熱帶糙海參雌、雄親參的差異代謝物和差異代謝通路研究*

吳菲菲 程楚杭 陳 廷 張 鑫 吳小芬江 曉 任春華① 胡超群①

(1. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國科學(xué)院南海海洋研究所 廣州 510301; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;3. 中國科學(xué)院南海生態(tài)環(huán)境工程創(chuàng)新研究院 廣州 510301)

糙海參(Holothuria scabra)是一種具有較高營養(yǎng)價值、藥用價值及經(jīng)濟(jì)價值的棘皮動物(廖玉麟,1997)。20 世紀(jì)80 年代以來，隨著沿海經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，糙海參的近海棲息生境遭到嚴(yán)重破環(huán)，海洋環(huán)境條件不斷惡化。目前，廣西和廣東沿海的野生糙海參種群已基本絕跡，華南沿海僅海南東部有少量的野生資源(楊學(xué)明等, 2015)。糙海參已被世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄(IUCN 紅色名錄)列為瀕危物種(Lovatelli et al, 2004)。因此，人工繁育和養(yǎng)殖糙海參對于恢復(fù)糙海參資源顯得尤為重要。在人工繁育過程中，糙海參的雌、雄辨別能在很大程度上優(yōu)化人工繁育過程，但糙海參在外表上無法分辨雌雄(Conand,1998)。關(guān)于海參雌雄差異的研究只在仿刺參(Apostichopus j aponicus)上有少數(shù)相關(guān)報道，有研究構(gòu)建了仿刺參性別特異性圖譜，展示了染色體重組率的性別差異(Tian et al , 2015; Yan et al , 2013)；Jiang 等(2019)根據(jù)檢測產(chǎn)卵前后雌雄仿刺參體腔細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的免疫特征，描述了仿刺參性別特異性免疫差異，并發(fā)現(xiàn)脂肪酸組成可能是導(dǎo)致雌雄免疫差異的原因之一，然后通過蛋白組學(xué)揭示了仿刺參繁殖期間體液免疫和生理特性的性別差異，并表示雄性在產(chǎn)卵后可能會具有更強(qiáng)的恢復(fù)能力(Jiang et al,2020)。但關(guān)于糙海參性別差異的研究尚屬空白。因此，對于糙海參性別差異的研究有助于改良糙海參的人工繁育過程，并為糙海參性別決定機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

代謝組學(xué)是一門研究生物體內(nèi)各種生物化學(xué)過程的新興學(xué)科，它主要聚焦于生物體內(nèi)發(fā)生的生物化學(xué)過程所產(chǎn)生的代謝物，能夠幫助研究者了解在某種生物體內(nèi)已經(jīng)發(fā)生的過程和變化，如代謝通路、能量傳遞和細(xì)胞通信等(Nicholson et a l, 2002)。影響代謝物產(chǎn)生的因素有很多，如環(huán)境因素、生物體內(nèi)部因素和飲食因素等，性別差異屬生物體內(nèi)部因素，不同性別的同種生物，其體內(nèi)代謝物和性激素水平有很大差異。在不了解海參性別決定機(jī)制的情況下，對海參雌、雄親參的代謝物差異進(jìn)行研究，可以幫助了解雌、雄海參性別特異性化學(xué)過程和變化(Schock et al, 2010)。迄今已有很多關(guān)于水產(chǎn)動物代謝物具有性別特異的相關(guān)報道。Kleps 等(2007)發(fā)現(xiàn)，性別特異性代謝物AEP (2-Aminoethyl phosphonate)僅存在于雄性藍(lán)蟹(Callinectes s apidus)的鰓中，該代謝物可能發(fā)揮交配信息素的功能。一些研究發(fā)現(xiàn)，貽貝的外套膜脂質(zhì)含量隨繁殖周期的變化具有雌雄差異(Hines et al, 2007;Jabbar et al, 1987; Lubet et al, 1986)；Aru 等(2017)使用1H-NMR 技術(shù)探究了歐洲蛤仔(Ruditapes decussat us)受季節(jié)影響的代謝變化，發(fā)現(xiàn)了一些性別特異性候選分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)雄性蛤仔代謝物中的丙氨酸和甘氨酸含量顯著高于雌性蛤仔，而乙酰乙酸、膽堿和磷酸膽堿在雌性蛤仔代謝物中的含量較高；克氏螯蝦(Cherax t enuimanus)的血淋巴代謝組研究表明，由于生殖活動或生活史的差異，雌、雄克氏螯蝦的代謝物具有顯著差異(Lette et al, 2020)。然而，關(guān)于海參性別差異代謝物研究目前尚屬空白。海參體腔液浸泡著海參所有內(nèi)臟(Conand, 1998)，可能發(fā)揮物質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞信號傳遞(Laires, 2012)、性腺發(fā)育營養(yǎng)物和催產(chǎn)信息素貯存(Mercier et al, 2002)的功能，因此，海參體腔液可能參與性腺的分化和發(fā)育。

本研究以熱帶糙海參為研究對象，針對雌、雄親參的體腔液進(jìn)行代謝組學(xué)研究，對性別差異代謝物進(jìn)行分析，推測可能存在的性別間差異代謝通路，以期為糙海參性別決定機(jī)制以及性別鑒定提供有用的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 體腔液樣本采集

糙海參親參來源于湛江市美珍種苗有限公司。通過組織學(xué)切片鑒定糙海參性別后，選取雌、雄親參各6 頭，進(jìn)行體腔液樣本采集。將采集的體腔液先用100 μm 細(xì)胞篩過濾以除去組織碎屑，隨后在4℃、12000 r/min 條件下離心10 min，以確保體腔細(xì)胞及其他微小雜質(zhì)被完全清除，最后將上清液轉(zhuǎn)移至50 ml 離心管中，在-80℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 體腔液樣本處理

將體腔液樣本置于4℃下融化，每個樣本各取10 ml，凍干成粉末。向每個凍干樣本中分別加入5 ml乙腈溶液，震蕩混勻1 min。在4℃、12000 r/min 條件下離心10 min 后，吸取450 μl 上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml 離心管中，真空濃縮干燥。加入150 μl 含有2-氯苯丙氨酸(4 mg/L)的50%乙腈溶液重新溶解上述已濃縮干燥的上清液，通過0.22 μm 膜過濾，獲得待測樣本。從每個待測樣本中各取20 μl 溶液混合成質(zhì)量控制(QC)樣本，用于校正分析結(jié)果的偏差及由于分析儀器原因所造成的失誤。其余樣品用于LC-MS檢測。

1.3 LC-MS 檢測

進(jìn)樣順序：加入混標(biāo)溶液用于檢測儀器狀態(tài)，儀器狀態(tài)良好后，加入QC 樣品用于穩(wěn)定儀器，然后再依次加入空白溶劑(陰性對照)和待測樣品，每10 個樣本加入1 針QC 樣本。

色譜條件：儀器采用Thermo Ultimate 3000，使用ACQUITY UPLC?HSS T3 1.8 μm (2.1×150 mm)色譜柱，自動進(jìn)樣器溫度設(shè)為8℃，以0.25 ml/min 的流速、40℃的柱溫以及進(jìn)樣2 μl 進(jìn)行梯度洗脫，流動相為正離子0.1%甲酸水(D)-0.1%甲酸乙腈(C)和負(fù)離子5 mmol/L 甲酸銨水(B)-乙腈(A)。梯度洗脫程序：0～1 min，2% A/C；1～9 min，2%～50% A/C；9～12 min，50%～98% A/C；12～13.5 min，98% A/C；13.5～14 min，98%～2% A/C；14～20 min，2% C-正模式；14～17 min，2% A-負(fù)模式。

質(zhì)譜條件：儀器使用Thermo Q Exactive Focus，為電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負(fù)離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細(xì)管溫度325℃，以分辨率70000 進(jìn)行全掃描，掃描范圍81～1000，并采用HCD進(jìn)行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時采用動態(tài)排除去除無必要的MS/MS 信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 樣本數(shù)據(jù)預(yù)處理及代謝物鑒定和篩選 通過Proteowizard 軟件(v3.0.8789)，將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML 格式(xcms 輸入文件格式)，利用R(v3.3.2)的XCMS 程序包進(jìn)行峰識別、峰過濾和峰對齊。主要參數(shù)有bw=5、ppm=15、peakwidth=c(5,30)、mzwid=0.015、mzdiff=0.01 及method="centWave"。得到包括質(zhì)核比(m/z)、保留時間和峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣。為使不同量級的數(shù)據(jù)能夠進(jìn)行比較，對數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積的批次歸一化。代謝物的鑒定首先需確認(rèn)代謝物的精確分子量(分子量誤差＜20 ppm)，然后根據(jù)MS/MS模式所得的碎片信息，在Metlin(http://metlin.scripps.edu)、LipidMaps(http://www.lipidmaps.org)、mzclound(https://www.mzcloud.org)和帕諾米克自建標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步匹配和注釋所獲得代謝物的準(zhǔn)確信息。

1.4.2 多元統(tǒng)計(jì)分析 在多元統(tǒng)計(jì)分析前，對數(shù)據(jù)采用UV 換算以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交-偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)的多元統(tǒng)計(jì)方法對采集的多維數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和歸類分析，觀察樣品的聚集和離散程度。

1.4.3 差異代謝物統(tǒng)計(jì)分析及通路分析 差異代謝物的篩選指標(biāo)為P≤0.05+VIP≥1。采用R(v3.3.2)中的cor 函數(shù)計(jì)算相關(guān)系數(shù)，同時采用R(v3.3.2)中的cor.test 函數(shù)對代謝物進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，將P≤0.05 作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。采用凝聚層次聚類分析各組樣本的聚類情況，通過R(v3.3.2)中pheatmap程序包對數(shù)據(jù)集進(jìn)行縮放，得到代謝物相對定量值層次聚類圖，用來推測已知或未知代謝物的生物學(xué)功能。應(yīng)用KEGG 進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測，并采用MetPA數(shù)據(jù)庫分析2 組差異代謝物的相關(guān)代謝通路，通過降維算法獲得代謝通路中代謝物的相對響應(yīng)值，并以此計(jì)算代謝通路間的相關(guān)系數(shù)，進(jìn)而繪制代謝通路關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 性別差異代謝物的鑒定

在本研究中，采用PCA、PLS-DA 和OPLS-DA等多元統(tǒng)計(jì)的分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。如PCA 主成分分析得分圖(圖1A)所示，雌性糙海參(F)組和雄性糙海參(M)組樣本表現(xiàn)為組內(nèi)聚類以及組間離散，可以看出F 組和M 組樣本具有差異；進(jìn)一步通過PLS-DA 得分圖(圖1B)分析，結(jié)果顯示，F(xiàn) 組和M 組,之間表現(xiàn)明顯的離散趨勢，可以很好地區(qū)分，表明雌性和雄性樣本的代謝物具有顯著差異。PLS-DA 置換檢驗(yàn)圖可以作為評估PLS-DA 模型可靠有效的標(biāo)準(zhǔn)，解決模型存在過擬合的問題，其可靠性標(biāo)準(zhǔn)為(滿足其中一個即可)：所有藍(lán)色的Q2 點(diǎn)從左到右均低于最右的原始藍(lán)色Q2 點(diǎn)或點(diǎn)的回歸線與橫坐標(biāo)交叉或者小于0，從圖1C 可以看出，PLS-DA 模型得到的結(jié)果是可靠有效的；圖1D 表示OPLS-DA 主成分分析得分圖，可以看出，F(xiàn) 組和M 組能很好地區(qū)分，組內(nèi)關(guān)聯(lián)性很高，組間差異很大，再一次表明雌、雄糙海參體腔液中的代謝物具有顯著差異。

本研究采用P≤0.05 及VIP≥1 作為相關(guān)差異代謝物的篩選指標(biāo)，與M 組相比，F(xiàn) 組的體腔液中共篩選出1352 個上調(diào)代謝物和943 個下調(diào)代謝物(圖2)。

2.2 糙海參體腔液中的性別差異代謝物

根據(jù)精確分子量及數(shù)據(jù)庫比對，最終確認(rèn)66 個具有顯著差異和明確注釋的代謝物(表1)。本研究還對糙海參體腔液中的性別差異代謝物進(jìn)行凝聚層次聚類分析(圖3A)，顯示有27 個代謝物在雌性體腔液中上調(diào)，39 個代謝物在雄性體腔液中上調(diào)，并且雌性組內(nèi)以及雄性組內(nèi)的數(shù)據(jù)重復(fù)性較好。

圖1 糙海參體腔液代謝物的多元統(tǒng)計(jì)分析及PLS-DA 置換檢驗(yàn)Fig.1 The multivariate analysis and PLS-DA permutation test of coelomic fluid in H. scabra

圖2 性別差異代謝物統(tǒng)計(jì)柱狀圖Fig.2 The statistical histogram of sex-specific metabolites

由表1 看出，大多數(shù)性別差異代謝產(chǎn)物屬于脂類和氨基酸；與脂肪酸生物合成相關(guān)的代謝物，如硬脂酸(Fold Change_F/M=0.448)、肉豆蔻酸(Fold Change_F/M=0.428)、丙二酸(Fold Change_F/M=0.247)、棕櫚酸(Fold Change_F/M=0.238)和油酸(Fold Change_F/M=0.233)等在雄性體腔液中的含量顯著高于雌性；與性激素相關(guān)的脫氫表雄酮(Fold Change_F/M=0.506)在雄性中的含量也顯著高于雌性(圖3B)；同時，外源物質(zhì) 2-萘酚(Fold Change_F/M=0.050)、異煙酸(Fold Change_F/M=0.134)、尼古丁(Fold Change_F/M=0.307)、3-羥基苯乙酸(Fold Change_F/M=0.414)和茶堿(Fold Change_F/M=0.433)等在雄性體腔液中的的含量也遠(yuǎn)高于雌性，可能預(yù)示著雌、雄糙海參對于外源物質(zhì)的積累具有一定的差異性。而氨基酸代謝物，如3,4-二羥基苯乙二醇(DOPEG) (Fold Change_ F/M=6.894)、3-吲哚乙腈(Fold Change_F/M=4.768)、甲基丙二酸(Fold Change_F/M=4.715)、亞精胺(Fold Change_F/M=4.602)、p-羥基苯乙酸(4-HPA)(Fold Change_F/M=2.715)和3,4-二羥基扁桃酸(DOMA) (Fold Change_F/M=2.075)等在雌性體腔液中的含量顯著高于雄性；另外，雌性體腔液中的β-胡蘿卜素(Fold Change_F/M=8.517)含量遠(yuǎn)高于雄性(圖3C)，由于β-胡蘿卜素涉及卵子的色素沉積，具有可作為性別差異代謝標(biāo)志物的潛力。

圖3 A：性別差異代謝物的凝聚層次聚類熱圖；B：體腔液脫氫表雄酮柱狀圖；C：體腔液中的β-胡蘿卜素柱狀圖Fig.3 A: The agglomerate hierarchical clustering heatmap of sex-specific metabolites;B: Histogram of dehydroepiandrosterone in coelomic fluid; C: Histogram of beta-carotene in coelomic fluid

表1 差異顯著的性別差異代謝物(P≤0.05+VIP≥1)[按照log2(FC_F/M)大小排序]Tab.1 Significantly different sex-specific metabolites (P≤0.05+VIP≥1) [The order according to the score of log2(FC_F/M)]

續(xù)表1

續(xù)表1

2.3 性別差異代謝物相關(guān)代謝通路分析

將不同的代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)導(dǎo)入 KEGG 數(shù)據(jù)庫及MetPA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，共獲得38 條性別差異代謝物的相關(guān)代謝通路。其中，雄性差異代謝物多富集于不飽和脂肪酸合成代謝、精氨酸與脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、色氨酸代謝和脂肪酸生物合成代謝；而雌性差異代謝物主要富集于酪氨酸代謝、糖酵解或糖異生和嘌呤代謝。根據(jù)富集和影響因子分析得到代謝通路影響因子氣泡圖(圖4)，其中，5 個為具有顯著性功能的代謝通路(Pathway impact＞0.1)，分別為酪氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、甾類化合物生物合成和藥物代謝通路。

結(jié)合表1 可知，雌性糙海參體腔液中含量較高的DOPEG (Fold Change_F/M=6.894)、DOMA (Fold Change_F/M=2.075)、4-HPA(Fold Change_F/M=2.715)和龍膽酸(Fold Change_F/M=1.084)以及雄性體腔液中的高香草醛(Fold Change_F/M=0.511)和L-多巴(L-DOPA) (Fold Change_F/M=0.379)均參與酪氨酸代謝；甾類化合物合成則由雄性差異代謝物羊毛甾醇(Fold Change_F/M=0.538)參與。藥物代謝在本代謝組研究中具有較高的影響因子(Pathway impact=0.20833)，參與其中的代謝物只有氟尿嘧啶，如圖5所示，氟尿嘧啶只富集于雄性糙海參體腔液中。對體腔液外源物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，與雌性相比，雄性糙海參體腔液更具有積累外源物質(zhì)的傾向(表2)。

圖4 代謝通路影響因子氣泡圖Fig.4 Bubble chart of pathway impact

圖5 體腔液中氟尿嘧啶柱狀圖Fig.5 Histogram of fluorouracil in coelomic fluid

精氨酸和脯氨酸代謝和谷胱甘肽代謝均與精子的發(fā)生和成熟相關(guān)，腐胺(Fold Change_F/M=0.341)和亞精胺(Fold Change_F/M=4.602)是關(guān)鍵的中間代謝物，腐胺可以生成亞精胺；表1 的結(jié)果顯示，腐胺富集在雄性中，而亞精胺則富集在雌性中，表明體腔液對這2 個代謝物的利用情況具有明顯的性別差異。

表2 體腔液外源物質(zhì)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistical list of xenobiotics in coelomic fluid

3 討論

3.1 β-胡蘿卜素具有作為標(biāo)志性雌、雄差異代謝物的潛力

海洋生物體內(nèi)存在著多種類胡蘿卜素，但一般來說，動物體內(nèi)不能直接合成類胡蘿卜素，所以這種代謝物的積累可能與生物體的攝食偏好或某些代謝反應(yīng)修飾有關(guān)(Matsuno, 2001; Liaaen-Jensen, 1991; Maoka,2009)。棘皮動物由于生殖需要，在性成熟時期，其體內(nèi)會積累類胡蘿卜素。β-胡蘿卜素在海參中十分常見，它能保護(hù)卵子免受光氧化和氧中毒的損害(Matsuno et al, 1995)，Maoka 等(2011)在海參性腺中發(fā)現(xiàn)了β-胡蘿卜素的氧化代謝產(chǎn)物角黃素和蝦青素，它們是海參性腺的主要成分。之前也有研究結(jié)果表明，雌性海膽(Strongylocentrotus droebachiensis)在產(chǎn)卵期間，其體內(nèi)類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)大幅度下降的趨勢，而在性腺恢復(fù)過程中，類胡蘿卜素又具有補(bǔ)充的趨勢，而雄性海膽中的類胡蘿卜素含量在生殖周期基本保持穩(wěn)定，這說明海膽對類胡蘿卜素的吸收和利用存在性別差異(Hagen et al, 2008)。在本研究中，雌性糙海參體腔液中的 β-胡蘿卜素水平顯著高于雄性(P＜0.05)(圖3C)，由于在性腺成熟期，體腔液是十分重要的運(yùn)輸介質(zhì)(John, 1964)，因此，我們認(rèn)為海參對β-胡蘿卜素的吸收和利用也存在性別差異：在性腺發(fā)育過程中，雌性海參往往需要吸收大量的β-胡蘿卜素來補(bǔ)償卵子成熟的需求，β-胡蘿卜素可能通過體腔液從腸道輸送到性腺，從而發(fā)揮保護(hù)作用或進(jìn)行氧化代謝為卵子提供必需物質(zhì)(Allen, 1974)。由于雄性海參體內(nèi)β-胡蘿卜素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于雌性，因此，可將β-胡蘿卜素作為雌、雄差異的標(biāo)志性代謝物，用來鑒定性腺成熟期糙海參的性別。

3.2 雌、雄糙海參體腔液中的差異代謝物

脫氫表雄酮(Fold Change_F/M=0.506)是性激素的來源，可以轉(zhuǎn)變?yōu)椴G酮和雌二醇(Henderson, 2007)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，其可以作為飼料添加劑誘導(dǎo)雜交羅非魚(Oreochromis niloticus × O.mossambicus)幼體雄性化，同時還能提高飼料轉(zhuǎn)化率及增加體重(Mohamed et al, 2012)，其在雄性糙海參中的含量顯著高于雌性(P＜0.05)(圖3C)，推測在海參體腔液中存在脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化過程的雌雄差異。

亞精胺(Fold Change_F/M=4.602)同腐胺(Fold Change_F/M=0.341)和精胺一樣屬于多胺，是最初從人類精液里提取出來的精液蛋白，在人類體內(nèi)具有抗氧化作用(Madeo et al, 2018)，亞精胺和腐胺通過參與精氨酸和脯氨酸代謝通路生成精胺(精氨酸→腐胺→亞精胺→精胺)，亞精胺和精胺是形成精子的必要物質(zhì)，因此，一般來說，雄親參會更需要亞精胺和腐胺，而本研究的數(shù)據(jù)卻顯示，在雌性體腔液中，亞精胺含量顯著高于雄性，腐胺則富集在雄性中；推測這可能是由于在糙海參親參生殖活動旺盛時期，其精氨酸和脯氨酸代謝旺盛，合成的腐胺首先在體腔液中積累，隨后由亞精胺合成酶(Spermidine synthase)將腐胺轉(zhuǎn)化成亞精胺，由于精巢的需要，雄性的亞精胺可以轉(zhuǎn)運(yùn)到精巢中以滿足精子的發(fā)育需求，所以雄性體腔液中的亞精胺含量降低而腐胺不斷合成以繼續(xù)生成亞精胺滿足精巢的需求；而卵巢并不需要亞精胺，所以它累積在了雌性體腔液中，并且抑制了腐胺的合成，造成了亞精胺含量較高而腐胺較低的結(jié)果。

同樣的，雄性體腔液中也富集了較多的卵巢需求較大的脂肪酸合成代謝相關(guān)代謝物(表1)。有研究表明，野生雌性大西洋鮭(Salmo sal ar)在性腺指數(shù)上升時，其血漿中的游離脂肪酸含量大幅度下降，這些營養(yǎng)物質(zhì)在很大程度上被分配到性腺中(Booth et al ,1999)。Gianasi 等(2017)也發(fā)現(xiàn)，喂食魚卵的雌性葉瓜參(Cucumaria frondosa)的卵母細(xì)胞較大，性腺所富含的必需脂肪酸的比例較多，說明卵子的成熟需要大量脂肪酸的積累，脂肪酸可能從體腔液中轉(zhuǎn)運(yùn)到性腺，因而雌性體腔液中的脂肪酸含量明顯低于雄性。

綜上所述，糙海參親參性腺發(fā)育相關(guān)通路有一部分會在體腔液中發(fā)生，產(chǎn)生的雌、雄性腺發(fā)育所必需的代謝產(chǎn)物先積累在體腔液中，根據(jù)性腺發(fā)育需求，代謝產(chǎn)物被轉(zhuǎn)運(yùn)到性腺中以滿足下一步代謝的需求，造成剩余的代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量具有明顯的雌雄差異，但不排除它們在體腔液中另有作用的可能性，其功能有待進(jìn)一步研究。

3.3 雌雄親參的性別差異代謝通路

通過代謝物富集分析發(fā)現(xiàn)，雄性體腔液中的代謝物多參與谷胱甘肽代謝以及精氨酸脯氨酸代謝，這2條代謝通路均在精子的發(fā)生和成熟過程中起重要作用(Sies, 1999)，其中，亞精胺、腐胺和γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-Glutamylcysteine, 3GC)參與谷胱甘肽代謝，而亞精胺和腐胺也同時參與精氨酸脯氨酸代謝。腐胺(Fold Change_F/M=0.341)和3GC(Fold Change_F/M =0.468)在雄性體腔液中含量較高，腐胺的代謝流向是精胺和亞精胺，而3GC 和精胺可進(jìn)行下一步反應(yīng)，從而在精子發(fā)生和成熟過程中發(fā)揮作用。因此，雄性體腔液中上述2 種通路流向精胺的代謝過程較為活躍，從而能為精子發(fā)生與成熟提供需要的營養(yǎng)和能量。本研究的結(jié)果顯示，亞精胺在雌性體腔液中含量顯著較高(Fold Change_F/M=4.602)，由于雌性不需要參與精子發(fā)生和成熟過程，因而在雌性中亞精胺不繼續(xù)進(jìn)行下一步代謝而滯留在體腔液中。此外，雄性差異代謝物羊毛甾醇(Fold Change_ F/M=0.538)是甾類化合物生物合成的中間代謝產(chǎn)物，羊毛甾醇可經(jīng)過一系列生物化學(xué)轉(zhuǎn)化，形成膽甾醇和性激素等甾族物質(zhì)，表明在糙海參雄性體腔液中性激素的合成通路較為活躍。氟尿嘧啶是參與藥物代謝的唯一代謝物，它只在雄性體腔液中富集(圖5)。氟尿嘧啶是廣泛應(yīng)用于人體治療的抗腫瘤藥物(Jamieson et al, 2014)，由于工業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)境污染等問題，使得一些化學(xué)物質(zhì)流入土壤和水體，對生態(tài)環(huán)境和生物多樣性造成了一定程度的損害(Gavrilescu et al, 2015)，為此，吳海燕等(2012)建立了海參等體內(nèi)藥物殘留液相色譜-熒光檢測方法。有研究表明，氟尿嘧啶在水體中濃度低時也會觸發(fā)蝌蚪的惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，從而導(dǎo)致突變(Araújo et al, 2019)，其對糙海參的具體影響尚未明確。這種氟尿嘧啶濃度的差異預(yù)示了糙海參對于化學(xué)藥物等外源物質(zhì)的攝取趨向具有顯著的性別差異，表2 的數(shù)據(jù)也說明，無論從種類還是含量上來看，雄性體腔液比雌性更容易積累外源物質(zhì)。

酪氨酸代謝可以產(chǎn)生許多重要激素和神經(jīng)遞質(zhì)，包括甲狀腺素、三碘甲狀腺氨酸、腎上腺素、多巴胺和黑色素等(Li et al, 2009)，其中，多巴胺在魚類性腺發(fā)育期具有激素調(diào)控作用(Peter et al, 1988)，并且海膽也具有多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)(汝少國等, 2015)。雌性體腔液中的DOMA 和DOPEG 以及雄性體腔液中的高香草醛(HMPAL)(Fold Change_F/M=0.511)和多巴胺前體 L-DOPA (Fold Change_F/M=0.379 (Calvo et al ,2011)均為酪氨酸代謝產(chǎn)物，這些代謝物的富集表明在海參體腔液中流向多巴胺前體L-DOPA 的代謝活動十分活躍，但由于雌、雄體腔液中多巴胺代謝相關(guān)酶的表達(dá)具有差異，導(dǎo)致產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類具有差異，這一結(jié)果與金錢魚(Scatophagus argus)性腺成熟時多巴胺系統(tǒng)具有性別表達(dá)差異一致(蘇冒亮, 2017)，而這一代謝通路的作用推測與性激素調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述，雄性體腔液中的代謝物多富集于谷胱甘肽代謝、精氨酸脯氨酸代謝、甾類化合物生物合成和藥物代謝，涉及精子發(fā)生及成熟、性激素合成以及外源物質(zhì)積累等過程；同時，雌、雄體腔液代謝物多參與酪氨酸代謝過程，該過程涉及激素合成及多巴胺調(diào)節(jié)激素過程，表明糙海參雌、雄性腺的發(fā)育可能受到多巴胺的影響，并且這種影響具有性別代謝差異。

4 結(jié)論

本研究表明，體腔液可以積累性腺發(fā)育所需要的代謝物，其中，β-胡蘿卜素在糙海參雌性體腔液中大量積累，可作為雌、雄差異標(biāo)志代謝物；體腔液還能夠積累性腺發(fā)育不需要的代謝物，如雌性積累亞精胺，而雄性積累脂肪酸合成通路代謝物，推測這是由于雌、雄性腺發(fā)育所需要的代謝過程有部分在體腔液中發(fā)生，產(chǎn)生的代謝物一部分轉(zhuǎn)運(yùn)到性腺中為性腺發(fā)育提供能量或營養(yǎng)，其余的代謝物則滯留在體腔液中，可能具有其他生理作用；同時發(fā)現(xiàn)，糙海參雌、雄性腺發(fā)育過程有性激素的參與，性激素調(diào)節(jié)可能受到多巴胺的影響，并且這種影響具有性別代謝差異；通過對比外源代謝物的數(shù)量和種類，發(fā)現(xiàn)雄性糙海參體腔液相比雌性更容易積累外源物質(zhì)特征，其中，氟尿嘧啶屬于環(huán)境污染物，它的積累對雄性糙海參的影響需要進(jìn)一步的研究。總之，糙海參雌、雄體腔液代謝物具有明顯的性別差異。