柑橘葉斑駁病毒的逆轉錄重組酶聚合酶擴增檢測

段玉，許建建，馬志敏，賓羽，周常勇，宋震

柑橘葉斑駁病毒的逆轉錄重組酶聚合酶擴增檢測

段玉，許建建，馬志敏，賓羽，周常勇，宋震

西南大學/中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712

【】建立柑橘葉斑駁病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）逆轉錄重組酶聚合酶擴增（reversetranscription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA）的快速檢測體系，為該病毒提供快速、簡便的檢測方法。以CLBV ORF1保守序列為靶標，通過設計、篩選特異性檢測引物、優(yōu)化反應溫度和反應時長等條件建立CLBV的RT-RPA檢測體系。分別以感染CLBV、柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus，CTV）、柑橘黃化脈明病毒（citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）、柑橘裂皮類病毒（citrus exocortis viroid，CEVd）、柑橘碎葉病毒（citrus tatter leaf virus，CTLV）、柑橘鱗皮病毒（citrus psorosis virus，CPsV）、溫州蜜柑萎縮病毒（satsuma dwarf virus，SDV）、柑橘潰瘍病菌（subsp.，）和柑橘黃龍病菌亞洲種（Liberibacter asiaticus，Las）的柑橘核酸為模板，應用該體系進行RT-RPA擴增，評價檢測特異性；利用CLBV陽性樣品核酸的10倍濃度梯度稀釋模板，比較RT-RPA、RT-PCR和RT-qPCR的檢測靈敏度；通過比較上述3種方法對72份柑橘樣品的CLBV檢出率，檢驗所建立RT-RPA法的適用性。以感染了CLBV的柑橘核酸樣品為模板，通過對設計的3對引物篩選試驗、6個溫度和5個反應時長的梯度試驗，建立了CLBV的RT-RPA檢測體系，明確引物RCLBV-F/RCLBV-R2能夠特異擴增CLBV ORF1序列，且擴增效果良好，目的片段大小為144 bp，反應最適溫度為40℃，反應最佳時長為30 min。在感染CLBV、CTV、CYVCV、CEVd、CTLV、CPsV、SDV、和Las的柑橘樣品、健康對照和空白對照中，該體系僅在CLBV侵染樣品中擴增出預期大小的特異性目的條帶，說明建立的RT-RPA檢測體系特異性強；靈敏度檢測結果表明，RT-RPA和RT-PCR的檢測靈敏度相當，但低于RT-qPCR；所建立的RT-RPA方法在72份柑橘樣品中檢測出11份樣品為CLBV陽性，檢出率為15.28%，該結果與普通RT-PCR和RT-qPCR檢測方法的檢測結果一致。建立了CLBV的RT-RPA檢測體系，該體系具有耗時短、操作簡便、特異性強等優(yōu)點，適用于田間一定規(guī)模柑橘樣品的檢測。

柑橘葉斑駁病毒；逆轉錄重組酶聚合酶擴增；快速檢測

0 引言

【研究意義】柑橘葉斑駁病毒（citrus leaf blotch virus，CLBV）是線性病毒科（）柑橘病毒屬（）的正義單鏈RNA病毒[1-2]，是柑橘病毒屬的代表種[3]。CLBV于1984年首次在金橘中被檢測并報道[4]，后來在澳大利亞、日本、美國和西班牙的幾個柑橘品種中亦檢測到[5]。我國于1995年在對福建獼猴桃進行調查中首次發(fā)現(xiàn)CLBV[6]，隨后的檢測表明此病毒在獼猴桃上分布廣且危害有加重的趨勢[7-8]。該病毒侵染幾乎所有柑橘屬植物及其近緣種，多為隱癥，但可引起金橘和枳殼的芽接合部失調、橘橙葉片斑駁和香櫞莖痘等癥狀[3]。在自然條件下，該病毒主要通過嫁接等無性繁殖途徑傳播，也可通過柑橘種子傳播，但傳播率很低[9]。目前，早期檢測、應用脫毒苗木是有效防止此病毒危害的重要手段，因此建立簡便、快捷的CLBV檢測方法，對有效防控該病毒具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】隨著對CLBV研究的深入，多種CLBV的鑒定方法被建立，從指示植物鑒定到斑點雜交和組織印跡雜交[10]，再到分子檢測，如RT-PCR檢測[3,11]、多重RT-PCR檢測[12]、實時熒光定量PCR[13-15]等。然而，現(xiàn)有的分子檢測方法大多耗時費力、不夠簡便。RT-LAMP[16]檢測法突破了熱循環(huán)的局限，但其復雜的引物設計和較長的反應時長使其不夠簡便快捷。近年來，一種新型的等溫核酸擴增技術——重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA），因其快速、靈敏、操作簡便而受到關注。RPA使用一種含有重組酶、單鏈DNA結合蛋白和具有置換活性的DNA聚合酶的酶促混合物進行恒溫擴增，目標產(chǎn)物可在凝膠電泳中呈現(xiàn)。早在2006年，此技術就被應用于DNA的快速靈敏檢測[17]和快速檢測轉基因作物[18]等，現(xiàn)已廣泛應用于植物的病原檢測，如馬鈴薯帚頂病毒（potato mop-top virus，PMTV）[19]、香蕉束頂病毒（banana bunchy top virus，BBTV）的RPA檢測[20]。在柑橘病害檢測方面，應用于柑橘黃龍病菌的RPA熒光檢測技術[21]也已建立，整個檢測反應能在15 min內(nèi)完成，操作簡單便捷，適用于該病害的田間快速檢測。RT-RPA用于檢測RNA病毒，如馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）[22]、蘋果莖痘病毒（apple stem pitting virus，ASPV）[23]、日本山藥花葉病毒（Japanese yam mosaic virus，JYMV）[24]、玫瑰花葉病毒（rose rosette virus）[25]、辣椒脈斑駁病毒（chilli veinal mottle virus，ChiVMV）的RT-RPA檢測[26]和RNA病毒高靈敏度RT-RPA核酸測流分析技術[27]等。【本研究切入點】關于CLBV的檢測方法盡管已有報道，但在操作實施時均耗時費力，對操作技巧、試驗儀器的要求較高。RT-LAMP能夠實現(xiàn)CLBV的恒溫檢測，操作簡便，但需要復雜的探針設計和較長的反應時間，仍有進一步優(yōu)化的必要。【擬解決的關鍵問題】通過設計特異引物，建立CLBV的RT-RPA快速檢測體系，為CLBV的檢測提供新的技術手段。

1 材料與方法

試驗于2019—2020年在西南大學柑桔研究所脫毒課題組完成。

1.1 試驗材料與主要試劑

試驗材料：本研究涉及的柑橘病害陽性材料包括CLBV、柑橘衰退病毒（citrus tristeza virus，CTV）、柑橘黃化脈明病毒（citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）、柑橘裂皮類病毒（citrus exocortis viroid，CEVd）、柑橘碎葉病毒（citrus tatter leaf virus，CTLV）、柑橘鱗皮病毒（citrus psorosis virus，CPsV）、溫州蜜柑萎縮病毒（satsuma dwarf virus，SDV）、柑橘潰瘍病菌（subsp.，）和柑橘黃龍病菌亞洲種（Liberibacter asiaticus，Las），均由西南大學柑桔研究所國家柑桔苗木脫毒中心提供。

主要試劑：Biospin全能型植物基因組DNA提取試劑盒、多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司；GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒購于普洛麥格公司；RT-RPA核酸擴增試劑盒的品牌為眾測生物。其余試劑均為分析純。

1.2 核酸制備

取50 mg柑橘葉片組織樣品，按照RNA提取試劑盒的說明書提取樣品核酸，用CLBV1F/CLBV5R引物進行CLBV檢驗，將陽性樣品核酸保存于-20℃?zhèn)溆?。其余柑橘病毒陽性核酸也按照RNA提取試劑盒的說明指導提取核酸并檢測為病毒陽性后存于-20℃?zhèn)溆?。柑橘潰瘍病菌和柑橘黃龍病菌則按照DNA試劑盒的說明指導提取核酸并檢測為陽性后存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計與引物特異性的篩選

根據(jù)CLBV基因ORF1的gRNA基因保守序列（登錄號MG572236.1），通過Premier 5.0軟件設計了3對引物（表1）。引物設計時注意避免錯配、二聚體和發(fā)卡結構，最佳引物長度在30—35 bp，產(chǎn)物在100—150 bp。引物的RT-RPA篩選體系：上下游引物各2 μL（10 μmol·μL-1），加入RT-RPA試劑盒里的A緩沖液41.5 μL和B緩沖液2.5 μL，RNA 2 μL，蓋上單元蓋，充分振蕩混勻，瞬時離心10 s，37℃ 30 min，加入上述反應體系等體積的三氯甲烷，充分混勻，12 000 r/min離心5 min，吸取10 μL上清產(chǎn)物，進行2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。將檢測為陽性的RT-RPA反應產(chǎn)物進行測序，由華大基因公司完成。CLBV的RT-PCR檢測引物CLBV1F/CLBV5R參考HARPER等[28]報道的序列合成，擴增片段大小為425 bp；RT-qPCR引物CLBVF/CLBVR參考Ruiz-Ruiz等[14]報道的序列合成。

表1 CLBV檢測所用引物序列

1.4 反應溫度和反應時長優(yōu)化

設定從34℃至44℃的溫度差，以2℃為溫度梯度，檢測體系條件按照1.3中所述，進行RT-RPA反應體系的溫度優(yōu)化，反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，篩選擴增效率最佳的反應溫度。

設定從26 min至34 min的反應時間差，以2 min為時間梯度，檢測體系條件按照1.3中所述，進行RT-RPA反應體系的反應時長優(yōu)化，反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，篩選擴增效率最佳的反應時長。

1.5 RT-RPA檢測體系的特異性評價

將1.2制備的CLBV、CTV、CYVCV、CEVd、CTLV、CPsV、SDV、和Las陽性樣品核酸，設置CLBV陽性對照、健康對照和水對照，按照1.4建立的RT-RPA方法進行檢測，評價所建RT-RPA檢測體系的特異性。

1.6 RT-RPA檢測體系的靈敏度比較

選取現(xiàn)提的CLBV陽性核酸為模板，按10倍梯度稀釋，分別采用所建立的RT-RPA及文獻報道的RT-PCR[28]、RT-qPCR[14]進行平行檢測，比較其檢測靈敏度。

RT-RPA檢測體系：RCLBV-F/RCLBV-R2各2 μL（10 μmol·μL-1），A緩沖液41.5 μL，B 緩沖液2.5 μL，RNA 2 μL，40℃ 30 min，加入等反應體系體積的三氯甲烷，12 000 r/min離心5 min，取上清產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RT-PCR檢測體系：CLBV1F/CLBV5R各0.2 μL（10 μmol·μL-1），Prime Script 1 Step Enzyme Mix 0.4 μL，2×1 Step Buffer 5 μL，去核酸酶水2.2 μL，RNA 2 μL。檢測程序：50℃反轉錄30 min，94℃預變性3 min，94℃變性30 s，58℃解鏈30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，72℃再延伸5 min，12℃結束反應，反應產(chǎn)物4℃保存。

RT-qPCR檢測體系：CLBVF/CLBVR各0.4 μL（10 μmol·μL-1），GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL，去核酸酶水7.2 μL，cDNA 2 μL。檢測程序：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，58℃解鏈30 s，72℃延伸30 s，熒光收集15 s，35個循環(huán)。

1.7 柑橘樣品的CLBV檢測

將72份疑似CLBV的柑橘樣品，按照RNA提取試劑盒提取核酸，分別采取RT-PCR、RT-RPA和RT-qPCR 3種方法按照1.6的反應體系和程序進行檢測，統(tǒng)計各檢測方法的CLBV陽性檢出率。

2 結果

2.1 RT-RPA檢測體系的建立與優(yōu)化

2.1.1 特異性引物的篩選 選用CLBV陽性樣本的核酸為模板，設置健康對照和水對照，使用所設計的3對RT-RPA引物進行擴增。結果表明（圖1），引物RPACF1/RPACR1和引物RCLBV-F/RCLBV-R2能在感染CLBV的柑橘樣品中擴增出單一的目的條帶，健康對照和水對照則無擴增條帶的擴增，表明這兩對引物具有特異性；而引物RCLBV-F/RCLBV-R1無明顯目的條帶擴增，表明該引物擴增效果不佳。引物RCLBV-F/RCLBV-R2擴增出目的條帶較引物RPACF1/ RPACR1的明亮，表明引物RCLBV-F/RCLBV-R2的擴增效率較優(yōu)，將其擴增出的產(chǎn)物送去華大基因公司進行測序，結果表明該擴增產(chǎn)物大小為144 bp，符合目的條帶大?。粶y序結果在NCBI上進行序列比對，結果顯示其與目的基因序列一致性100%，表明引物RCLBV-F/RCLBV-R2具有擴增CLBV的特異性，用于后續(xù)試驗。

2.1.2 反應溫度和反應時長條件的篩選 在6個不同溫度條件下，RCLBV-F/RCLBV-R2均表現(xiàn)出良好的擴增效率。在34℃時，存在弱的非特異性弱條帶，隨著反應溫度的升高，非特異帶逐漸消失；擴增效率隨溫度升高而升高，在40℃時，擴增效率達到最大，40℃后，隨著反應溫度的升高，擴增效率變化不明顯。因此，40℃為RT-RPA反應體系反應的最優(yōu)溫度（圖2）。

在5個不同反應時長條件下，RT-RPA檢測體系均能進行特異性擴增。在反應30 min之前，擴增產(chǎn)量隨反應時間的延長而增加，在反應時間為30 min時，產(chǎn)物的積累量達到最大，在反應30 min后，隨著反應時間的延長，擴增產(chǎn)量逐漸下降，可能與相關酶的失活或產(chǎn)物DNA發(fā)生降解有關。因此，30 min為RT-RPA反應體系的最佳反應時長（圖3）。

2.2 RT-RPA檢測體系的特異性

利用優(yōu)化后的RT-RPA檢測體系對分別感染了CTV、CYVCV、CEVd、CTLV、CPsV、SDV、、Las和CLBV的柑橘陽性樣品進行RT-RPA檢測，電泳結果如圖4所示，所建立的RT-RPA體系僅在CLBV的柑橘陽性樣品檢測出CLBV特異條帶，對其他柑橘病原物侵染樣品及健康對照、水對照的檢測則均呈陰性?？梢?，所建立的RT-RPA檢測體系特異性良好。

M：DNA分子質量標記DL2000 Marker；26—34 min：反應時長梯度Time gradient of reaction

M：DNA分子質量標記DL2000 Marker；CTV—CLBV：不同柑橘病害陽性樣本Different citrus disease positive samples；ck：健康對照Health control；H2O：水對照Water control

2.3 RT-RPA檢測體系的靈敏度

提取CLBV陽性樣品核酸，檢測表明其濃度為1.17 μg·μL-1。通過10倍梯度稀釋，獲得系列濃度梯度模板，平行進行RT-PCR、RT-RPA和RT-qPCR檢測，比較靈敏度。結果顯示RT-RPA和RT-PCR能檢測到的最小CLBV核酸濃度為1.17×10-3μg·μL-1，RT-qPCR能檢測到濃度為1.17×10-6μg·μL-1的CLBV核酸（圖5）。由此表明，RT-RPA檢測的靈敏度和RT-PCR相當，比RT-qPCR的檢測靈敏度低1 000倍。

2.4 柑橘樣品檢測

同時運用RT-PCR、RT-RPA和RT-qPCR 3種檢測方法檢測72份柑橘樣品核酸，統(tǒng)計結果表明，3種檢測方法均檢測出11份帶有CLBV的柑橘樣品，檢出率均為15.28%，3種檢測方法的檢測結果一致（圖6）。由此可見本研究所建立的RT-RPA檢測方法穩(wěn)定可靠，可用于柑橘樣品CLBV的檢測。

A：RT-PCR；B：RT-RPA；C：RT-qPCR。M：DNA分子質量標記DL2000 Marker；1—7：柑橘樣品核酸Sample nucleic acid

3 討論

本研究通過在CLBV ORF1保守序列上設計特異引物，優(yōu)化反應時間和反應溫度等，建立了CLBV的RT-RPA快速檢測體系。該體系操作簡便，反應迅速靈敏，特異性強，可快速呈現(xiàn)檢測結果，不僅突破了普通RT-PCR的溫度限制，也不需要復雜儀器，對操作者的技術要求較低，便于基層人員對CLBV的快速檢測，應用前景廣闊。目前檢測CLBV普遍采用RT-PCR和RT-qPCR法，其中RT-qPCR需要避光操作和精密的儀器進行熒光采集，建立標準曲線和分析復雜的熒光數(shù)據(jù)，要消耗大量的時間和精力，不夠簡潔便利[13]；普通的RT-PCR檢測體系耗時較長，對儀器具有很強的依賴性。RT-RPA檢測與上述兩種檢測方法相比，具有無需避光、不依賴于精密的儀器，不需要單獨的反轉錄步驟且能在恒溫條件進行檢測反應的優(yōu)點。與另一種恒溫檢測方法逆轉錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）相比，本研究所建立的RT-RPA方法不需要設計復雜的探針和4—6條引物，反應溫度更低，反應時長縮短了一半，只需要35 min就能完成所有的檢測反應，且產(chǎn)物單一，結果清晰明了，而RT-LAMP的反應產(chǎn)物成分復雜，不利于后續(xù)的產(chǎn)物測序分析。因而，RT-RPA比RT-LAMP法具有一定優(yōu)勢。

RNA容易降解，在逆轉錄過程中也存在逆轉錄效率問題。本研究為了更為準確地比較RT-RPA、普通RT-PCR和RT-qPCR檢測方法的檢測靈敏度，采用從柑橘樣品中直接抽提的RNA作為模板，既反映了逆轉錄效率也反映了擴增效率，具有更高的真實性。在本研究中，RT-RPA與普通RT-PCR檢測到的最小CLBV核酸濃度為1.17×10-3μg·μL-1，說明RT-RPA與普通RT-PCR的檢測靈敏度在一個數(shù)量級；而RT-qPCR檢測法則能檢測到的最小CLBV核酸濃度為1.17×10-6μg·μL-1，比RT-RPA與普通RT-PCR靈敏1 000倍，是3種方法中靈敏度最高的檢測法。本研究的目的是建立一種簡便可靠的CLBV檢測體系，而非追求最靈敏的檢測方法，且本研究所涉及的RT-RPA檢測技術已成功應用于多種植物病毒的檢測，例如玉米綠斑駁病毒（maize chlorotic mottle virus）[29]、黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus）[30]等。本研究建立的RT-RPA檢測體系能特異檢測出帶有CLBV的柑橘樣品，靈敏度和RT-PCR相當，雖靈敏度不及RT-qPCR，卻比RT-qPCR更省時便捷，不需要復雜的操作和精密儀器的加持，可以在基層等條件不足的地方進行檢測應用，實用度較高。

本研究在對72份疑似攜帶CLBV的柑橘樣品的檢測中，RT-RPA檢測出11株CLBV陽性樣品，結合普通RT-PCR和RT-qPCR驗證，證實了該方法適用于柑橘植株CLBV的檢測。本研究中關于CLBV的檢出率為15.28%，該檢出率不代表田間柑橘植株普遍攜帶CLBV的概率，僅代表本研究涉及的柑橘樣品中攜帶CLBV的植株數(shù)量。

4 結論

通過特異性引物設計、反應溫度和反應時長等條件優(yōu)化，建立了CLBV的RT-RPA檢測體系。該檢測方法特異性強、靈敏度高，操作簡單便捷，整個檢測能在35 min內(nèi)完成，適合于柑橘樣品CLBV的快速檢測。

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Detection of citrus leaf blotch virus by reverse transcription-recombinase polymerase amplification (RT-RPA)

DUAN Yu, XU JianJian, MA ZhiMin, BIN Yu, ZHOU ChangYong, SONG Zhen

Citrus Research Institute of Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712

【】The objective of this study is toestablish a rapid reversetranscription-recombinase polymerase amplification (RT-RPA) detection system for citrus leaf blotch virus (CLBV), and to provide an efficient and simple detection method for CLBV.【】RT-RPA primers for CLBV detection were designed on conserved sequence of the ORF1, and their specificity was verified. The reaction temperature and reaction time were then optimized to establish RT-RPA system for CLBV detection. Nucleic acids from samples infected with citrus tristeza virus (CTV), citrus yellow vein clearing virus (CYVCV), citrus exocortis viroid (CEVd), citrus tatter leaf virus (CTLV), citrus psorosis virus (CPsV), satsuma dwarf virus (SDV),subsp.() andLiberibacter asiaticus (Las), respectively, were used to evaluate the specificity of the established RT-RPA method. The 10-fold dilution of CLBV positive samples was used to compare the detection sensitivity of RT-RPA, RT-PCR and RT-qPCR. In order to evaluate the applicability of the RT-RPA, 72 citrus samples were parallelly detected by the above three methods.【】In order to establish a RT-RPA method for CLBV detection, a series of experiments have been approached. Firstly, RCLBV-F/RCLBV-R2 that selected out of three designed primer pairs could specifically amplify the ORF1 fragments of CLBV with the aim size of 144 bp by RT-RPA, whereas no specific band could be obtained from samples infected with CTV, CYVCV, CEVd, CTLV, CPsV, SDV,orLas, showing the strong specificity of the RT-RPA method. Secondly, through gradient test of 6 temperatures and 5 reaction times, the optimal reaction temperature and time of the RT-RPA system were determined to be 40℃ and 30 min, respectively. Thirdly, the sensitivity of the RT-RPA was compared to that of RT-PCR and RT-qPCR, which is similar to the former but less than the latter. The RT-RPA established in this study was addressed to detect 72 citrus samples, 11 samples were detected to be CLBV positive with positive rate of 15.28%, which was consistent with that of RT-PCR and RT-qPCR.【】A RT-RPA system for CLBV detection was established and optimized, which has advantages of short time consuming and easy operation with potential usage for a relatively large scale of virus monitoring in field.

citrus leaf blotch virus (CLBV); RT-RPA; rapid detection

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.09.008

2020-07-08；

2020-08-04

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0201500，2017YFD0202002）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)柑橘產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-26-05B）

段玉，E-mail：982432080@qq.com。通信作者宋震，E-mail：songzhen@cric.cn。通信作者周常勇，E-mail：zhoucy@cric.cn

（責任編輯 岳梅）