桃紅四物湯組方有效單體成分對(duì)早期骨折治療的量效關(guān)系研究*

余曉愉 熊 輝△ 周鈺健 楊 卓 周文佳 陸小龍

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.深圳寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 深圳 518000；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

在中醫(yī)學(xué)發(fā)展史進(jìn)程中，度量標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)歷了多次變化，這種變化使得中醫(yī)方藥的用量不能形成一個(gè)系統(tǒng)完整的理論體系，阻礙了中醫(yī)藥的現(xiàn)代化發(fā)展［1］。量效關(guān)系是指在一定范圍內(nèi)，藥物的作用效應(yīng)隨著劑量（或濃度）的變化而改變［2］，歷代醫(yī)家都在不停探索中藥的最佳量效關(guān)系，他們根據(jù)自己的臨床經(jīng)驗(yàn)以及對(duì)中藥量效關(guān)系的認(rèn)識(shí)，提出了各種不同的見解。有學(xué)者認(rèn)為以中醫(yī)基礎(chǔ)理論及方劑組方理論為基礎(chǔ)，闡明中藥的量－效關(guān)聯(lián)規(guī)律［3］。仝小林教授［4］曾經(jīng)提出以實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)研究并以臨床療效評(píng)價(jià)為中心的中藥量效關(guān)系研究模式。但無(wú)論是哪種研究方式，仍處于總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用于實(shí)踐的階段，成熟、科學(xué)的理論依據(jù)不能夠在臨床實(shí)踐中合理運(yùn)用，中醫(yī)藥臨床療效的提高受到制約。桃紅四物湯最早見于清代吳謙的《醫(yī)宗金鑒》，主要功用為活血化瘀，是治療骨折的常用方。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明，桃紅四物湯組方藥物主要水溶性有效單體成分組方與原方水煎劑均可促進(jìn)大鼠早期骨折愈合，縮短骨折愈合時(shí)間，治療早期骨折作用無(wú)明顯差異［5］，而桃紅四物湯原方存在量效關(guān)系，療效與劑量為正相關(guān)性［6］。本研究擬從不同劑量桃紅四物湯單體成分組方對(duì)大鼠早期骨折愈合的影響，探討其量效關(guān)系，為該方的進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)12周齡雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克京達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1107271911004705。湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)中心實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，室溫22～26℃，相對(duì)濕度35%～70%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 桃紅四物湯單體成分：苦杏仁苷，批號(hào)20190401，貨號(hào)A0093；羥基紅花黃色素A，批號(hào)20190508，貨號(hào)A0380；梓醇，批號(hào)20190102，貨號(hào)A0215；毛蕊花糖苷，批號(hào)20190301，貨號(hào)A0943；阿魏酸，批號(hào)20190303，貨號(hào) A0050；芍藥苷，批號(hào) 20190202，貨號(hào)A1298；川芎嗪，批號(hào)20190301，貨號(hào)A1088。單體成分均由成都曼斯特生物科技有限公司提供，按照藥典有效成分含量溶于水配成相應(yīng)濃度給藥。

1.3 試劑與儀器 水合氯醛，批號(hào)20XS09R25，貨號(hào)30037517，上海浦山化工有限公司；4%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液，批號(hào)D20092506，貨號(hào)AR1071，博士德生物公司；4%多聚甲醛，批號(hào)D20061401，貨號(hào)AR1068，博士德生物公司；鼠VEGF試劑盒，批號(hào)20190509，貨號(hào)69-35236，上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司；80萬(wàn)單位青霉素，批號(hào)2003104，貨號(hào)15140-122，華北制藥股份有限公司。ER－182 A型電子天平，日本AND公司；無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州市蘇杭科技器材有限公司；顯微鏡，日本Motic；RM2235石蠟切片機(jī)，德國(guó)LABSTAR；KDBM電腦生物組織包埋機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；電動(dòng)玻璃勻漿器，新芝有限公司。MoticBA600-4顯微攝像圖像分析系統(tǒng)，麥克奧迪實(shí)業(yè)公司；Image-Pro Plus圖像分析軟件，美國(guó)Image-Pro公司。

1.4 分組與造模 將90只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（正常對(duì)照）15只、模型制備組75只。造模方法［7］：使用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，待麻醉產(chǎn)生效應(yīng)后，將麻醉后的大鼠采用俯臥位的方式將其固定在無(wú)菌操作臺(tái)上，將大鼠左側(cè)大腿股外側(cè)充分暴露出來(lái)，清除大鼠的毛發(fā)后，然后進(jìn)行常規(guī)消毒；消毒后，用手術(shù)刀在大鼠左股外側(cè)作一3 cm左右縱向切口，向下逐層剝離各組織結(jié)構(gòu)，大鼠股外側(cè)肌進(jìn)行鈍性分離，上下推移股骨干使其充分顯露出來(lái)；使用骨鋸截?cái)喙晒歉芍卸危邢露斯瞧べ|(zhì)時(shí)用止血鉗折斷股骨干，使斷端保持其完整性；將一根直徑為1 mm的克氏針于斷端逆行插入股骨干近端，再?gòu)墓晒谴筠D(zhuǎn)子同一側(cè)方向穿出；當(dāng)骨折斷端復(fù)位后，沿克氏針方向順行穿回；術(shù)肢輕微活動(dòng)，當(dāng)復(fù)位完成后，剪除多余部分，縫合切口，造模完成。假手術(shù)組將對(duì)SD清潔級(jí)雄性大鼠只切開縫合不造模。進(jìn)行手術(shù)后，若觀察到股骨中段橫形骨折可認(rèn)為是骨折模型，發(fā)現(xiàn)大鼠粉碎性骨折則剔除，造模至所需樣本量，待大鼠恢復(fù)正常體溫后予以青霉素80萬(wàn)單位腹腔注射，每日1次，預(yù)防感染，連續(xù)給藥3 d。將造模后的75只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及單體成分組方低、中、高劑量組，每組15只。

1.5 給藥方法 按照60 kg成人與動(dòng)物體表面積換算公式［8］計(jì)算，大鼠每日給藥劑量為9 g/kg，即給予200 g體質(zhì)量大鼠每日1.8 g的劑量，設(shè)定量效比值（R為1∶3）分為3個(gè)梯度，分別為1∶3∶9，中劑量組作為成人等效劑量組，則3、9、27 g/kg對(duì)應(yīng)低、中、高劑量組?？瞻捉M、假手術(shù)組、模型組分別予以等體積生理鹽水灌胃。造模成功24 h內(nèi)開始第1次給藥，每日給藥時(shí)間相同，每日2次，灌胃間隔時(shí)間為8 h，連續(xù)灌胃14 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）大鼠給藥3、7、14 d后分組取材，每組每次隨機(jī)選擇5只大鼠，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，取出左側(cè)股骨置于4%多聚甲醛溶液中固定，固定處理后再浸泡于4%乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣。2）造模前、造模后3、7、14 d 4個(gè)時(shí)相點(diǎn)，取大鼠左側(cè)股骨中段同一部位，剃毛后然后用紅線包圍并標(biāo)記，用不銹鋼帶表卡尺測(cè)量做了標(biāo)記的紅線3次，取平均值。3）骨折早期斷端病理形態(tài)變化。標(biāo)本浸蠟3.5 h，石蠟包埋，切片，0.01 mol/L PBS緩沖液中沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，蘇木素-伊紅（HE）染色，封片，顯微鏡下觀察。4）血清血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）濃度檢測(cè)。造模后3、7、14 d使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）測(cè)血清VEGF的濃度，每組每次5只，取平均值。5）骨體積（BV）和骨性骨痂體積（TV）百分比（BV/TV%）檢測(cè)。通過(guò)Micro-CT進(jìn)行掃描，將造模后3、7、14 d大鼠股骨中段骨折位置和骨折處周圍的骨進(jìn)行三維重建分析，可測(cè)得BV和BV/TV百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。滿足正態(tài)分布者，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnet′s T3法檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布者用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 造模前，各組大鼠活動(dòng)自如，精神良好，飲食、二便正常。造模后，除空白組對(duì)照組外，其余各組大鼠在恢復(fù)體溫后均有活動(dòng)受限，精神狀態(tài)欠佳，飲食減少變化。單體成分組方各劑量組與模型組大鼠在術(shù)后則出現(xiàn)造模部位紅腫，局部膚溫升高，跛行等癥狀。灌胃開始后，模型組大鼠精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)未見明顯變化；單體成分組方低、中劑量組大鼠同給藥前相比，其一般情況均有不同程度的好轉(zhuǎn)；高劑量組大鼠精神與其余組相比精神狀態(tài)較亢奮，納食量及活動(dòng)、反應(yīng)力均有增加，表明在使用單體成分組方藥物灌胃能在一定程度上改善大鼠早期骨折的臨床癥狀。

2.2 各組大鼠肢體腫脹程度比較 見表1。在造模后2 h及3、7、14 d，測(cè)量大鼠肢體腫脹程度，在灌胃后3 d左右為測(cè)定肢體腫脹程度區(qū)間的峰值，隨后則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；與空白組比較，假手術(shù)組在3、7、14 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠肢體腫脹程度不明顯（P＞0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在3、7、14 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠肢體腫脹程度明顯（P＜0.01）；與模型組比較，各劑量組大鼠在3、7、14 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)肢體腫脹程度均有減輕，其中以高劑量減輕最為明顯（P＜0.05或P＜0.01）。提示單體成分組方具有消除大鼠早期骨折肢體腫脹的作用，量效呈正相關(guān)，高劑量組效果最好。

表1 各組大鼠肢體腫脹程度比較（cm，±s）

表1 各組大鼠肢體腫脹程度比較（cm，±s）

注：與空白組比較，☆P＜0.01，☆☆P ＜0.05；與假手術(shù)組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.01，△△P＜0.05；與低劑量組比較，★P＜0.01，★★P＜0.05。下同。

組別空白組假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 5 5 5 5 5 5造模后2 h 4.043±0.102 4.150±0.203 4.934±0.135*4.896±0.129 4.616±0.071△△★★4.581±0.024△△★灌胃3 d 4.073±0.112 4.142±0.209 5.729±0.279*5.443±0.181△△5.0715±0.106△△★★4.871±0.100△★灌胃7 d 4.704±0.100 4.143±0.210 5.464±0.155*5.273±0.094△△4.972±0.132△△★★4.510±0.186△★灌胃14 d 4.170±0.113 4.145±0.149 5.349±0.104*5.043±0.110△△4.616±0.124△△★★4.171±0.140△★

2.3 各組大鼠血清VEGF含量比較 見表2。與空白組比較，假手術(shù)組在3、7、14 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠血清VEGF濃度表達(dá)均有所增加（P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組在3、7、14 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠血清VEGF濃度表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各劑量組在3、7、14 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠血清VEGF濃度表達(dá)均有明顯增加，其中以高劑量增加最為明顯（P＜0.05或P＜0.01）。說(shuō)明單體成分組方能夠促進(jìn)血清中VEGF的表達(dá)，從而加速早期骨折的愈合，量效呈正相關(guān)。

表2 各組大鼠血清VEGF含量比較（ng/L，±s）

表2 各組大鼠血清VEGF含量比較（ng/L，±s）

組別空白組假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 5 5 5 5 5 5灌胃3 d 106.240±6.651 111.290±6.820☆☆125.320±5.010*137.780±5.900**149.01±9.492**△★★163.010±7.391*△★灌胃7 d 110.062±9.114 115.101±8.294☆☆138.502±5.704*149.404±4.705**159.984±9.424**△★★180.104±5.805*△★灌胃14 d 107.332±6.445 108.550±7.219☆☆152.292±6.249*164.245±7.020**175.540±8.229**△★★202.016±8.940*△★

2.4 各組大鼠骨體積（BV）值、大鼠骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）值比較 見表3，圖1。與模型組比較，單體成分組方各劑量組在3、7、14 d 3個(gè)時(shí)相點(diǎn)大鼠BV值、BV/TV值均有所增加，其中均以高劑量組增加最為明顯（P＜0.05或P＜0.01），低、中劑量組間差異不明顯。

表3 各組大鼠BV值、BV/TV比值比較（±s）

表3 各組大鼠BV值、BV/TV比值比較（±s）

組別模型組（n=5）低劑量組（n=5）中劑量組（n=5）高劑量組（n=5）時(shí)間灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d BV值37.397±2.270 42.159±3.129 51.259±4.029 44.340±3.279△△54.316±2.850△△64.392±2.900△△46.259±4.640△△55.501±2.995△△68.620±3.690△△51.407±3.104△★★62.605±3.702△★★74.625±4.159△★★BV/TV比值0.020±0.534 0.200±0.051 0.172±0.0 52 0.238±0.764△△0.345±0.017△△0.443±0.076△△0.273±0.447△△0.447±0.014△△0.501±0.015△△0.376±0.053△★★0.741±0.046△★★0.841±0.448△★★

圖1 術(shù)后大鼠股骨顯微Micro-CT圖像

2.5 各組大鼠組織病理學(xué)分析結(jié)果 病理切片結(jié)果顯示：空白組和假手術(shù)組大鼠骨皮質(zhì)連續(xù)，與骨小梁互相連接形成海綿狀向骨髓腔延伸，骨小梁間充于骨髓（見圖2 A、B）；灌胃3 d后，可見模型組骨折斷端骨皮質(zhì)不連續(xù)，局部骨組織壞死（見圖2 C1）；3個(gè)給藥組血腫機(jī)化，出現(xiàn)少量的軟骨、成骨、破骨細(xì)胞及肉芽組織，骨折斷端開始連接（見圖2 D1、E1、F1）；灌胃7 d，模型組骨折斷端開始初步連接，可見少量軟骨細(xì)胞及肉芽組織形成（見圖2 C2）；各劑量組則可見到不同程度軟骨細(xì)胞骨化、鈣化，骨痂及骨髓腔形成，其中高劑量組已出現(xiàn)少量骨小梁（見圖2 D2、E2、F2）；灌胃14 d，模型組軟骨細(xì)胞進(jìn)一步增多，已可見少量纖維骨痂和軟骨痂，少量骨小梁，無(wú)環(huán)狀骨痂及骨髓腔形成；3個(gè)給藥組大量軟骨痂鈣化，可見新生骨髓腔，平行于股骨縱軸、排列規(guī)則且致密的新生骨小梁數(shù)量逐漸增加，以高劑量組最為顯著（見圖2 D3、E3、F3）。

圖2 術(shù)后大鼠股骨切片（HE染色，40倍）

3 討論

骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，其最基本的過(guò)程為骨折部位募集祖細(xì)胞形成初始軟骨痂，經(jīng)過(guò)血管再吸收、骨形成和骨化后骨折愈合［9］。骨折斷端血管生成是促進(jìn)骨折愈合的重要因素，而骨折斷端血運(yùn)被阻斷，血管生成速度緩慢且不連續(xù)，這是臨床治療骨折最需要攻克的兩大難題［10］。VEGF能夠促進(jìn)骨折斷端血液循環(huán)中內(nèi)皮細(xì)胞分化增長(zhǎng)，并提供氧氣、養(yǎng)料，從而加速血管生成速度，骨折斷端血運(yùn)得以重建，初步連接骨折斷端［11］。VEGF還能通過(guò)協(xié)調(diào)各類骨細(xì)胞，激發(fā)其運(yùn)動(dòng)分化功能，從而促進(jìn)創(chuàng)傷性骨折的修復(fù)與愈合［12-14］。VEGF的表達(dá)和生成受多種細(xì)胞影響，原始骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞受到刺激后會(huì)分泌促血管生成因子，其中就包括VEGF，其中成骨細(xì)胞是VEGF的主要來(lái)源之一［15］。課題組前期研究表明單體成分組方能夠顯著提高VEGF的表達(dá)，促進(jìn)骨折斷端血管新生，同時(shí)促進(jìn)骨折愈合，縮短骨折愈合時(shí)間［5］。

中醫(yī)認(rèn)識(shí)疾病和治病的基本原則是辨證論治，在臨床實(shí)踐中，同一中藥復(fù)方可用于治療不同疾病的類似證型，雖然中藥復(fù)方基本相同，但對(duì)于不同疾病，中藥的使用劑量往往不同，所有對(duì)于中藥復(fù)方來(lái)說(shuō)，其“治療窗”較寬，而“劑量閾”相對(duì)較低。近年來(lái)中藥復(fù)方量效關(guān)系的研究思路越來(lái)越多，但并沒有形成一個(gè)完整的理論體系，有基于數(shù)據(jù)挖掘的方式，以人為本體，對(duì)各類古籍及現(xiàn)代名老中醫(yī)醫(yī)案中的方劑藥物劑量進(jìn)行系統(tǒng)整理，從中得出量效規(guī)律［16-17］。也有針對(duì)效應(yīng)物質(zhì)的研究，學(xué)者通過(guò)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)層面，運(yùn)用中藥血清藥理學(xué)、代謝組學(xué)等研究方式來(lái)剖析中藥復(fù)方量效關(guān)系［18］。亦有將臨床療效評(píng)價(jià)為出發(fā)點(diǎn)中心，將醫(yī)案、實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)多重結(jié)合的方式，歸納總結(jié)劑量的合理范圍，正確認(rèn)識(shí)“量”和“效”的相對(duì)關(guān)系［19］。目前，關(guān)于中藥復(fù)方量效的關(guān)系研究仍處于摸索階段，建立和健全具有中醫(yī)藥特色的量效關(guān)系研究方法及體系，用科學(xué)正確的方法詮釋中藥復(fù)方量效關(guān)系，是中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程中必須解決的重大問題。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，通過(guò)觀察大鼠一般情況、測(cè)量肢體腫脹度、測(cè)定血清VEGF濃度、運(yùn)用顯微CT和光學(xué)顯微鏡技術(shù)，明確了桃紅四物湯單體成分組方可以通過(guò)調(diào)控VEGF表達(dá)水平達(dá)到加速早期骨折愈合的作用，且存在量效關(guān)系，其療效與劑量、時(shí)相點(diǎn)呈正相關(guān)性，其中以桃紅四物湯單體成分組方高劑量組療效最佳。這與上文論述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。本研究為桃紅四物湯單體成分組方加速早期骨折愈合更深入的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為后期的臨床應(yīng)用提供了更多依據(jù)。