HPSEC-UV-TOC聯(lián)用技術(shù)操作條件對有機(jī)物分子量分布測定的影響

夏慶艷，王 琳，陳天宇，李志浩，武道吉

(山東建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院，山東濟(jì)南 250101)

作為評價(jià)膜污染的指標(biāo)[1]，分子量分布常由2種方法測得：一種是超濾膜法，但溶質(zhì)易被截留，且精度不高；另一種方法是凝膠色譜法，但只能測定有紫外響應(yīng)的有機(jī)物，不能測定多糖等含碳單鍵的有機(jī)物。國外發(fā)展了一種新型凝膠色譜法(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)[2]，此方法需在凝膠色譜的基礎(chǔ)上串聯(lián)紫外(UV)檢測器，最后串聯(lián)總有機(jī)碳(TOC)檢測儀，被稱作HPSEC-UV-TOC聯(lián)用技術(shù)。紫外檢測器能夠檢測含苯環(huán)及碳碳雙鍵等不飽和有機(jī)物，TOC檢測儀可以檢測含碳單鍵和無苯環(huán)物質(zhì)[2-3]。這種方法能夠較易測定天然有機(jī)物(natural organic matter，NOM)相對分子量的大小，所得到的分子量分布圖連續(xù)，能夠更加真實(shí)客觀地反映NOM的物化性質(zhì)。近年來，國內(nèi)已經(jīng)新引進(jìn)這種聯(lián)用技術(shù)，并在水處理理論與技術(shù)研究中得到初步應(yīng)用[4-8,14]。

本研究主要考察pH、離子強(qiáng)度、樣品配置溶液等運(yùn)行條件對HPSEC-UV-TOC聯(lián)用技術(shù)測定葡聚糖T1分子量分布的影響，同時(shí)，將優(yōu)化條件用于測定黃河原水及其親疏水組分中有機(jī)物的分子量分布，從而完善該聯(lián)用技術(shù)在飲用水地表水源不同有機(jī)物組分研究中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用的試劑為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分子量為1 000的葡聚糖(dextran，T1)，如圖1所示。葡聚糖T1屬于小分子親水性有機(jī)物，無芳香度，較為符合國內(nèi)地表原水中主要分子量分布的特征[9-10]。試驗(yàn)原水采用黃河水庫原水，該原水濃縮后經(jīng)XAD-8(北京康林科技有限責(zé)任公司)、XAD-4(美國Sigma公司)和IRA958樹脂(美國Sigma公司)分離得到強(qiáng)疏、弱疏、極親、中親4種組分。鹽酸溶液和NaOH(5 mol/L)用于調(diào)節(jié)pH，采用NaCl(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度(IS)。如果沒有特別注明，試驗(yàn)中使用的試劑純度均為分析純，溶液采用超純水(Milli-Q plus超純水機(jī))配制。

圖1 葡聚糖T1分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular Structure of Dextran T1

1.2 試驗(yàn)儀器

沃特世(Waters)Alliance系列e 2695型凝膠色譜儀；Waters 2489型UV-VIS檢測器；Sievers M9總有機(jī)碳(TOC)檢測器；Empower 3色譜軟件。

1.3 色譜條件

試驗(yàn)采用的凝膠色譜柱型號是TSK gel G3000 PWXL(7.8 mm×30 cm，填料為聚甲基丙烯酸酯)，色譜柱之前串聯(lián)保護(hù)柱型號是TSK-GEL TSK guard column PWXL(6.0 mm×4.0 cm)。 流動(dòng)相采用Na2SO4(0.02 mol/L)，KH2PO4(0.05 mol/L)和NaOH(0.03 mol/L)的混合溶液。

如無特殊說明，凝膠色譜柱的流速為0.5 mL/min，柱溫采用40 ℃，UV檢測器在254 nm處測定樣品， 進(jìn)樣體積為100 μL，測樣時(shí)間為35 min，試驗(yàn)所用水樣均用Milli-Q超純水配制完成。

1.4 方法原理

高效凝膠色譜主要工作原理是根據(jù)溶解性有機(jī)物的尺寸進(jìn)行分離，分子量較大的有機(jī)物不能進(jìn)入凝膠孔隙，會(huì)首先流出，分子量小的有機(jī)物后流出，因此，能夠繪制出不同分子量隨時(shí)間t的變化曲線。樣品隨后依次經(jīng)過UV-VIS檢測器和TOC檢測器，在Empower 3軟件上每秒自動(dòng)記錄2個(gè)數(shù)據(jù)，以體積V(或時(shí)間t)為橫軸，繪制出UV和TOC信號隨體積V(或時(shí)間t)的變化曲線。圖2為該聯(lián)用技術(shù)示意圖。

注：1-Waters e 2695型凝膠色譜儀；2-色譜柱柱溫箱(右)和溫控箱(左)；3-Waters 2489 UV-VIS檢測器；4-Sievers M9 Portable TOC檢測器；5-臺(tái)式電腦圖2 HPSEC-UV-TOC聯(lián)用技術(shù)示意圖Fig.2 Schematic Diagram of HPSEC-UV-TOC System

2 結(jié)果與討論

2.1 校正曲線

凝膠色譜測定的是有機(jī)物的相對分子質(zhì)量，因此，需使用已知分子量、物化性質(zhì)與所測樣品相近的標(biāo)準(zhǔn)品來對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行校正，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，本試驗(yàn)采用寬分布標(biāo)樣校正法。

前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，NOM與聚苯乙烯磺酸鈉(sodium polystyrene sulfonate，PSS)的性質(zhì)相似。本試驗(yàn)選取的是相對分子質(zhì)量為210、4 300、6 800、17 000、32 000的PSS標(biāo)準(zhǔn)品，作lgMw-t半對數(shù)曲線(圖3)，采用三階擬合，如式(1)～式(2)。

圖3 lgMw與峰值保留時(shí)間t的關(guān)系Fig.3 UV and TOC Curves of lgMw and Peak Time t

AMWUV=10(S-2.665 89t+0.114 13t2-0 .001 63t3 )

(1)

R2=0 .995 05
AMWTOC= 10(S-1 .309 56t+0.033 31t2-0.000 277 4t3)

(2)

R2=0.987 57

其中：AMWUV——UV254響應(yīng)峰所對應(yīng)的相對分子量；

AMWTOC——TOC響應(yīng)峰所對應(yīng)的相對分子量；

t——峰值保留時(shí)間，min；S——常數(shù)。

2.2 TOC響應(yīng)值與濃度的關(guān)系

Empower 3軟件上采集到的TOC數(shù)據(jù)不是所測樣品的準(zhǔn)確濃度，而是電信號(mV)，因此，需使用標(biāo)準(zhǔn)濃度的樣品進(jìn)行線性擬合，得到mV對應(yīng)mg/L的對應(yīng)關(guān)系曲線。如圖4所示，R2=0.999 34，表明電信號(mV)與TOC(mg/L)相關(guān)性很強(qiáng)。

圖4 TOC濃度與響應(yīng)值關(guān)系曲線Fig.4 Correlation Curves between TOC Concentration and TOC Response Value

2.3 pH的影響

根據(jù)色譜柱的耐受pH值范圍(2～12)，將20 mg/L的葡聚糖T1溶液的pH值分別調(diào)節(jié)為3、5、7、9、11，以考察pH對樣品測定的影響，結(jié)果如圖5和表1所示。葡聚糖屬于親水性有機(jī)物，無法被傳統(tǒng)的HPSEC-UV檢測到，因而UV沒有明顯響應(yīng)。由TOC測定結(jié)果可知，TOC響應(yīng)峰寬一致，峰面積相近(表1)，說明pH對葡聚糖T1的分子量測定影響較小。這與張晗等[11]的研究結(jié)果不同，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)TOC檢測儀中H3PO4的投加量采用最大投加量2.0 μL/min，能夠充分酸化樣品中的無機(jī)碳，因此，在堿性條件下也能使樣品分子量分布的TOC測定結(jié)果正常。

圖5 不同pH值條件下的UV和TOC響應(yīng)Fig.5 Effect of pH Values on UV and TOC Responses

表1 不同pH值條件下的TOC峰面積Tab.1 Peak Areas of TOC under Different pH Values

2.4 離子強(qiáng)度的影響

以0～0.4 mol/L NaCl溶液考察離子強(qiáng)度(IS)對樣品測定結(jié)果的影響，樣品采用20 mg/L葡聚糖T1進(jìn)行測定。結(jié)果如圖6、表2、表3所示。由圖6(a)可知，離子強(qiáng)度越高，紫外響應(yīng)越高，表明離子強(qiáng)度對測定有機(jī)物相對分子質(zhì)量分布有一定的影響。這可能是由于有機(jī)物在固定相中的吸附作用[12]，或者是由于有機(jī)物隨洗脫液離子強(qiáng)度的變化而發(fā)生了構(gòu)象變化[13]。

圖6 不同離子強(qiáng)度條件下的UV和TOC響應(yīng)Fig.6 Effects of Different Ionic Strengths on UV and TOC Responses

表2 不同離子強(qiáng)度條件下的UV出峰時(shí)間Tab.2 Elution Time of UV under Different Ionic Strengths

表3 不同離子強(qiáng)度條件下的TOC出峰時(shí)間和峰面積Tab.3 Elution Time and Peak Areas of TOC under Different Ionic Strengths

圖7 不同樣品配制溶液條件下的UV和TOC響應(yīng)Fig.7 UV and TOC Peaks under Different Sample Solvents

由表2可知，離子強(qiáng)度從0.01 mol/L增加到0.4 mol/L NaCl，出峰時(shí)間依次增加，說明向測樣中加入鹽會(huì)導(dǎo)致樣品被色譜柱延遲，分子量分布圖偏移，測定結(jié)果偏小。這與Hine等[12]的研究結(jié)果相似，原因可能是離子強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)吸附作用，影響污染物在凝膠色譜柱中的遷移，從而導(dǎo)致不準(zhǔn)確的分子量分布。

(3)

TOC + HClO → TOX + H2O

(4)

2.5 測試樣配制溶液的影響

圖7和表4為20 mg/L 的葡聚糖T1溶于超純水和流動(dòng)相后的測定結(jié)果。如圖7(b)所示，用流動(dòng)相配制的葡聚糖T1的TOC峰高略小于用超純水配制的樣品。兩者峰寬基本一致，出峰時(shí)間相同，說明配樣溶液與色譜柱的甲基丙烯酸酯填料之間相互作用小，因此，配樣溶液對測定結(jié)果的影響較小。

表4 不同測試樣配制溶液條件下的TOC峰面積Tab.4 Peak Areas of TOC under Different Sample Solvents

2.6 天然原水的測定

黃河水樣濃縮至20 mg/L后經(jīng)樹脂分離得到強(qiáng)疏、弱疏、極親、中親4種組分，回收率為101.76%，各組分濃度如表5所示。由表5可知，4種組分的TOC濃度從大到小依次為：中親>弱疏>極親>強(qiáng)疏。各組分分別經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后調(diào)節(jié)pH至中性，測定其分子量分布如圖8和表6所示。

表5 原水各組分濃度Tab.5 TOC Concentration of Each Component in Raw Water

由圖8可知，試驗(yàn)原水及其各組分中有機(jī)物分子量分布分為3部分。第一部分分子量較高(106～1.34×104Da)，峰值對應(yīng)的表觀分子量為1.2×105Da。由圖8(a)可知，這部分有機(jī)物的UV響應(yīng)均較低。由圖8(b)可知，只有原水及中親組分在這一分子量分布區(qū)間出現(xiàn)TOC響應(yīng)，說明原水含有的大分子有機(jī)物多為中性親水組分，該類有機(jī)物多為一些高分子蛋白質(zhì)、多糖等親水性組分，此類物質(zhì)對紫外光的吸收極低[15]。

第二部分為中等分子有機(jī)物(2 500～1 500 Da)，峰值對應(yīng)的表觀分子量為1 545 Da，與后面的小分子峰分離較差。由圖8(a)可知，該區(qū)間有機(jī)物對紫外有較高響應(yīng)，可以推測其多為腐殖質(zhì)類中分子有機(jī)物，此類有機(jī)物對紫外吸收極強(qiáng)，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜。由圖8(b)可知，該區(qū)間原水中的有機(jī)物TOC響應(yīng)最高，出峰面積最大，說明中等分子(2 500～1 500 Da)有機(jī)物在原水中含量最高。各組分在該區(qū)間的峰面積占原水的比例順序從大到小依次為：中親(35%)> 弱疏(26%)> 極親(21%)> 強(qiáng)疏(18%)，說明中親組分構(gòu)成原水中等分子(2 500～1 500 Da)有機(jī)物的主要部分。

圖8 各組分及原水UV和TOC變化圖Fig.8 UV and TOC Responses of Each Component in Raw Water

表6 各組分及原水對應(yīng)的TOC峰面積Tab.6 Peak Areas of TOC with Each Component in Raw Water

第三部分為小分子有機(jī)物(1 500～700 Da)，峰值對應(yīng)的表觀分子量為1 000 Da，UV響應(yīng)相比中等分子有機(jī)物較小，與中等分子區(qū)間的峰分離較差，說明這部分有機(jī)物大多數(shù)是小分子類有機(jī)物，所含碳碳雙鍵和芳香族結(jié)構(gòu)較少[16]，也可能包含中等分子有機(jī)物的分解產(chǎn)物。

綜上，由圖8(a) 和圖8(b) 可知，大分子(106～1.34×104Da)有機(jī)物、中等分子(2 500～1 500 Da)有機(jī)物和小分子(1 500～700 Da)有機(jī)物均主要由親水性物質(zhì)組成。由表6可知，各組分峰面積順序依次為：中親>弱疏>極親>強(qiáng)疏，與固相萃取結(jié)果相同。值得注意的是，圖8(a) 中極親組分的UV響應(yīng)值明顯偏高，可能是由于極親組分的洗脫液中含有較高濃度NaCl，使極親樣品的離子強(qiáng)度高于其他樣品，樣品與固定相之間發(fā)生了吸附或靜電排斥反應(yīng)，導(dǎo)致UV響應(yīng)極高。圖8(b)中極親組分的響應(yīng)峰滯后可能也與離子強(qiáng)度較高有關(guān)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要考察了pH、離子強(qiáng)度、配樣溶液等操作條件對HPSEC-UV-TOC聯(lián)用技術(shù)測定葡聚糖T1及天然地表水中有機(jī)物分子量分布的影響，所得結(jié)論如下。有助于完善HPSEC-UV-TOC聯(lián)用技術(shù)，從而使得該技術(shù)在飲用水地表水源有機(jī)物組分研究中發(fā)揮更大作用。

(1)在色譜柱允許的pH范圍內(nèi)，pH對葡聚糖T1分子量分布的測定結(jié)果影響較小。

(2)離子強(qiáng)度對相對分子質(zhì)量分布的測定影響較大，離子強(qiáng)度從0增加到0.4 mol/L NaCl時(shí)，UV響應(yīng)有明顯增加，而TOC出峰時(shí)間延后，峰面積減小。

(3)葡聚糖T1樣品溶液采用超純水為溶劑與采用流動(dòng)相為溶劑相比，對其相對分子質(zhì)量分布的測定影響較小。

(4)HPSEC-UV-TOC聯(lián)用技術(shù)可有效表征黃河原水及其組分的分子量分布。原水中的中性親水組分含量最高，且該組分在大分子(106～1.34×104Da)、中等分子(2 500～1 500 Da)和小分子(1 500～700 Da)有機(jī)物中均占較高比例。