蘇木乙酸乙酯提取液通過(guò)miRNA-129-5p/Beclin1信號(hào)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響*

李鑫峰 袁星星 周亞濱 楊建飛 王 倩

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；4.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是缺血性心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為大中動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)的脂質(zhì)堆積，促使管壁斑塊形成、壞死、彈性降低，最終引起管腔狹窄或者阻塞的一類血管炎性疾?。?-2］。既往研究認(rèn)為AS主要與脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血小板激活、血管平滑肌細(xì)胞激活及免疫功能異常等因素有關(guān)［3］。然而近年來(lái)越來(lái)越多的研究關(guān)注到內(nèi)皮細(xì)胞損傷在早期AS中的作用，因此修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)于防治AS具有重要的意義。細(xì)胞自噬是真核生物內(nèi)廣泛存在的一種自穩(wěn)機(jī)制，其主要通過(guò)清除生物體內(nèi)功能異常的細(xì)胞器、被氧化的脂質(zhì)及錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)等有害大分子物質(zhì)以維持細(xì)胞的正常功能。內(nèi)皮細(xì)胞自噬已被證實(shí)在AS發(fā)生初期起到了關(guān)鍵性的作用，自噬能夠增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激損傷的能力和抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減緩斑塊的形成［4］。課題組前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘇木乙酸乙酯提取液（SAEE）能夠通過(guò)抗炎、免疫調(diào)控、抑制脂質(zhì)沉積和增加斑塊穩(wěn)定性等方面發(fā)揮抑制AS的作用［5-8］。同時(shí)，筆者研究發(fā)現(xiàn)SAEE能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬進(jìn)而抑制高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠證實(shí)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成和脂質(zhì)蓄積。為進(jìn)一步研究SAEE促進(jìn)自噬的機(jī)制，本研究通過(guò)觀察SAEE對(duì)氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中自噬水平及miRNA-129-5p/Beclin1信號(hào)影響，以期進(jìn)一步明確SAEE抑制AS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC）購(gòu)自武漢佰仟度生物科技有限公司，該細(xì)胞株由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心引進(jìn)。

1.2 藥物與試劑

ox-LDL購(gòu)自北京索萊寶公司（貨號(hào)：H7980）；蘇木生藥購(gòu)自貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，經(jīng)乙醇浸泡等工序，合并后的濾水浴蒸干，制備乙醇提取干粉。經(jīng)乙酸乙酯萃取后，所得溶液即為SAEE（純度98%）。MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)分別為C0009和A0208）；RPMI 1640、10%胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素混合液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司（貨號(hào)分別為A4192301，16140071和10378016）；兔抗Beclin1、LC3B和GAPDH單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司（貨號(hào)分別為ab210498，ab192890和ab8245）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)RR047A）；RNA提取試劑盒和SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司（貨號(hào)分別為15596026和A25742）；雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒載體psi CHECK2購(gòu)于美國(guó)Promega公司（批號(hào)1908319）；miRNA-129-5p mimics和miRNA-129-5p NC由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成（批號(hào)191019）。

1.3 分組及干預(yù)

HUVEC放入含10%胎牛血清、100 μg/mL青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中。HUVEC以2×105個(gè)細(xì)胞數(shù)種于100 mm培養(yǎng)皿中，分為空白組、模型組、SAEE組、模擬劑組及SAEE+模擬劑組，其中除空白組外，其余組參照文獻(xiàn)［9］中方法采用100 μg/mL ox-LDL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。此外，模擬劑組及SAEE+模擬劑組分別參照試劑說(shuō)明書(shū)要求，轉(zhuǎn)染100 nmoL miR-129-5p至細(xì)胞，SAEE組和SAEE+模擬劑組加入200 μg/mL SAEE進(jìn)行干預(yù)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 分別于培養(yǎng)12、24、48 h的各組細(xì)胞中加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)基后加入150 μL DMSO溶液，在酶標(biāo)儀上于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（A），并計(jì)算細(xì)胞活性。

1.4.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 于48 h收集各組細(xì)胞，于倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)及密度的變化。

1.4.3 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miRNA-129-5p和Beclin1的結(jié)合活性 基于TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)Beclin1與miR-129-5p的結(jié)合位點(diǎn)，將Beclin1中miR-129-5p結(jié)合位點(diǎn)的3′UTR的基因片段，插入psi CHECK2載體后構(gòu)建Beclin1 3′UTR野生型質(zhì)粒，同時(shí)利用基因位點(diǎn)突變構(gòu)建Beclin1 3′UTR突變質(zhì)粒后，采用RT-PCR驗(yàn)證。用WT質(zhì)粒/MUT質(zhì)粒和miR-129-5p mimics NC/miR-129-5p mimics分別對(duì)HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后提取細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，10 000×g離心5 min，取上清。參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明分別檢測(cè)海腎熒光素酶和螢火蟲(chóng)熒光素酶的活性，通過(guò)兩者比值計(jì)算其相對(duì)熒光素酶活性。

1.4.4 RT-PCR法檢測(cè)miRNA-129-5p及Beclin1 mRNA的表達(dá) 于48 h收集各組HUVEC細(xì)胞，分別采用相應(yīng)的試劑盒提取細(xì)胞中總RNA或miRNA，核酸檢測(cè)儀測(cè)定濃度，并在每個(gè)樣本中取1 μg的RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行cDNA的合成。在PCR條件下分別為85 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，40個(gè)周期60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，以U6作為參照測(cè)定miR-129-5p表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參測(cè)定 Beclin1 mRNA 水平，用 2-ΔΔCt法計(jì)算樣品中相應(yīng)基因的表達(dá)水平的變化。各實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔，重復(fù)3次。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR中的PCR反應(yīng)引物

1.4.5 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自噬水平 于48 h收集各組細(xì)胞，PBS清洗，3%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，梯度酒精、丙酮脫水，包埋，50 nm超薄切片。置于銅網(wǎng)以3%檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自噬水平。

1.4.6 Western blotting檢測(cè)Beclin1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表達(dá) 于48 h收集各組HUVEC細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心收集上清，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋后的一抗：Beclin1（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。加入稀釋后的二抗，室溫下孵育1 h。待ECL試劑盒顯色后，以凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。采用Image J對(duì)目的條帶和GAPDH條帶灰度值的比值進(jìn)行處理，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，組間比較采用最小顯著性差異法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組HUVEC細(xì)胞增殖情況比較

見(jiàn)表2。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，各組細(xì)胞12 h時(shí)OD值無(wú)明顯差異。培養(yǎng)24、48 h后，模型組OD值明顯低于空白組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，SAEE能夠顯著促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖，而miRNA-129-5p模擬劑顯著抑制HUVEC細(xì)胞的增殖，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而SAEE+模擬劑組與模型組比較，OD值無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組細(xì)胞增殖情況比較（±s）

表2 各組細(xì)胞增殖情況比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組12 h 0.25±0.05 0.22±0.04*0.23±0.02△0.16±0.05△0.18±0.04 24 h 0.43±0.08 0.38±0.06*0.39±0.08△0.25±0.09△0.26±0.04 48 h 0.67±0.12 0.46±0.11*0.71±0.09△0.43±0.07△0.47±0.08

2.2 各組HUVEC細(xì)胞形態(tài)的比較

如圖1所示，空白組HUVEC細(xì)胞發(fā)育良好，呈橢圓或梭形，邊緣光滑，排列整齊。模型組細(xì)胞數(shù)量相比空白組明顯減少，可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片，細(xì)胞呈星形或長(zhǎng)梭形，且排列紊亂。SAEE組細(xì)胞形態(tài)、密度與排列相比模型組顯著改善，模擬劑組細(xì)胞損傷較模型組加重，SAEE+模擬劑組細(xì)胞形態(tài)及排列與模型組比較無(wú)明顯改善。

圖1 各組HUVEC細(xì)胞形態(tài)及密度的變化（100倍）

2.3各組miRNA-129-5p及Beclin1 mRNA表達(dá)的比較

雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染Beclin1-WT報(bào)告載體后，miRNA-129-5p mimic組的熒光素酶活性比miRNA-129-5p NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而共轉(zhuǎn)染Beclin1-MUT報(bào)告載體后，miRNA-129-5p mimic組熒光素酶活性與miRNA-129-5p NC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這表明Beclin1與miRNA-129-5p存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。見(jiàn)表3。與空白組相比，模型組miR-129-5p的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，SAEE組miR-129-5p的表達(dá)水平顯著下降，模擬劑組miR-129-5p的表達(dá)水平顯著上升，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），SAEE+模擬劑組miR-129-5p的表達(dá)水平與模型組無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而各組Beclin1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表3 各組miRNA-129-5p和Beclin1結(jié)合活性比較（±s）

表3 各組miRNA-129-5p和Beclin1結(jié)合活性比較（±s）

注：與miRNA-129-5p NC比較，*P＜0.05。

?

表4 各組細(xì)胞中miRNA-129-5p及Beclin1 mRNA表達(dá)的比較（±s）

表4 各組細(xì)胞中miRNA-129-5p及Beclin1 mRNA表達(dá)的比較（±s）

?

2.4 各組HUVEC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自噬水平的比較

透射電鏡結(jié)果顯示，空白組HUVEC細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，細(xì)胞核大，可見(jiàn)少量自噬體和自噬溶酶體。模型組出現(xiàn)少量空泡，胞質(zhì)變少，細(xì)胞核萎縮，可見(jiàn)自噬體數(shù)量增加和極少量自噬溶酶體。與模型組相比，SAEE組細(xì)胞形態(tài)明顯改善，同時(shí)自噬體和自噬溶酶體數(shù)量明顯增加，而模擬劑組細(xì)胞內(nèi)空泡增多，胞質(zhì)、細(xì)胞核萎縮情況加重，自噬體和自噬溶酶體數(shù)量明顯減少。此外，SAEE+模擬劑組與模型組比較，細(xì)胞形態(tài)、自噬體和自噬溶酶體數(shù)量無(wú)明顯變化。見(jiàn)圖2。

圖2 各組HUVEC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及自噬水平的比較（5 000倍，3%檸檬酸鉛+醋酸染色）

2.5 各組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

見(jiàn)表5，圖3。與空白組相比，模型組細(xì)胞中Beclin1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值無(wú)明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組相比，SAEE組細(xì)胞中Beclin1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值顯著增加，模擬劑組中細(xì)胞中Beclin1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而SAEE+模擬劑組與模型組比較，Beclin1蛋白和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組細(xì)胞中miR-129-5p/Beclin1通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

表5 各組細(xì)胞中miR-129-5p/Beclin1通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的比較（±s）

組別空白組模型組SAEE組模擬劑組SAEE+模擬劑組Beclin1/GAPDH 0.82±0.11 0.85±0.09 1.24±0.12△0.59±0.05△0.79±0.15 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.45±0.07 0.52±0.05 0.71±0.13△0.34±0.02△0.56±0.08

圖3 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞損傷已被證實(shí)參與AS啟動(dòng)及進(jìn)展的全過(guò)程，其可通過(guò)白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附，繼而造成動(dòng)脈血管攣縮、血小板凝聚、氧化應(yīng)激等病理變化［10］。動(dòng)脈血管受到外界刺激后，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，異常分泌ICAM-1和VCAM-1等黏附因子，造成游離單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞表面，逐漸聚集形成AS斑塊。此外，大量凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量急劇下降，造成內(nèi)皮通透性發(fā)生改變并導(dǎo)致血管內(nèi)膜損傷，而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖可顯著抑制AS斑塊的形成［11-13］。

自噬作為細(xì)胞基礎(chǔ)代謝過(guò)程，對(duì)基因的調(diào)控具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬對(duì)AS具有保護(hù)作用［14］。當(dāng)自噬功能受損，炎性反應(yīng)被激活，可加速AS進(jìn)展［15］。自噬作為一種自我防御及保護(hù)機(jī)制，能夠有效清除受損細(xì)胞，降低內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及壞死［16］。此外，自噬能夠增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，延緩AS斑塊形成。在自噬過(guò)程中，LC3前體經(jīng)過(guò)處理變成可溶性LC3Ⅰ，再經(jīng)過(guò)泛素樣加工修飾為L(zhǎng)C3Ⅱ，LC3Ⅱ在自噬泡形成和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，廣泛存在于自噬體胞膜內(nèi)，研究表明LC3Ⅱ的表達(dá)與自噬泡數(shù)量呈正比，可將LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值作為觀察細(xì)胞自噬強(qiáng)度的可靠指標(biāo)［17］。

MiRNA在AS的進(jìn)程中意義重大。作為內(nèi)源表達(dá)非編碼小分子RNA，其表達(dá)的改變會(huì)影響內(nèi)皮細(xì)胞功能［18］。此外，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移同樣受到miRNA調(diào)控［19］。在諸多miRNA表達(dá)中，miR-129-5p與內(nèi)皮細(xì)胞自噬關(guān)系密切，miR-129-5p過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞輻射誘導(dǎo)自噬［20］。本研究通過(guò)TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Beclin1是miR-129-5p的潛在靶基因。Beclin1是自噬啟動(dòng)基因，能夠參與誘導(dǎo)、生成及成熟全過(guò)程，具有直接或間接連接調(diào)控基因的作用，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞自噬及凋亡的意義重大［21-22］。Beclin 1參與觸發(fā)自噬體形成，與自噬表達(dá)程度呈正相關(guān)，因此成為衡量細(xì)胞自噬的常用指標(biāo)之一［23］。研究發(fā)現(xiàn)miR-129-5p的上調(diào)是通過(guò)抑制Beclin1的蛋白翻譯、抑制內(nèi)皮細(xì)胞自噬、延緩AS的進(jìn)展而實(shí)現(xiàn)的［24］。

本研究通過(guò)觀察miR-129-5p與內(nèi)皮細(xì)胞增殖、自噬的關(guān)系，探討其抑制AS的作用機(jī)制。研究通過(guò)ox-LDL誘導(dǎo)構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型并MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖發(fā)現(xiàn)12 h時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞活性無(wú)顯著性差異，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，SAEE能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，SAEE組細(xì)胞中miR-129-5p的表達(dá)水平顯著下降，而各組Beclin1 mRNA水平無(wú)明顯變化，但是Beclin1蛋白的表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值顯著增加，說(shuō)明miR-129-5p是通過(guò)調(diào)控Beclin1轉(zhuǎn)錄后的翻譯水平，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞自噬的作用。

綜上所述，SAEE可通過(guò)抑制miRNA-129-5p的表達(dá)促進(jìn)Beclin1基因轉(zhuǎn)錄后翻譯水平，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自噬，發(fā)揮抗AS的作用。