射無(wú)菌空氣20mL，同時(shí)在首次注入空氣當(dāng)日開(kāi)始灌胃給藥，連續(xù)7日，劑量同1.2.1，末次給藥后于大鼠背部皮下注射無(wú)菌空氣20mL后，同時(shí)將30%蛋清1mL注射與囊內(nèi)。6h后在急性炎癥期靜脈采血。處死大鼠，用1mL?Hanks液洗滌氣囊，收集洗滌液后離心，取上清液測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。洗滌液中WBC測(cè)定應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測(cè)定，同時(shí)測(cè)定洗滌液中TNFa、MDA含量;血清中MDA含量、SOD活力。滲出液量=洗滌液量1mL。

（5）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。采用Minitab軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±SD表示。采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3?結(jié)果與討論

3.1?貓爪草多糖對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

本試驗(yàn)察了貓爪草多糖組分PRRT抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹的能力，結(jié)果表1所示。數(shù)據(jù)表明，與陰性對(duì)照組相比低、中、高劑量的PRRT均可抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹，且劑量越大抑制率越高。其中，PRRT的高劑量組（1600mg/kg）抑制率達(dá)35.00%，與陰性對(duì)照組相比差別顯著（P<0.05），但低于阿司匹林的抑制率（45.42%）。

3.2?貓爪草多糖對(duì)小鼠棉球肉芽腫的影響

本試驗(yàn)通過(guò)稱重棉球肉芽腫的重量來(lái)考察貓爪草多糖組分PRRT的抗炎作用，結(jié)果如表2所示。數(shù)據(jù)表明，PRRT高、中、低劑量組對(duì)小鼠棉球肉芽腫重量均有減輕作用，且劑量越大抑制率越強(qiáng)。其中，PRRT的中（800mg/kg）、高劑量組（1600mg/kg）抑制率達(dá)50%，與陰性對(duì)照組相比差別顯著（P<0.05），但均低于阿司匹林的抑制率（18.88%）。

3.3?貓爪草多糖對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

本試驗(yàn)采用醋酸致小鼠腹腔血管通透性增加來(lái)研究貓爪草多糖組分PRRT的抗炎作用，結(jié)果如表3所示。數(shù)據(jù)表明，PRRT的中劑量組（800mg/kg）與陰性對(duì)照組相比差別顯著（P<0.05）;PRRT21的高劑量組（1600mg/kg）與陰性對(duì)照組相比差別極顯著（P<0.01）。

3.4?貓爪草多糖對(duì)大鼠氣囊滑膜炎的影響

本試驗(yàn)通過(guò)大鼠滲出液的體積和血清中的WBC、TNFa、MDA等指標(biāo)指標(biāo)來(lái)考察貓爪草多糖組分PRRT的抗炎作用和機(jī)理。結(jié)果如表4、5所示。數(shù)據(jù)表明，低、中、高劑量組滲出液的體積、白細(xì)胞數(shù)和TNFα與陰性對(duì)照組有一定的降低，但差別不顯著。而中。高劑量組能顯著降低WBC。同時(shí)，低、中、高劑量組均能提高SOD的活性，降低MDA含量。說(shuō)明PRRT有一定的抗炎作用，其抗炎作用可能與改變SOD活性相關(guān)。

4?結(jié)論

本研究分別通過(guò)醋酸致腹腔毛細(xì)血管通透性增加和二甲苯致小鼠耳腫脹制作早期炎癥反應(yīng)模型、大鼠氣囊滑膜炎構(gòu)建中期炎癥反應(yīng)模型、棉球肉芽腫構(gòu)建晚期炎癥反應(yīng)模型，考察了貓爪草多糖PRRT組分的抗炎作用和機(jī)制。結(jié)果表明，貓爪草多糖PRRT組分的高劑量組與陰性對(duì)照組相比，可顯著抑制小鼠耳腫脹、降低毛細(xì)血管通透性及肉芽組織增生，其抗炎機(jī)制可能是PRRT可降低血清和滑膜炎滲出液中的MDA含量，提高SOD活性，進(jìn)而減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

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