亞慢性鎘暴露對大鼠血常規(guī)和肝腎組織的影響

李有幸，陸欽晨，龐雅琴，胡雅婕，岑登勝，李金蔚，漆光紫

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

鎘(cadmium，Cd)是環(huán)境中最常見的重金屬污染物之一，美國毒理管理委員會(ATSDR)將鎘列為第六位危及人體健康的有毒物質(zhì)[1]。人體主要通過食物、飲水、吸煙和吸入含鎘的粉塵而使鎘在體內(nèi)積累，并造成機體的損傷[2]。研究表明，鎘可導(dǎo)致肝臟、腎臟、肺臟、胰腺、骨骼、生殖器官、造血、神經(jīng)和內(nèi)分泌、心血管系統(tǒng)的損傷，從而引發(fā)腫瘤，不孕不育，肝、腎功能下降等多種疾病[3]。因鎘暴露劑量大小、時間長短而導(dǎo)致鎘在體內(nèi)不同器官中的蓄積量不同，因而產(chǎn)生的毒效應(yīng)各異。以往的研究主要是集中在急性或亞急性鎘暴露對嚙齒動物肝腎功能的影響，而亞慢性鎘暴露對肝腎功能及組織病理變化的研究較少，且亞慢性毒性實驗多數(shù)是采用初斷乳大鼠(體重80～120 g)作為研究對象，對成年大鼠的研究也相對較少。因此，本研究主要采用成年大鼠亞慢性鎘暴露染毒模型，觀察鎘暴露對成年大鼠血常規(guī)、肝腎功能及組織病理的變化情況，并探討其量效關(guān)系，為鎘中毒的早期診斷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 CdCl2(廣州化學(xué)試劑廠，分析純)，烏拉坦、福爾馬林、二甲苯及蘇木素(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，肝腎功能生化檢測試劑盒(德賽診斷系統(tǒng)有限公司)，全自動血常規(guī)檢測儀(日本希森美康醫(yī)用有限公司)，全自動血生化分析儀(德國羅氏公司)，倒置相差顯微鏡(日本 Olympus公司)。

1.2 染毒劑量設(shè)計 染毒劑量的選擇主要是根據(jù)大鼠每天的飲水量和前期研究的半致死劑量(CdCl2LD50=22.5 mg/kg體重)確定最高染毒劑量約為300 mg/L(1/8半致死劑量)，并按照組間距為2倍的梯度設(shè)置劑量濃度為0 mg/L、75 mg/L、150 mg/L及300 mg/L CdCl2。

1.3 動物分組與染毒 SD清潔級大鼠40只(廣東省動物實驗中心提供)，動物合格證號：SCXK(粵)2018—0021，雌雄各半，平均體重(284.71±55.95) g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為4組，每組10只，常規(guī)喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由采食和飲水。4組大鼠分別按以下方法處理：①0 mg/L劑量組：喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料和雙蒸水；②75 mg/L劑量組：喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料和含氯化鎘75 mg/L雙蒸水；③150 mg/L劑量組：喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料和含氯化鎘150 mg/L雙蒸水；④300 mg/L劑量組：喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料和含氯化鎘300 mg/L雙蒸水。連續(xù)染毒36周。

1.4 指標(biāo)與方法

1.4.1 一般狀況觀察 觀察大鼠皮毛色澤、精神狀態(tài)、活動度、飲食、神經(jīng)反射、排泄等情況，每周記錄體重及飲水量。

1.4.2 血常規(guī)和肝腎功能相關(guān)指標(biāo)檢測 實驗結(jié)束后禁食12 h，采用烏拉坦5 ml/kg劑量進(jìn)行腹腔注射，大鼠反射弧基本消失后立即進(jìn)行腹腔腹主動脈采血， 6 h內(nèi)進(jìn)行血液指標(biāo)檢測；采用全自動血常規(guī)檢測儀檢測血常規(guī)指標(biāo)：白細(xì)胞數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞數(shù)(LYMPH)、紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白量(Hb)、血小板數(shù)(PLT)。采用全自動血生化分析儀檢測肝腎功能相關(guān)指標(biāo)：谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶( AST)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(Urea)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)。

1.4.3 肝、腎臟器系數(shù)的測定 采血后處死大鼠，迅速采集肝、腎等臟器，稱量臟器濕重，并計算其臟器系數(shù)(公式：臟器系數(shù)=臟器濕重/大鼠體重×100%)。

1.4.4 肝腎組織病理學(xué)觀察 取部分肝臟、腎臟組織立即放入10%的福爾馬林固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋切片、貼片、伊紅染色和封片后，在顯微鏡下觀察肝腎組織病理學(xué)改變情況，并對病理圖像進(jìn)行采集和分析。

2 結(jié)果

2.1 一般指標(biāo)觀察 染毒期間觀察發(fā)現(xiàn)，0 mg/L劑量組大鼠毛色光滑，飲食、精神、活動、排泄等基本正常；75 mg/L劑量組大鼠未見異常改變；150 mg/L劑量組大鼠皮毛略顯粗糙，活動度減少；300 mg/L劑量組大鼠皮毛無光，靜臥多，四肢反應(yīng)遲鈍。重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果顯示，染毒處理效應(yīng)與染毒時間之間無交互效應(yīng)(F=0.952，P>0.05)；染毒處理主效應(yīng)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各染毒時間主效應(yīng)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；1～9個月與0個月相比，大鼠體重差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 亞慢性鎘暴露大鼠各時間周期體重變化情況 單位：g

2.2 亞慢性鎘暴露對臟器系數(shù)的影響 肝臟質(zhì)量、肝臟器系數(shù)、腎臟質(zhì)量及腎臟器系數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 亞慢性鎘暴露對大鼠體重與臟器比值的影響

2.3 亞慢性鎘暴露對大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響 與0 mg/L劑量組比較，300 mg/L劑量組大鼠WBC、LYMPH、PLT均明顯升高(P<0.05)，150 mg/L、300 mg/L劑量組大鼠Hb明顯下降(P<0.05)；RBC指標(biāo)各組間無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 亞慢性鎘暴露對大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

2.4 亞慢性鎘暴露對大鼠肝腎功能的影響 與0 mg/L劑量組比較，75 mg/L劑量組各項指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，150 mg/L劑量組AST、Urea、UA均明顯升高(P<0.05)，300 mg/L劑量組大鼠ALT、AST、Urea、Cr、UA均明顯升高(P<0.05)；ALP指標(biāo)各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 亞慢性鎘暴露對大鼠肝腎功能的影響

2.5 亞慢性鎘暴露對大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響 肝臟病理檢測結(jié)果如圖1所示，0 mg/L劑量組大鼠的肝臟病理圖像顯示正常結(jié)構(gòu)：肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，向周圍呈放射狀排列，紋路清晰，細(xì)胞邊緣清楚，結(jié)構(gòu)完整(見圖1a)；75 mg/L劑量組出現(xiàn)肝小葉中央靜脈擴(kuò)張、淤血，小葉中央肝竇淤血，肝細(xì)胞水腫伴少量肝細(xì)胞溶解性壞死及肝細(xì)胞再生，未見炎性細(xì)胞浸潤、小葉結(jié)構(gòu)完整，無纖維化(見圖1b)；150 mg/L劑量組顯示肝小葉中央靜脈及肝竇擴(kuò)張淤血，肝細(xì)胞廣泛水腫、溶解性壞死及較多肝細(xì)胞再生(見圖1c)；300 mg/L劑量組顯示肝小葉中央靜脈及肝竇擴(kuò)張淤血的同時，肝細(xì)胞水腫、溶解性壞死的程度更加嚴(yán)重，并出現(xiàn)嗜酸性壞死及較多肝細(xì)胞再生，肝小葉周邊及小葉內(nèi)可見單核細(xì)胞浸潤，小葉結(jié)構(gòu)存在，小葉周邊少量纖維增生(見圖1d)。

注：a：0 mg/L組；b：75 mg/L組；c：150 mg/L組；d：300 mg/L組。

2.6 亞慢性鎘暴露對大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響 腎臟病理檢測結(jié)果如圖2所示，0 mg/L劑量組大鼠病理圖像顯示正常結(jié)構(gòu)：細(xì)胞形態(tài)清晰，結(jié)構(gòu)完整規(guī)則 (見圖2a)。75 mg/L劑量組腎小球毛細(xì)血管出現(xiàn)擴(kuò)張充血(見圖2b)，150 mg/L、300 mg/L劑量組系膜細(xì)胞灶性增生，近曲小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性及壞死(見圖2c、圖2d)。未見腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維增生及炎性細(xì)胞浸潤。

注：a：0 mg/L組；b：75 mg/L組；c：150 mg/L組；d：300 mg/L組。

3 討論

3.1 亞慢性鎘暴露對大鼠生長發(fā)育及臟器系數(shù)的影響 在多數(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，鎘暴露主要表現(xiàn)為抑制生長發(fā)育，如潘尚霞等[4]用1.11 mg/kg、3.51 mg/kg和11.06 mg/kg CdCl2對SD大鼠灌胃染毒30 d，11.06 mg/kg劑量組大鼠體重出現(xiàn)下降。但也有不同的研究發(fā)現(xiàn)，如劉霞等[5]采用2.5 mg/kg、5 mg/kg及10 mg/kg CdCl2對大鼠灌胃染毒56 d，各劑量組體重均無顯著差異；王樂樂等[6]用0 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg和5 mg/kg CdCl2對SD大鼠灌胃染毒30 d，各劑量組大鼠體重變化不大；甚至有研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/L CdCl2染毒23周后小鼠體重明顯升高，認(rèn)為對小鼠生長發(fā)育具有促進(jìn)作用[7]。本研究結(jié)果顯示，各劑量組大鼠體重變化不大，與以上結(jié)果有些不一致，可能與動物毒性耐受或存在閾值劑量等因素有關(guān)。本實驗研究的大鼠為成年大鼠，體重較大，對毒物的代償、代謝、抵抗能力可能相對比較強，也可能與鎘暴露對大鼠生長發(fā)育存在一定的閾值劑量有關(guān)[8]，其機制和閾值劑量有待進(jìn)一步研究。臟器系數(shù)又稱臟器比，是動物臟器重量與體重之間的比值，能夠間接反映臟器增大或縮小的變化情況。正常情況下，臟器與體重的比值比較恒定，當(dāng)體重變化不大，臟器系數(shù)升高時，可能說明臟器可能出現(xiàn)了水腫、淤血、肥大增生等，而臟器系數(shù)降低時，可能說明臟器出現(xiàn)了萎縮或其它退行性改變等。本實驗中各染毒組大鼠體重之間變化無明顯差異，肝、腎臟器系數(shù)各劑量組無明顯差異，與肝、腎組織的病理結(jié)果不相符，其原因可能是臟器損傷尚未達(dá)到明顯腫大或者萎縮的程度。

3.2 亞慢性鎘暴露對大鼠血常規(guī)、肝腎功能及病理形態(tài)學(xué)的影響 血液指標(biāo)的改變往往是機體損傷的敏感指標(biāo)，作用于機體的任何刺激都可使血液成分發(fā)生改變[9]。臨床上，血液指標(biāo)WBC常用來評價機體炎癥的敏感指標(biāo)。國內(nèi)的研究者對職業(yè)性鎘暴露工人的血液進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WBC明顯升高[10-11]，但也有發(fā)現(xiàn)WBC未出現(xiàn)升高[12]，其原因可能與鎘暴露的劑量大小有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，300 mg/L劑量組的WBC明顯升高，提示這個劑量的亞慢性鎘暴露可引起炎癥反應(yīng)，而本研究的PLT結(jié)果顯示，300 mg/L劑量組出現(xiàn)明顯升高，也間接證明了這一點。本研究300 mg/L劑量組的LYMPH比對照組明顯升高，與Yuan DX等[13]結(jié)果一致，提示該劑量的亞慢性鎘暴露可能引起淋巴細(xì)胞的過度增殖。另外，以往的研究發(fā)現(xiàn)鎘暴露可以引起機體貧血[12，14-15]，本研究結(jié)果顯示，150 mg/L和300 mg/L劑量組的Hb指標(biāo)均出現(xiàn)下降，表明高于150 mg/L劑量的亞慢性鎘暴露可能導(dǎo)致機體貧血的發(fā)生。以上血常規(guī)提示的炎癥反應(yīng)是不是由于肝腎組織損傷引起？為此我們對肝腎組織進(jìn)行了相關(guān)的檢測。結(jié)果顯示，150 mg/L劑量組的AST明顯升高，150 mg/L和300 mg/L劑量組的ALT、AST同時升高，表明高于150 mg /L劑量的亞慢性鎘暴露可造成肝臟損傷。Urea、Cr、UA是臨床上常用于評價腎功能的常用指標(biāo)，本實驗中，150 mg/L劑量組的Urea、UA出現(xiàn)升高，300 mg/L劑量組的Urea、Cr、UA同時升高，表明高于150 mg/L劑量的亞慢性鎘暴露可造成腎臟損傷。進(jìn)一步病理組織切片檢查發(fā)現(xiàn)，高于150 mg/L劑量的染鎘組肝腎組織出現(xiàn)明顯的淤血、水腫、增生、變性、壞死等病理改變，確實證明肝腎組織損傷的存在。因此，我們認(rèn)為亞慢性鎘暴露導(dǎo)致的肝腎組織損傷可能是引起機體炎癥反應(yīng)的重要原因之一。