實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在高危型人乳頭瘤病毒診斷中的應(yīng)用價(jià)值

黃曉葉

宜賓市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 (四川宜賓 644000)

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)是一種DNA病毒，臨床已明確，其是引發(fā)宮頸癌的主要因素，且多數(shù)宮頸病變均伴有HPV感染。在宮頸癌標(biāo)本中，90%以上均可檢出HPV-DNA，因此，做好HPV臨床檢查工作，可促進(jìn)宮頸癌預(yù)防及治療工作的開展[1]。臨床主要通過形態(tài)學(xué)法檢查HPV，但上述方法靈敏度及特異度較低，假陽性率較高，易出現(xiàn)誤診情況。近年來，隨著基因技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢查技術(shù)越發(fā)成熟，其對(duì)高危型HPV更加靈敏，對(duì)臨床診斷宮頸病變具有指導(dǎo)意義，但該項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)今仍處于研究階段。鑒于此，本研究探討實(shí)時(shí)PCR在高危型HPV診斷中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年8月至2020年3月在我院婦科門診行宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查異常的105例患者作為研究對(duì)象，年齡28～63歲，平均(51.52±3.65)歲；體重52～75 kg，平均(62.52±3.15)kg。本研究通過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：均存在白帶增多和(或)帶有血絲、接觸性出血等癥狀；陰道鏡檢查顯示子宮頸存在充血、肥大及糜爛等癥狀；患者對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：處于妊娠期、哺乳期及月經(jīng)期的女性；進(jìn)行HPV治療的患者；合并生殖系統(tǒng)病史的患者；合并重要器官、系統(tǒng)功能障礙的患者。

1.2 方法

標(biāo)本收集：患者取截石位，取樣前使用無菌棉簽去除宮頸口分泌物，然后將美國Digene公司生產(chǎn)的采樣刷置入宮頸內(nèi)1～2 cm處，順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)5～8周，停留5 s后取出。

實(shí)時(shí)PCR：將標(biāo)本放于裝有1 ml 0.9%氯化鈉注射液的離心管中，以13 000 r/min離心10 min，棄上層清液，后加入50 μl裂解液進(jìn)行懸浮和沉淀，于100 ℃下加熱10 min左右，再次以13 000 r/min離心10 min，取上層清液待用；將上層清液于50 ℃下加熱15 min，再次于90 ℃下加熱10 min，循環(huán)40次，直至加熱模板DNA到95 ℃，雙鏈DNA解離為單鏈DNA；將PCR產(chǎn)物放入雜交緩沖液中進(jìn)行沸水浴變性，時(shí)間為10 min左右，后于51 ℃雜交1 h后于同溫度下洗脫15 min；使用植物過氧化物酶(peroxidase，POD)進(jìn)行孵育和洗滌，并配置顯色液，顯色后使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司的ABI 7500 Resl Time PCR System熒光定量PCR儀進(jìn)行分析，高危型HPV檢測盒購于凱普生物公司。

第二代雜交捕獲技術(shù)(hybrid capture-Ⅱ，HC-Ⅱ)：將標(biāo)本保存于美國Hologic的Preservcyt細(xì)胞保存液中，并采用ThinPrep法制作液基細(xì)胞學(xué)薄片，標(biāo)本檢測均采用美國Digenne公司生產(chǎn)的HPV-DNA試劑盒和HC-Ⅱ基因雜交信號(hào)放大檢測系統(tǒng)，所有涂片均按《TBS子宮頸細(xì)胞學(xué)報(bào)告系統(tǒng)回顧及新版解讀》[2]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。

組織病理：使用湖南恒星科技股份有限公司的WH-SMA型電子陰道鏡對(duì)宮頸內(nèi)可疑病灶進(jìn)行定位，取出部分組織進(jìn)行病理檢查；若無可疑病灶，于宮頸管口，通過多點(diǎn)取材后送檢，結(jié)果由兩名經(jīng)驗(yàn)較為豐富的醫(yī)師進(jìn)行診斷。

1.3 臨床評(píng)價(jià)

以組織病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較實(shí)時(shí)PCR與HC-Ⅱ檢查高危型HPV的陽性率。HPV檢出標(biāo)準(zhǔn)：組織病理結(jié)果為宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ級(jí)及以上；實(shí)時(shí)PCR檢查結(jié)果中RLU/CO>1；HC-Ⅱ檢查結(jié)果中HPV的負(fù)荷量≥1.0 pg/ml[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)；一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa>0.75表明一致性極好，0.40～0.75表明一致性較為理想，<0.40表明一致性差。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織病理檢查結(jié)果

經(jīng)組織病理檢查結(jié)果顯示，105例患者中，炎癥反應(yīng)42例，CINⅠ級(jí)35例，CINⅡ級(jí)18例，CINⅢ級(jí)7例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌3例。

2.2 兩種方式檢查高危型HPV的陽性率比較

實(shí)時(shí)PCR檢查高危型HPV與組織病理檢查結(jié)果具有極好的一致性(Kappa=0.771)；HC-Ⅱ檢查高危型HPV與組織病理檢查結(jié)果具有較為理想的一致性(Kappa=0.546)，見表1～2。實(shí)時(shí)PCR檢查高危型HPV的陽性率為87.30%(55/63)，高于HC-Ⅱ檢查的55.56%(35/63)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表1 實(shí)時(shí)PCR與組織病理檢查高危型HPV的結(jié)果比較(例)

表2 HC-Ⅱ與組織病理檢查高危型HPV的結(jié)果比較(例)

表3 兩種方式與組織病理檢查結(jié)果比較(例)

3 討論

目前，臨床已發(fā)現(xiàn)的HPV基因型有100種左右，不同分型的病毒致病能力不同，高危型病毒的致病能力較強(qiáng)，且具有較高的致癌能力，因此，做好高危型HPV的檢查工作，對(duì)感染患者的臨床干預(yù)和治療具有非常重要的意義[4]。

HC-Ⅱ是將第一代試管法改為了96孔平板法，提高了整體工作效率，更有利于篩查，但其存在局限性：(1)該種檢測方式的標(biāo)本收集及保存均有一定特殊要求；(2)若檢測中所得相對(duì)光的單位值<1.0，則無法確定是否發(fā)生HPV感染；(3)檢測過程中易存在交叉感染，假陽性較高[5]。總之，該種檢測方式的結(jié)果仍有一定不確定性，還需尋找其他方式提高高危型HPV陽性檢出率。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的原理是將標(biāo)本的DNA和有熒光素探針進(jìn)行混合，完成高溫變性、低溫復(fù)性及通過適溫延伸的熱循環(huán)后，將標(biāo)本模板DNA互補(bǔ)配對(duì)的探針切斷，探針上的熒光素隨之在反應(yīng)體系中游離，并于特定光下發(fā)出不同熒光，且經(jīng)循環(huán)次數(shù)增加和不斷擴(kuò)增后，通過確定熒光強(qiáng)度，得到Ct值，再與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行有效對(duì)照，從而得到患者標(biāo)本的目的基因拷貝數(shù)[6-7]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)PCR檢查高危型HPV與組織病理檢查結(jié)果具有極好的一致性(Kappa=0.771)；實(shí)時(shí)PCR檢查高危型HPV的陽性率高于HC-Ⅱ檢查，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，實(shí)時(shí)PCR可提高高危型HPV的陽性檢出率，為臨床早期制定干預(yù)和治療宮頸病變措施提供一定依據(jù)。