金屬礦區(qū)植物內(nèi)生菌資源研究進展

臺喜生，楊蕊琪，常國華，高天鵬，陳映全

1． 蘭州城市學院 地理與環(huán)境工程學院，甘肅 蘭州 730070； 2． 甘肅省礦區(qū)污染治理與生態(tài)修復工程研究中心，甘肅 蘭州 730070； 3． 西安文理學院 生物與環(huán)境工程學院，陜西 西安 710065

植物內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段生活在活體植物組織內(nèi)，又不引起植物明顯病害的微生物，是一類重要的微生物資源，近年來成為微生物資源研究的熱點之一[1]。已有研究表明，植物內(nèi)生菌能促進植物生長，提高植物抗逆性，增強植物重金屬耐性[2-5]。植物內(nèi)生菌通過溶磷、活化重金屬、產(chǎn)吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，IAA)、產(chǎn)嗜鐵素、分解乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-am-inocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC)，以及傳遞營養(yǎng)物質(zhì)等作用，提升植物修復重金屬污染的作用[6-8]。從宿主植物中分離內(nèi)生菌，回接宿主植物，能促進其生長，增強其對重金屬等污染物的富集能力[9]。關(guān)于植物內(nèi)生菌研究進展的綜述性報道已有很多，內(nèi)容涵蓋內(nèi)生菌的物種多樣性、宿主多樣性、作物促生、生物防治、生理活性物質(zhì)的醫(yī)療開發(fā)應用等方面[10-15]。本文將針對礦區(qū)環(huán)境污染生物修復中植物及其內(nèi)生菌的相互作用展開綜述和討論，歸納該研究領(lǐng)域目前存在的不足，進一步提出具有研究價值的關(guān)注點。

1 礦區(qū)植物內(nèi)生菌物種多樣性及群落組成

1.1 內(nèi)生細菌

礦區(qū)植物體內(nèi)廣泛分布著內(nèi)生細菌、內(nèi)生放線菌和內(nèi)生真菌。劉軍生等[16]對秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)內(nèi)優(yōu)勢植物杠柳和草木樨的內(nèi)生細菌進行了分離，篩選出具有較高鎘抗性的11株內(nèi)生細菌，進行了16S rDNA序列分析，經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌(Bacillussp.)。王義聰[3]以云南省瀾滄縣募乃鉛鋅礦區(qū)礦渣堆中自然生長的三種優(yōu)勢植物蒙自榿木、紫莖澤蘭和藎草為研究對象，對其根內(nèi)生細菌的多樣性進行了調(diào)查，研究發(fā)現(xiàn)蒙自榿木與紫莖澤蘭混合群落中蒙自榿木的克隆文庫香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon index)為4.85，其中占比大于3%的屬有Bradyrhizobium(11.38%)，Methylibium(6.88%)，Niastella(3.17%)和Actinoplanes(3.17%)，變形菌門為優(yōu)勢菌門，放線菌門次之；混合群落中紫莖澤蘭的克隆文庫Shannon指數(shù)為3.82，優(yōu)勢屬為CandidatusPhytoplasma(31.44%)和Sphingomonas(5.94%)，變形菌門為優(yōu)勢菌門，柔膜菌門次之；紫莖澤蘭單優(yōu)群落的克隆文庫Shannon指數(shù)為3.63，優(yōu)勢屬為CandidatusPhytoplasma(39.74%)，柔膜菌門為優(yōu)勢菌門，變形菌門次之；藎草單優(yōu)群落的克隆文庫Shannon指數(shù)為4.98，其中占比大于3%的屬有Rhizobium(5.90%)，Niastella(5.64%)和CandidatusPhytoplasma(3.08%)，變形菌門為優(yōu)勢菌門，綠彎菌門次之。劉莉華[2]從鎘超富集植物龍葵體內(nèi)分離得到5株內(nèi)生細菌，分別為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)細菌，腸桿菌屬(Enterobactersp.)細菌，巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，克雷伯氏菌屬細菌Klebsiellatrevisan和貪噬菌屬細菌Variovoraxparadoxus。陳亮[17]對重金屬污染條件下超累積植物龍葵內(nèi)生細菌群落多樣性進行了解析，發(fā)現(xiàn)龍葵內(nèi)生細菌群落多樣性豐富，其中占絕對優(yōu)勢地位的類群為變形菌門(Proteobacteria，61.93%)，其次為放線菌門(Actinobacteria，18.78%)，擬桿菌門(Bacteroidetes，12.18%)和厚壁菌門(Firmicutes，2.03%)，以及未被分類細菌(Unclassified bacteria，5.08%)，優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)和假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，在克隆文庫中的占比分別為24.37%和12.18%。在此研究中，也分離篩選出具有多種重金屬抗性的純培養(yǎng)內(nèi)生細菌30株，通過16S rDNA序列鑒定，主要為微桿菌屬(Microbacteriumsp.)，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)，黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)，金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)，土壤農(nóng)桿菌屬(Agrobacteriumsp.)，鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，沙雷氏菌屬(Serratiasp.)以及短桿菌屬(Curtobacteriumsp.)的細菌。柳若霖[6]從金昌鎳銅礦區(qū)6種植物中分離得到44株內(nèi)生菌，多為植物內(nèi)生菌的常見屬，其中大部分歸于假單胞菌屬(Pseudomonassp.，占比22.5%)，芽孢桿菌屬(Bacillussp.，占比20%)及細小桿菌屬(Microbacteriumsp.，占比15%)，并且首次分離了Sphingbacteriumsp.屬的內(nèi)生菌，首次從高寒干旱地區(qū)分離出Sinomicrobiumsp.屬的內(nèi)生菌，前人僅從熱帶植物中分離得到過Sinomicrobiumsp.屬的內(nèi)生菌。陳誠[18]研究發(fā)現(xiàn)，攀枝花礦區(qū)植物內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)豐富，包括蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)，藤黃色桿菌屬(Luteibactersp.)，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，芽單胞菌屬(Gemmatimonadetessp.)，腸桿菌屬(Pantoeasp.)，棲熱菌屬(Thermussp.)，丙酸菌屬(Propionibacteriumsp.)，紅球菌屬(Rhodococcussp.)等。

1.2 內(nèi)生放線菌

鄭有坤等[19]采用變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)及序列分析對四川漢源鉛鋅礦區(qū)蜈蚣草內(nèi)生放線菌的多樣性進行了研究，發(fā)現(xiàn)鉛鋅礦區(qū)蜈蚣草內(nèi)生放線菌存在豐富的多樣性。DGGE條帶序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，鏈霉菌屬(Streptomycessp.)，假諾卡氏菌屬(Pseudonocardiasp.)，小單孢菌屬(Micromonosporasp.)和Xianggellasp.為蜈蚣草內(nèi)生放線菌的優(yōu)勢菌屬；擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsissp.)，小雙孢菌屬(Microbisporasp.)，馬杜拉放線菌(Actinomadurasp.)，弗蘭克氏菌屬(Frankiasp.)的放線菌，以及一些未培養(yǎng)放線菌也在蜈蚣草體內(nèi)存在。攀枝花礦區(qū)植物內(nèi)生放線菌包含鏈霉菌屬(Streptomycessp.)，諾卡氏菌屬(Nocardiasp.)，假諾卡氏菌屬(Pseudonocardiasp.)的放線菌，以及不可培養(yǎng)放線菌(Uncultured actinobacterium)。鏈霉菌屬的內(nèi)生放線菌種類各異，不可培養(yǎng)放線菌類群之間有一定差異，攀枝花礦區(qū)植物具有可待挖掘的內(nèi)生放線菌資源[18]。

1.3 內(nèi)生真菌

張春燕[21]以采自南京棲霞鉛鋅礦區(qū)的新鮮構(gòu)樹根、莖和葉為研究對象，通過組織分離法，共分離純化了47株內(nèi)生真菌。構(gòu)樹葉的內(nèi)生真菌分離率達到0.91，構(gòu)樹內(nèi)生真菌具有豐富的生物多樣性，是潛在的內(nèi)生真菌資源庫；對分離獲得的47株內(nèi)生真菌及前期已獲得的48株內(nèi)生真菌進行重金屬鋅(Zn)、鉛(Pb)和銅(Cu)的耐受性研究，發(fā)現(xiàn)其中5株菌對重金屬的耐受性較好，在Zn濃度為200 mmol/L時仍能生長，它們分別為Apiosporamontagnei，Arthriniumphaeospermum，Aspergillussp.，Stagonosporopsiscucurbitacearum和Eyronellaeaaustralis。鄭有坤等[22]采用傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法對四川漢源鉛鋅礦區(qū)6種常見植物香根草、五節(jié)芒、蜈蚣草、一年蓬、星毛角柱花和曼陀羅進行內(nèi)生真菌分離，根據(jù)菌落形態(tài)特征篩選了27株代表菌株。采用隨機擴增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)指紋圖譜分析技術(shù)進行了遺傳多樣性分析，并在RAPD分析的基礎(chǔ)上測定了8株代表菌株的rDNA-ITS序列。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，8個代表菌株分別屬于鐮刀菌屬(Fusariumsp.)，青霉屬(Penicilliumsp.)，座囊菌綱(Dothideomycetes)，小不整球殼屬(Plectosphaerellasp.)，漆斑菌屬(Myrotheciumsp.)，格孢腔菌屬(Pleosporalessp.)，鏈格孢屬(Alternariasp.)和擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)8個系統(tǒng)發(fā)育分支，說明鉛鋅礦區(qū)植物內(nèi)生真菌具有一定的多樣性。錢旭等[23]以江西龍南鉀礦區(qū)常見蕨類植物芒萁、狗脊、禾稈蹄蓋蕨、海金沙、華中鐵角蕨、井欄邊草和烏蕨等植物為材料，采用組織分離、形態(tài)學鑒定等方法，對其內(nèi)生真菌多樣性進行了調(diào)查。從7種植物中共分離獲得377株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定377個菌株隸屬于鏈格孢屬、曲霉屬、枝孢菌屬和輪枝孢屬等25個屬。陳誠[18]研究發(fā)現(xiàn)攀枝花礦區(qū)植物內(nèi)生真菌種類豐富，包括莖點霉屬(Phomasp.)，派倫屬(Peyronellaeasp.)，鏈格孢屬(Alternariasp.)，Chaunopycnissp.，鐮刀菌屬(Fusariumsp.)，枝孢屬(Cladosporiumsp.)，短柄霉屬(Aureobasidiumsp.)，曲霉屬(Aspergillussp.)和柄銹菌屬(Pucciniasp.)等[18]。

1.4 深色有隔內(nèi)生真菌

深色有隔內(nèi)生真菌(Dark septate endophytes，DSE)是一類定殖于植物根部的小型真菌，它們廣泛分布于各種生態(tài)系統(tǒng)中，特別是在受脅迫的寒旱環(huán)境中[24]。DSE與宿主植物的關(guān)系正如叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)與其宿主植物一樣，是一種共生關(guān)系。DSE主要促進植物對磷的吸收，能提高植物形成叢枝菌根的比例，并促進新根的發(fā)生，進而促進植物對有機或無機態(tài)氮的吸收，在植物吸收礦質(zhì)營養(yǎng)和水分方面具有重要作用[25]。云南大學趙之偉教授團隊對云南鉛鋅礦區(qū)植物根內(nèi)DSE給予了很高的關(guān)注度，獲得了較多的研究成果。梁昌聰?shù)萚25]對云南省會澤縣者海鎮(zhèn)廢棄鉛鋅礦區(qū)的17科21種植物的DSE進行了調(diào)查，在13種植物的根內(nèi)發(fā)現(xiàn)了DSE，占調(diào)查植物的62%?？涤頪26]對云南瀾滄縣竹塘鄉(xiāng)募乃老廠鉛鋅礦尾礦地的19科24種植物DSE定殖的情況進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其中17種植物的根內(nèi)有DSE定殖，占調(diào)查植物的70.83%；紫莖澤蘭是該礦區(qū)的優(yōu)勢植物，普遍地被DSE定殖，自然感染率達了30.62%，屬于中高度感染。張杰[20]對云南瀾滄暮乃礦區(qū)的19科24種植物和個舊礦區(qū)的25科30種植物根內(nèi)DSE調(diào)查發(fā)現(xiàn)，兩個礦區(qū)植物DSE的定殖率分別是70.83%和90.00%，其中優(yōu)勢植物全部被DSE定殖。上述三項研究均表明即使是重金屬污染脅迫的區(qū)域，DSE依然廣泛分布。張杰[20]從云南暮乃礦區(qū)12科14種110個植物樣本中分離得到40株DSE，從云南個舊礦區(qū)18科23種108個植物樣本根內(nèi)分離得到55株DSE，結(jié)合形態(tài)學和分子生物學的方法對分離獲得的菌株進行鑒定，大部分菌株屬于子囊菌(Ascomycetes)，包括Phomasp.，Schizotheciumsp.，Exophialasp.，Lophiostomasp.，Thysanoreasp.，Cladophialophorasp.，Phialophorasp.，Phialocephalasp.，Leptodontidiumsp.，Leohumicolasp.，Pleosporalessp.和Pyrenochaetasp.。其中，枝孢霉屬(Cladosporiumsp.)是定殖于云南暮乃礦區(qū)植物根內(nèi)的優(yōu)勢DSE，而云南個舊礦區(qū)DSE的優(yōu)勢菌屬是Leptodontidiumsp.。崔洪亮[24]對云南募乃鉛鋅礦區(qū)內(nèi)自然生長的蒙自榿木根內(nèi)DSE定殖情況進行了調(diào)查，從蒙自榿木根內(nèi)分離得到了一批DSE菌株。采用分子生物學手段對這些菌株進行了初步鑒定，其中大部分菌株屬于子囊菌(Ascomycetes)，包括Cladosporiumsp.，Exophialasp.，Cladophialophorasp.，Phialophorasp.，Leptodontidiumsp.和Paraphomasp.，此外還有一些菌株分類地位尚不明確；在已經(jīng)鑒定到屬的菌株中，優(yōu)勢屬為Phialophorasp.。張燕[27]對云南蘭坪-會澤鉛鋅礦區(qū)特殊生境中植物根內(nèi)的DSE定殖情況進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)DSE普遍定殖于該區(qū)域植物根內(nèi)；對分離菌株的分子生物學鑒定表明，分離自會澤礦區(qū)植物根內(nèi)的菌株以Exophilasp.和Phialophorasp.為主，蘭坪礦區(qū)植物根內(nèi)的DSE則以Phialophorasp.和Lophiostomasp.為主；這兩個區(qū)域植物根內(nèi)DSE的優(yōu)勢類群區(qū)別于西雙版納熱帶雨林植物根內(nèi)DSE的優(yōu)勢類群(Colletotrichumsp.，Ochroconissp.和Phomasp.)；DSE重金屬抗性研究表明大部分菌株對Pb、Zn和鎘(Cd)都具有一定的抗性，也不乏高抗菌株，為從重金屬污染區(qū)的DSE中發(fā)掘抗性基因提供了菌種資源。蔚杰等[28]從河北峰峰礦區(qū)冬青和構(gòu)樹根內(nèi)分離鑒定了8種DSE，Acrocalymmavagum，Scytalidiumlignicola，Nothophomaquercina，Cochlioboluslunatus，F(xiàn)usariumacuminatum，Neonectriaradicicola，Pyrenochaetopsisindica和Pleosporalessp.，優(yōu)勢種為Acrocalymmavagum，Scytalidiumlignicola和Fusariumacuminatum，分離頻率分別達到37.6%，17.43%和11.93%。

由表1金屬礦區(qū)植物內(nèi)生菌群落組成比較可知，金屬礦區(qū)植物內(nèi)生菌群落組成隨植物種類、礦區(qū)生境及重金屬污染類型的變化而差異明顯。內(nèi)生細菌定殖率較高者為變形菌門(Proteobacteria)細菌，主要有芽孢桿菌(Bacillussp.)和假單胞菌(Pseudomonassp.)；內(nèi)生放線菌的主要類群為鏈霉菌(Streptomycessp.)；內(nèi)生真菌中鏈格孢屬(Alternariasp.)和曲霉屬(Aspergillussp.)分布較廣；DSE定殖率較高者為子囊菌門(Ascomycetes)真菌，其中瓶霉屬(Phialophorasp.)分布較廣。

2 礦區(qū)植物內(nèi)生菌生態(tài)分布規(guī)律

樊妙春[29]分析了鉛鋅礦區(qū)豆科植物刺槐與其根圍、根際、根內(nèi)和根瘤中微生物之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)在重金屬污染土壤中，微生物群落結(jié)構(gòu)主要取決于其所處生態(tài)位，來自根際土壤、根內(nèi)和根瘤的微生物類群會明顯的聚類。主成分分析顯示，生態(tài)位對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響有最大權(quán)重，污染程度的權(quán)重則較??；與根內(nèi)和根瘤中的微生物相比，污染程度對根際和根周土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)影響更大；

表1 金屬礦區(qū)植物內(nèi)生菌群落組成比較Table 1 Comparison of community composition of endophytes in metal mining areas

刺槐根內(nèi)和根瘤中微生物的定殖是一個生態(tài)位選擇的過程，植物可以選擇具有特定功能的微生物來占據(jù)根和根瘤的生態(tài)位，如根瘤中以固氮能力為主而根內(nèi)則有多種代謝功能，并且這兩個生態(tài)位對微生物的選擇過程是相對獨立的。而陳亮[17]通過對龍葵根和莖中內(nèi)生細菌克隆子序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析比較，發(fā)現(xiàn)龍葵根和莖中的內(nèi)生細菌種類存在差異，認為不同的內(nèi)生細菌通過自身定殖能力主動占據(jù)不同的生態(tài)位。因此，植物與其內(nèi)生菌之間的相互選擇理論存在主動和被動關(guān)系的差異，一種觀點認為植物基于功能需求主動選擇內(nèi)生菌，而另一種觀點認為內(nèi)生菌通過競爭主動選擇植物體內(nèi)的生態(tài)位。也有研究認為群落中不同植物之間對內(nèi)生細菌的類群也有影響。王義聰[3]研究發(fā)現(xiàn)變形菌門在鉛鋅礦區(qū)礦渣堆單優(yōu)群落的紫莖澤蘭根內(nèi)并非最優(yōu)勢類群，而紫莖澤蘭與蒙自榿木混生之后，變形菌門成為最優(yōu)勢類群，可能是由于蒙自榿木與紫莖澤蘭相互影響所導致的。

研究普遍發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫導致植物內(nèi)生菌的多樣性下降。陳誠[18]調(diào)查了攀枝花礦區(qū)四種常見植物牛筋草、紫莖澤蘭、劍麻和花蔓草內(nèi)生菌的物種多樣性，其中內(nèi)生細菌多樣性受Cu、Zn、砷(As)和鎳(Ni)的負向影響，內(nèi)生真菌多樣性受Ni和Cd的負向影響，內(nèi)生放線菌多樣性受鉻(Cr)、Cu、Cd、As和Ni的負向影響。鄭有坤等[19]研究發(fā)現(xiàn)鉛鋅礦區(qū)重金屬的累積影響了蜈蚣草內(nèi)生放線菌的分布，蜈蚣草內(nèi)生放線菌多樣性指數(shù)與Cu、Cd和Pb的含量之間存在顯著負相關(guān)。但是也有研究發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫的增加導致植物內(nèi)生菌多樣性增加[6]。陳亮[17]研究發(fā)現(xiàn)不同重金屬污染水平會導致龍葵體內(nèi)呈現(xiàn)不同的內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)和組成，隨著重金屬污染程度的加劇會使有的物種消失，但也會使一些有重金屬耐性的菌群呈現(xiàn)增加趨勢。

重金屬脅迫之外的環(huán)境因子對植物與內(nèi)生菌相互關(guān)系的影響較為復雜。海金沙分布在不同鉀礦區(qū)，其內(nèi)生真菌出現(xiàn)頻率存在差異，各礦區(qū)內(nèi)生真菌群落之間的相似性低；鉀礦區(qū)海金沙內(nèi)生真菌出現(xiàn)頻率高于非鉀礦區(qū)；形成內(nèi)生真菌分布差異性與不同地理位置、氣候因素、土壤理化性質(zhì)和宿主植物組織的生理狀況以及化學組成變化等密切相關(guān)[30]。張杰[20]發(fā)現(xiàn)不同樣地分離的DSE的種類分布不同，這可能跟每個地區(qū)的植物種類分布不同有關(guān)，也可能受土壤重金屬含量及其他理化性質(zhì)的影響。崔洪亮[24]從蒙自榿木根內(nèi)分離得到了153株內(nèi)生真菌，分離自重金屬嚴重污染區(qū)域和輕度污染區(qū)域的DSE菌株中都存在Cd高抗和敏感菌株，但來自重度污染區(qū)的DSE菌株Cd抗性普遍高于輕度污染區(qū)的菌株。蔚杰等[28]研究了河北峰峰礦區(qū)DSE定殖及其群落組成，發(fā)現(xiàn)冬青和構(gòu)樹根系均能被DSE高度侵染，形成典型深色有隔菌絲和微菌核結(jié)構(gòu)。微菌核定殖率與土壤速效氮顯著負相關(guān)，菌絲定殖率與土壤全磷顯著正相關(guān)；總定殖率與土壤全磷顯著正相關(guān)，與重金屬Zn顯著負相關(guān)；定殖強度與土壤有機質(zhì)顯著負相關(guān)，與土壤全磷顯著正相關(guān)；同一植物不同樣地DSE群落組成差異顯著(P< 0.05)。

3 礦區(qū)植物與內(nèi)生菌互作機理研究

內(nèi)生菌與礦區(qū)植物相互作用的過程中，對植物的積極影響主要有促進植物生長，改善植物生長環(huán)境，提高植物對脅迫的耐受性，提高植物在生境的競爭優(yōu)勢等方面。劉軍生等[16]從秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)內(nèi)優(yōu)勢植物杠柳和草木樨的內(nèi)生細菌中篩選出具有較高鎘抗性的11株內(nèi)生細菌，均具有鐵載體活性和ACC脫氨酶活性，其中7株內(nèi)生細菌有IAA活性。柳若霖[6]從金昌鎳銅礦區(qū)6種植物體內(nèi)分離得到44株內(nèi)生菌，篩選出18株對Cu和Ni抗性較高的菌株并測定其促生特性。其中，具備溶磷能力的有13株，所有菌株均可產(chǎn)生IAA，能夠代謝ACC的有3株，對Cu、Ni具有活化能力的各2株。IAA可以促進植物生長，鐵載體可以螯合重金屬改善植物生長環(huán)境，ACC脫氨酶可以減少重金屬對植物的脅迫傷害而提高植物對脅迫的耐受性。陳亮[17]從生長于重金屬礦區(qū)的超累積植物龍葵體內(nèi)分離篩選出功能內(nèi)生菌株。對龍葵幼苗的侵染實驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌株的單個功能特性與龍葵幼苗生長參數(shù)之間并沒有明顯的相關(guān)性。但當某菌株同時具備多種功能特性時則對幼苗的生長發(fā)育具有顯著的促進作用，包括產(chǎn)IAA和鐵載體以及具有ACC脫氨酶能力、固氮和解磷能力；接種一株能同時產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)生表面活性劑和代謝產(chǎn)酸功能的內(nèi)生細菌Lk9能夠改善土壤中鐵和磷等礦質(zhì)營養(yǎng)元素的供應，提高土壤中重金屬的生物可利用性，以及影響龍葵根系低分子量有機酸的分泌，顯著增加了龍葵地上部生物量(提高了14%)和重金屬的累積(Cd、Zn和Cu的累積量分別提高了46.6%，16.4%和16%)；在聯(lián)合修復過程中Lk9和龍葵的相互作用影響了土壤微生物性質(zhì)及功能，如提高了修復土壤的微生物量(如微生物量碳提高了39.2%)以及土壤酶活(如酸性磷酸酶活性提高了28.6%)，這對改善土壤肥力及其生態(tài)功能的恢復具有重要意義。

云南省瀾滄縣募乃鉛鋅礦區(qū)礦渣堆上自然生長的優(yōu)勢植物紫莖澤蘭依靠在體內(nèi)積累31.93%～40.39%當?shù)夭≡毦鶦andidatusPhytoplasma來提高自身在當?shù)氐母偁巸?yōu)勢，而在同一生境自然生長的優(yōu)勢植物蒙自榿木根內(nèi)(積累了1.32%)和藎草根內(nèi)(積累了3.08%)卻很少發(fā)現(xiàn)，成為入侵植物“積累當?shù)夭≡⑸锛僬f”的例證之一[3]?？涤頪26]研究發(fā)現(xiàn)接種DSE可提高盆栽的鉛鋅礦區(qū)優(yōu)勢植物紫莖澤蘭的超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)的活性，減小氧化損傷，從而增強其對Cd的抗性。DSE在植物根內(nèi)定殖，有可能通過菌絲體對金屬離子的固持作用緩解植物根圍土壤微環(huán)境中超量金屬離子對植物的毒害作用[31]。湛方棟[32]從重金屬嚴重污染的云南會澤鉛鋅礦區(qū)自然生長的密序野古草根內(nèi)分離得到DSE嗜魚外瓶霉(ExophialapisciphilaACCC32496)，分析了E.pisciphila對Cd的富集特征和耐性機制，發(fā)現(xiàn)E.pisciphila對Cd的耐性機制包括胞外機制和胞內(nèi)機制。胞外機制有三個方面，一是增加低分子量有機酸尤其是草酸的分泌；二是通過菌絲細胞壁上氨基、酰氨基、羧基、羥基和磷?；然瘜W基團對Cd進行吸附；三是增加細胞壁上特殊組分黑色素的合成。胞內(nèi)機制有兩個方面，一是通過增強菌絲細胞內(nèi)SOD、過氧化氫酶(Catalase，CAT)等抗氧化酶的活性，及增加谷胱甘肽(Glutathione，GSH)等巰基化合物的合成，以抑制Cd脅迫下超氧陰離子、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和H2O2含量顯著增加造成的氧化損傷；二是提高菌絲中磷、硫、鎂和鈣等礦質(zhì)元素的含量，提高E.pisciphila對Cd的耐受能力。通過胞外和胞內(nèi)耐受、富集機制，DSE菌絲可以吸附、固定Cd，提高宿主植物耐受Cd的能力。

4 內(nèi)生菌在礦區(qū)污染植物修復中的應用探索

早在2001年，馬彥卿[33]就通過對比研究提出，向新種植的植物接種固氮菌、磷細菌、鉀細菌和內(nèi)生菌等微生物，可使失去微生物活性的復墾礦區(qū)土壤重新建立和恢復土壤微生物體系，加速復墾土地土壤的基質(zhì)改良和植被重建。重建植被是解決金屬尾礦廢棄地環(huán)境問題的最佳選擇之一[26]。植物的生物量決定了植物對重金屬污染土壤的修復效率和修復效果[34]。大量關(guān)于內(nèi)生菌與植物聯(lián)合修復重金屬污染的研究表明，內(nèi)生菌不僅可以促進植物的生長發(fā)育，還可以幫助植物提取土壤中的重金屬，進而修復重金屬污染土壤[35]。劉莉華[2]從Cd超富集植物龍葵體內(nèi)分離得到5株內(nèi)生細菌N1、N2、N4、DE2和DE5，開展聯(lián)合盆栽試驗。在龍葵根際土壤分別接入Cd抗性內(nèi)生菌N1、N2和N4，結(jié)果顯示接入內(nèi)生菌對Cd污染環(huán)境中龍葵的生長和Cd富集具有明顯的促進作用，且混和菌株效果優(yōu)于單菌株，差異顯著。陳亮[17]將篩選的具有促生功能的內(nèi)生菌再接種龍葵提高了其修復Cd污染土壤的效率，在緩解Cd脅迫增加龍葵生物量的同時也促進了龍葵對Cd的吸收。王璐[34]從蘇丹草體內(nèi)篩選到一株具有Cu抗性的內(nèi)生促生細菌EnterobacteraerogenesK3-2，通過盆栽試驗研究不同Cu污染水平下K3-2對蘇丹草生長和富集Cu的影響。結(jié)果表明，K3-2能顯著促進蘇丹草的生長，活化土壤中的Cu，強化蘇丹草對Cu的吸收?？涤頪26]從云南瀾滄縣竹塘鄉(xiāng)募乃老廠鉛鋅礦尾礦地自然生長的植物體內(nèi)分離獲得一株DSE H84-1，分子生物學技術(shù)鑒定為嗜魚外瓶霉(Exophialapisciphila)，在純培養(yǎng)條件下其對Cd表現(xiàn)出較高的耐性；在Cd脅迫下用H84-1接種盆栽紫莖澤蘭，DSE能在紫莖澤蘭根系上成功定殖，DSE的侵染程度隨著Cd濃度的升高而增大；Cd污染對紫莖澤蘭的生長產(chǎn)生負向影響，隨基質(zhì)中Cd濃度增加，紫莖澤蘭生物量下降，接種DSE并不能改變這種趨勢，而與對照相比，接種DSE能增加紫莖澤蘭地上和地下部分生物量；無論接種與否，紫莖澤蘭吸收Cd后主要在根部積累，而且隨基質(zhì)中Cd濃度的增加，紫莖澤蘭地上和地下部分Cd濃度也隨之增加。與對照相比，接種DSE增加了紫莖澤蘭吸收Cd的趨勢；接種DSE能夠顯著增強紫莖澤蘭對Cd的富集能力，其富集系數(shù)是對照的兩倍多。張杰[20]在不同濃度Cd脅迫下給玉米接種分離自重金屬礦區(qū)的DSE菌株Cladosporiumsp. z113。z113表現(xiàn)出良好的接種效應，提高了玉米的生物量，并增強了其對重金屬的耐性，把重金屬固持在玉米根部從而減輕玉米植株受重金屬毒害，降低了玉米對重金屬的吸收。

此外，從礦區(qū)植物體內(nèi)分離獲得內(nèi)生菌應用于作物促生的研究亦有報道。詹壽發(fā)等[36]從鉀礦區(qū)優(yōu)勢蕨類植物芒萁內(nèi)生真菌中篩選出具溶磷、解鉀、分泌IAA功能的菌株泡盛曲霉(Aspergillusawamori)和黑曲霉(Aspergillusniger)，并采用回接及盆栽試驗研究它們對玉米幼苗的促生作用，發(fā)現(xiàn)回接內(nèi)生菌株能有效提高玉米植株體內(nèi)葉綠素及磷和鉀的含量，對玉米幼苗生長有明顯的促進作用。劉軍生等[16]從秦嶺鉛鋅尾礦區(qū)內(nèi)優(yōu)勢植物杠柳內(nèi)生細菌中篩選出Cd去除率最高，IAA、鐵載體和ACC脫氨酶活性最佳的菌株GR44，在小麥盆栽試驗中能顯著提高小麥幼苗的耐鎘能力(P< 0.05)。任麗婷[35]從金昌鎳銅礦區(qū)植物體內(nèi)分離出的內(nèi)生細菌N1(泛菌屬)和W1(假單胞菌屬)，以及兩者的混合菌液，均可以促進重金屬復合污染土壤中油葵的生長發(fā)育，提高油葵的重金屬耐受性，強化油葵對重金屬的富集及轉(zhuǎn)運能力。

5 礦區(qū)植物內(nèi)生菌研究結(jié)論

金屬礦區(qū)植物內(nèi)生菌群落組成隨植物種類、礦區(qū)生境及重金屬污染類型的變化而差異明顯。內(nèi)生細菌定殖率較高者為變形菌門(Proteobacteria)細菌，主要有芽孢桿菌(Bacillussp.)和假單胞菌(Pseudomonassp.)；內(nèi)生放線菌的主要類群為鏈霉菌(Streptomycessp.)；內(nèi)生真菌中鏈格孢屬(Alternariasp.)和曲霉屬(Aspergillussp.)分布較廣；DSE定殖率較高者為子囊菌門(Ascomycetes)真菌，其中瓶霉屬(Phialophorasp.)分布較廣。研究發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫導致植物內(nèi)生菌的多樣性下降，重金屬脅迫之外的環(huán)境因子對植物與內(nèi)生菌相互關(guān)系的影響較為復雜。內(nèi)生菌與礦區(qū)植物相互作用的過程中，對植物的積極影響主要有促進植物生長，改善植物生長環(huán)境，提高植物對脅迫的耐受性，提高植物在生境的競爭優(yōu)勢等方面。

6 礦區(qū)植物內(nèi)生菌資源研究的不足及展望

相對于礦區(qū)植物內(nèi)生真菌，內(nèi)生細菌的研究相對較少，獨立地對內(nèi)生放線菌類群進行調(diào)查分析的最少。但是，內(nèi)生細菌和內(nèi)生放線菌與內(nèi)生真菌一樣，均具有潛在的植物促生和植物修復輔助價值，值得給予更多的關(guān)注。

從礦物植物體內(nèi)分離內(nèi)生菌株回接(反接或回殖)及盆栽試驗研究較多，但真正應用于礦區(qū)植物修復的原位試驗很少，尚未形成有效的技術(shù)手段和操作模式，是未來礦區(qū)植物內(nèi)生菌研究和應用中有廣闊前景的發(fā)展方向。

內(nèi)生菌耐受功能基因、降解功能基因、轉(zhuǎn)化污染物功能基因及促生功能基因的發(fā)掘，及其在植物體內(nèi)的有效轉(zhuǎn)化和在植物修復中的應用研究仍然很少，內(nèi)生菌功能基因克隆及其轉(zhuǎn)化植物有望成為礦區(qū)植物內(nèi)生菌資源開發(fā)研究新的生長點。因為內(nèi)生菌長期生活在植物體內(nèi)，能夠在植物體內(nèi)穩(wěn)定的生長和進行代謝活動，因此內(nèi)生菌可以作為礦區(qū)植物細胞和分子水平改造，用于生物修復和生物防治等生物工程操作技術(shù)中外源基因的載體。

礦區(qū)及其自然生長的植物作為特殊生境和特殊宿主，蘊含的內(nèi)生菌資源必然有特殊的生理生態(tài)功能、代謝途徑和生理活性代謝產(chǎn)物，其在生物防治和藥物開發(fā)方面的潛力還有待挖掘。