四季海棠無性系變異離體篩選與變異頻率控制

翟懿銘， 雪文晶， 張 黎

（寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021）

四季海棠（begonia semperflorens）又名四季秋海棠、蜆肉海棠，適合在潮濕、半陰、溫暖的環(huán)境中生長[1]。因其具有花色艷麗、花期長等特點，是優(yōu)良的園林觀賞植物和家庭觀賞花卉。四季海棠通常采用播種與扦插方法繁殖，兩種繁殖方法出苗率不易控制，隨著繁殖次數的積累，后代品質逐漸降低、株型變異、葉色變化，抗性變差。四季海棠無性系建立是進行種苗快速繁殖的有效方法之一[5]，而四季海棠品種無性系建立過程中，也會有一定變異性狀的出現(xiàn)。無性系變異的發(fā)生，嚴重影響了應用組培技術進行快繁的產業(yè)化生產效益[2]。變異苗觀賞性及再生能力差，采用無性提純的方法剔除變異植株，篩選優(yōu)質種苗。目前，對四季海棠組培苗變異的研究空白，但變異在建立無性系過程中日益突出的不利影響逐漸顯現(xiàn)，組培變異的篩選和控制顯得愈加重要。

1 材料與方法

1.1 材料

以四季海棠（銅葉猩紅色Bronze Scarlet）組培繼代試管苗為試驗材料，選取生長健壯的繼代組培苗和具有明顯特征的變異組培苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 四季海棠繼代增殖培養(yǎng)出現(xiàn)的變異類型 選取四季海棠的莖段作為試驗材料，進行繼代增殖培養(yǎng)。以MS 為基礎培養(yǎng)基，pH 調至6.5，剪除瓶苗氣生根，將莖段切為長1.5～2.5 cm 小節(jié)，接種于增殖培養(yǎng)基，每瓶接種2～3 株。將增殖的叢生無菌芽苗再次分割、繼代。培養(yǎng)條件（光照24 h/d，溫度（26±2）℃，光照強度2 400 lx）。觀察四季海棠的外觀形態(tài)并進行數據采集，統(tǒng)計四季海棠出現(xiàn)的變異類型。

1.2.2 繼代次數對四季海棠變異的影響 將四季海棠繼代増殖培養(yǎng)第4 代至第10 代的標準苗，分別轉接于MS 培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，每瓶接種2 株，每處理接種50 瓶，重復3 次，培養(yǎng)條件（光照24 h/d，溫度（26±2）℃，光照強度2 400 lx），90 d 后統(tǒng)計變異率。

1.2.3 繼代周期對四季海棠變異的影響 將生長30、60、90 d 的標準苗分別轉接于 MS 培養(yǎng)基中，每瓶接種2 株，每處理接種50 瓶，重復3 次，培養(yǎng)條件（光照 24 h/d，溫度（26±2）℃，光照強度 2 400 lx），90 d 后觀察繼代周期對四季海棠無性系變異影響。

1.2.4 提純復壯試驗設計 取繼10 代的喬化變異苗和矮化變異苗，設置變異苗的繼代周期為30、60、90 d，分別接種于MS 繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個處理接種20 瓶，3 次重復。培養(yǎng)條件與繼代培養(yǎng)條件一致，90 d 后統(tǒng)計四季海棠組培變異苗的復壯率。

1.3 統(tǒng)計與處理

增殖率=總芽數/存活外植體數，

變異率=出現(xiàn)變異的植株/存活總數，

葉面積：長乘寬葉面積系數法。

使用 Excel、DPS、Origin 進行相應的數據處理，實驗采用單因素實驗方法，進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 四季海棠組培苗變異類型

由表1 可知，四季海棠繼代培養(yǎng)中，隨著繼代次數的增加，出現(xiàn)兩種變異現(xiàn)象：葉片變小、節(jié)間變長，植株細長彎曲，生長迅速，為喬化變異株；植株矮小、葉柄間距變、葉面積小、長勢差、生長緩慢、葉片少且變形，為矮化變異株。

2.2 四季海棠組培苗正常苗和變異苗性狀差異

由表2 可知，變異對株高的影響，喬化、矮化苗與標準苗之間有顯著差異；變異對于葉片數的影響，標準苗與喬化苗之間差異顯著，喬化苗與矮化苗之間差異不顯著；變異對莖徑的影響，喬化變異與矮化變異之間無顯著差異，與標準苗之間差異顯著；各處理增殖數之間差異顯著，標準苗、矮化變異苗、喬化變異苗之間差異顯著。變異對節(jié)數的影響，喬化變異與矮化變異之間差異顯著，喬化變異苗與標準苗之間差異顯著，矮化變異苗與標準苗之間差異顯著；變異對鮮質量的影響，標準苗、喬化變異苗之間差異不顯著，標準苗、矮化變異苗之間差異顯著，喬化變異苗，矮化變異苗之間差異顯著。

2.3 繼代次數對四季海棠組培苗變異的影響

由圖1A 可知，繼4 代開始，組培苗出現(xiàn)矮化和喬化兩種變異。隨著繼代次數的增加，兩種類型的變異率均增加，矮化變異率高于喬化變異率，總變異率上升。

圖1B 表明，繼1-4 代四季海棠無變異，繼5 代出現(xiàn)變異，并且變異率呈上升趨勢，繼9 代達到最大值。繼4 代至10 代范圍內，總變異率隨時間的變化擬合直線回歸方程y=0.9x-0.27，變異率與繼代次數具有密切正相關性，相關系數r=0.448 3。

圖 1C 表明，繼4 代至繼 10 代范圍內，兩種不同類型的變異苗總變異率上升。

圖1D 表明，喬化變異苗變異率的變化擬合直線回歸方程y=0.39x- 0.07，變異率與繼代次數具有密切正相關性，相關系數r=0.996 2;矮化變異苗變異率的變化擬合直線回歸方程y=0.53x-0.02，變異率與繼代次數具有密切正相關性，相關系數r=0.960 3。

2.4 繼代周期對四季海棠組培苗變異頻率的影響

由表3 可知，繼代周期不同，四季海棠組培苗的變異率有所不同。繼代30 d 時，組培苗生長速度快，長勢好，葉片發(fā)育正常，增殖系數高；繼代90 d，組培苗生長慢，莖變細弱，并出現(xiàn)變異。繼代時將變異苗變異部分剔除，同時轉入新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，但變異性狀未改變。

由表4 可知，喬化苗與矮化苗中，繼代周期的變異率差異顯著。變異率隨著繼代周期的延長而增加，縮短而降低。

表1 四季海棠變異苗類型

表2 四季海棠組培苗標準苗和變異苗性狀差異

表3 繼代時間對四季海棠組培苗變異頻率的影響

圖1 繼代次數對組培苗變異率的影響

表4 繼代周期對四季海棠組培苗變異頻率的影響

2.5 四季海棠變異組培苗提純復壯試驗

2.5.1 四季海棠矮化變異組培苗提純復壯 由表5可以看出，處理天數對矮化變異苗的影響。株高30 d與 90 d 之間差異顯著，30、90 與 60 d 之間差異不顯著；處理天數對莖徑的影響，30、60、90 d 之間無顯著差異；各處理節(jié)間長之間差異較大，標準苗，矮化變異苗，喬化變異苗之間差異顯著；變異對節(jié)數的影響，喬化變異與矮化變異之間差異顯著，喬化變異苗與標準苗之間差異顯著，矮化變異苗與標準苗之間差異顯著。隨著處理天數的增加，復壯率呈現(xiàn)下降趨勢。

2.5.2 四季海棠喬化變異組培苗提純復壯 由表6可知，處理天數對喬化變異苗的影響，株高30 d 與90 d 之間差異顯著，30、90 與60 d 之間差異不顯著；處理天數對莖徑的影響，30 d 與60 d、90 d 之間差異顯著，60 d 與90 d 之間無顯著差異。節(jié)間長30 d 與90 d 之間差異顯著，30、90 d 與 60 d 之間差異不顯著；節(jié)數 30 d 與 90 d 之間差異顯著，30、90 d 與 60 d之間差異不顯著；隨著處理天數的增加，復壯率下降。

表5 四季海棠矮化變異組培苗提純復壯

表6 四季海棠喬化變異組培苗提純復壯

2.5.3 四季海棠變異組培苗提純復壯效果比較 由表7 可知，將喬化變異株和矮化變異株分別接種于MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，喬化變異率在提純后，正常苗率為46.6%，喬化變異苗率為53.4%，無矮化變異株出現(xiàn)，表明喬化變異株提純復壯有效。矮化變異株提純復壯后正常苗率為0.66%，矮化變異苗率為93.4%，無喬化變異株出現(xiàn)，表明無效。

表7 四季海棠變異組培苗提純復壯效果比較

2.6 四季海棠在繼代過程中的性狀篩選

由表8 可知，培養(yǎng)30 d 時，標準苗、喬化變異株和矮化變異株之間株高無顯著性差異；生長60 d時，標準苗與喬化變異苗平均株高間差異不顯著，標準苗、喬化變異苗與矮化變異苗差異顯著；生長90 d 時，三者平均株高間差異顯著；標準苗生長90 d平均株高10.704 cm，比矮化苗平均值高出58.8%，比喬化苗矮41.23%；標準苗生長60 d 平均株高4.68 cm，比矮化苗平均值高出13.2%，比喬化苗矮3.1%。矮化變異株在生長60 d 后停止生長，喬化變異株在生長90 d 內與標準苗相比增值速度快38.36%，兩者為被篩選對象。

3 討論與結論

3.1 討論

前人對四季海棠的研究主要集中在組培快繁體系的建立[5]和大棚繁育[1]方面，未見有對組培階段變異的研究報道，本試驗以四季海棠組織培養(yǎng)增殖階段組培苗為試驗材料，采用單因素隨機區(qū)組試驗，探究四季海棠繼代次數、繼代周期對變異的影響以及提純復壯。胡盼盼等[2]、張馨宇等[3]總結了草莓組培中變異發(fā)生的原因和有效控制變異的途徑，指出組培過程中變異的普遍性，顯著影響植物的遺傳穩(wěn)定性，制約了組培技術在農業(yè)生產上的應用。韋家川等[4]研究了香蕉試管苗增殖階段中出現(xiàn)的變異類型，表明變異與品種、繼代培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件有關。曾少玲等[7]研究了代數、激素使用和分化途徑對香蕉生長的影響，表明香蕉無土栽培的繼代代數不宜超過10 代。張盛圣[6]指出，繼代次數對綠蘿的葉色變異有顯著影響，而且對發(fā)生變異的植株剔除，對其進行分離提純有利于植株繼代變異率降低且能夠持穩(wěn)定、較低的變異率。王安石等[8]研究了紅掌組培苗工廠化生產的變異控制技術，指出控制組培體系的變異需要從外植體選擇到繼代培養(yǎng)各個環(huán)節(jié)嚴格把控，這與本試驗繼代次數對四季海棠組培苗的變異影響相符。對無性系變異篩選及調控途徑的研究，將有可能揭開表觀遺傳變異的真相，為如何有效控制組培變異和減少變異對生產的不利影響提供更多切實可行的途徑。

表8 四季海棠組培苗不同培養(yǎng)天數下株高差異顯著性

3.2 結論

（1）四季海棠組培苗變異類型為喬化變異和矮化變異兩種，喬化變異率為2.9%，矮化變異率為3.8%；

（2）四季海棠組培苗繼代4 次后，出現(xiàn)變異現(xiàn)象，變異率隨繼代次數增加而增加。

（3）四季海棠組培變異率隨著繼代時間增加而增加。

（4）四季海棠變異組培苗喬化變異提純復壯率達46.6%，矮化變異復壯為0.66%。