N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的生物信息學(xué)分析

楊艷北 許晶 沈城輝 許繼國(guó) 饒友生

摘要：采用生物信息學(xué)分析方法，對(duì)沼澤紅假單胞菌N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，該蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白，定位在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中，無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)元件，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能發(fā)揮具有重要意義。含有6個(gè)磷酸化位點(diǎn)，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。參與細(xì)菌群體感應(yīng)淬滅。

關(guān)鍵詞：沼澤紅假單胞菌;N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶;生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.96? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2021）02-0031-07

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.02.008

Bioinformatics Analysis of N-acyl Homoserine Lactonase

YANG Yanbei 1，2， XU Jing 3， SHEN Chenghui 3， XU Jiguo 1，2， RAO Yousheng 1，2

（1. Institute of Biotechnology Research， Nanchang Normal University， Nanchang Jiangxi 330000， China;? ? ? ? 2. Province Key Lab of Genetic Improvement of Indigenous Chicken Breeds， Nanchang Jiangxi 330000， China;3. Department of Biology， Nanchang Normal University， Nanchang Jiangxi 330000， China）

Abstract：The aim of the present study was to understand the physical and chemical properties and structural characteristic of N-acyl homoserine lactonase in Rhodopseudomonas palustris by bioinformatics method. The results showed that the protein was a stable hydrophilic protein. The protein was localized in the cytoplasm of bacteria. The protein had no signal peptide structure. The secondary structure of the protein contained α-helix， β - angle， extended chain and random coil. The α-helix and random coil played an important role in the stability and function of tertiary structure. The protein contained six phosphorylation sites. The protein had no transmembrane domain. The protein was involved in quorum sensing quenching.

Key words：Rhodopseudomonas palustris;N-acyl homoserine lactonase;Bioinformatics;Biofilm;Analysis

沼澤紅假單胞菌可作為微生物飼料添加劑，屬于益生菌，廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖 業(yè)[1 - 2 ]。生物被膜能夠增強(qiáng)益生菌對(duì)溫度、胃酸和機(jī)械剪切力的抵抗能力。生物被膜包埋到微膠囊中創(chuàng)造了新一代的益生菌，國(guó)內(nèi)外學(xué)者稱之為“第四代益生菌”。微膠囊技術(shù)和生物被膜的結(jié)合，進(jìn)一步提高了益生菌對(duì)于惡劣環(huán)境的抵抗能力?！暗谒拇嫔本哂懈玫目估鋬龈稍锬芰湍蜔嵝?，對(duì)于低溫儲(chǔ)藏和胃液處理，存活率更高[3 ]。群體感應(yīng)是細(xì)菌通過(guò)分泌信號(hào)分子來(lái)調(diào)控其不同生物學(xué)功能的一種群體行為，例如細(xì)菌生物被膜的形成[4 ]。革蘭氏陰性細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)主要由N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(lèi)信號(hào)分子介導(dǎo)，信號(hào)分子的濃度隨細(xì)菌密度的增加而增加，當(dāng)達(dá)到或超過(guò)閾值時(shí)，信號(hào)分子同受體結(jié)合從而觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)菌生物被膜的形成[5 ]。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(lèi)信號(hào)分子對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控具有十分重要的作用，通過(guò)破壞或干擾N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的合成，達(dá)到淬滅群體感應(yīng)系統(tǒng)的目標(biāo)。群體感應(yīng)淬滅通過(guò)抑制信號(hào)分子的合成，降低信號(hào)分子的濃度，降解或修飾信號(hào)分子結(jié)構(gòu)，從而破壞細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的功能。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶作為廣泛存在的群體感應(yīng)淬滅酶，表現(xiàn)出了極強(qiáng)的淬滅活性[6 - 7 ] 。我們選取N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶，采用生物信息學(xué)的分析方法，對(duì)其理化性質(zhì)、親水性/疏水性、亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，旨在為后續(xù)研究沼澤紅假單胞菌生物被膜形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為生物被膜增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?數(shù)據(jù)來(lái)源

沼澤紅假單胞菌N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶蛋白質(zhì)序列來(lái)自美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）中已登錄的序列，蛋白質(zhì)序列編碼為WP_119858436.1[N-acyl homoserine lactonase family protein （Rhodopseudomonas palustris）]。

1.2? ?研究方法

在線生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具分析N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的蛋白質(zhì)序列：利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析理化性質(zhì)，利用ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行親水性、疏水性的分析和預(yù)測(cè)，利用PSORTb version 3.0.2 （https：//www.psort.org/psortb/）和LocTree3 （https：// www.rostlab.org/services/loctree3/）進(jìn)行細(xì)菌亞細(xì)胞定位分析和預(yù)測(cè)，利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）進(jìn)行信號(hào)肽分析和預(yù)測(cè)，利用SOPMA（https：

//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測(cè)，利用SWISS-MODEL （https： //swissmodel. expasy. org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測(cè)，利用NetPhosBac 1.0 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service. php？NetPhosBac-1.0）進(jìn)行細(xì)菌蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)分析和預(yù)測(cè)。利用TMHMM 2.0 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域的分析和預(yù)測(cè)，利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)（CDD）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析和預(yù)測(cè)。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶理化性質(zhì)分析

利用ProtParam分析了N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的理化性質(zhì)。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的分子量為31 488.50 Da，理論等電點(diǎn)為5.14。氨基酸數(shù)量為284個(gè)，其中含量較多的是甘氨酸（28個(gè)，9.9%）、丙氨酸（27，9.5%）、天冬氨酸（24個(gè)，8.5%）、亮氨酸（24個(gè)，8.5%）。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶含有3個(gè)半胱氨酸，推測(cè)N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶可能具有二硫鍵結(jié)構(gòu)。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶不具有吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸等稀有氨基酸。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的氨基酸組成分別為丙氨酸（27個(gè)，9.5%）、精氨酸（19個(gè)，6.7%）、天冬酰胺（7個(gè)，2.5%）、天冬氨酸（24個(gè)，8.5%）、半胱氨酸（3個(gè)，1.1%）、谷氨酰胺（9個(gè)，3.2%）、谷氨酸（13個(gè)，4.6%）、甘氨酸（28個(gè)，9.9%）、組氨酸（8個(gè)，2.8%）、異亮氨酸（15個(gè)，5.3%）、亮氨酸（24個(gè)，8.5%）、賴氨酸（7個(gè)，2.5%）、蛋氨酸（8個(gè)，2.8%）、苯丙氨酸（15個(gè)，5.3%）、脯氨酸（12個(gè)，4.2%）、絲氨酸（17個(gè)，6.0%）、蘇氨酸（15個(gè)，5.3%）、色氨酸（7個(gè)，2.5%）、酪氨酸（9個(gè)，3.2%）、纈氨酸（17個(gè)，6.0%）。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)（天冬酰胺+谷氨酸）為37個(gè)，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)（精氨酸+賴氨酸）為26個(gè)，其分子式為C1407H2143N387O416S11，原子總數(shù)為4 364。假設(shè)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶所有的胱氨酸殘基以半胱氨酸的形式出現(xiàn)，即形成二硫鍵，N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的消光系數(shù)為52 035 L/（mol·cm），吸光度（A280）為1.653;假設(shè)二硫鍵全部打開(kāi)，N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的消光系數(shù)為51 910 L/（mol·cm），吸光度（A280）為1.649。當(dāng)N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的N端為甲硫氨酸時(shí)，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸桿菌體內(nèi)半衰期大于10 h。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的不穩(wěn)定系數(shù)為24.62，小于閾值40，在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定，推測(cè)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶為穩(wěn)定蛋白。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶脂肪指數(shù)為80.42，親水性平均值為-0.187。親水性平均值為負(fù)值，推測(cè)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶為親水性蛋白。

2.2? ?N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶親水性/疏水性分析

利用ProtScale分析了N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的親水性/疏水性。通過(guò)圖1可以看出，在N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶多肽鏈中，第119位谷氨酸有最低分值-2.689，親水性最強(qiáng);第38位異亮氨酸有最高分值2.267，疏水性最強(qiáng)。親水性氨基酸數(shù)量較多，親水性平均值為-0.187，推測(cè)N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶表現(xiàn)為親水性。

2.3? ?N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶亞細(xì)胞定位分析

PSORTb version3.0.2是目前最精確的細(xì)菌定位預(yù)測(cè)工具之一，利用PSORTb version 3.0.2分析了N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的亞細(xì)胞定位。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)分別為細(xì)胞質(zhì)8.96，細(xì)胞質(zhì)膜0.51，周質(zhì)0.26，外膜0.01，細(xì)胞外0.26。定位分?jǐn)?shù)顯示N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶定位在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)中。利用Loc Tree3分析了N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的亞細(xì)胞定位，結(jié)果如圖2所示：N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶定位在細(xì)胞質(zhì)中，亞細(xì)胞定位分?jǐn)?shù)為100，精確度99%?；谏鲜?種在線工具的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶定位在細(xì)胞質(zhì)中。

2.4? ?N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶信號(hào)肽分析

利用SignalP 4.1 Server分析了N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的信號(hào)肽，結(jié)果如圖3所示：原始剪切位點(diǎn)C最大值在第48個(gè)氨基酸，分值為0.132;綜合剪切位點(diǎn)Y最大值在第48個(gè)氨基酸，分值是0.137;信號(hào)肽S最大值在第27個(gè)氨基酸，分值為0.262;平均信號(hào)肽S值為第1～47個(gè)氨基酸，平均值是0.134;D值為第1～47個(gè)氨基酸，平均值是0.136;臨界值是0.570。D值是信號(hào)肽S最大值和綜合剪切位點(diǎn)Y最大值的平均值，對(duì)區(qū)分是否為分泌蛋白具有至關(guān)重要的作用。D值小于臨界值，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列，故推斷N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶為非分泌性蛋白。

2.5? ?N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA分析了N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示：N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶可能包含的二級(jí)結(jié)構(gòu)分別為α-螺旋（藍(lán)色）67個(gè)，占23.59%;β-轉(zhuǎn)角（綠色）28個(gè)，占9.86%;延伸鏈（紅色）64個(gè)，占22.54%;無(wú)規(guī)則卷曲（紫色）125個(gè)，占44.01%?？梢?jiàn)無(wú)規(guī)則卷曲是N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中最大量的結(jié)構(gòu)元件。

2.6? ?N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SWISS-MODEL分析了N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶三級(jí)結(jié)構(gòu)，得到以PDB ID： 3aj3.1.A（4-吡哆醇內(nèi)酯酶）為模板的預(yù)測(cè)模型，作為本研究的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶預(yù)測(cè)模型。從圖5看出，N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶預(yù)測(cè)模型與模板序列相似度為23.87%。N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶預(yù)測(cè)模型的全局模型質(zhì)量評(píng)估分?jǐn)?shù)（GMQE）為0.55，接近1。GMQE是一種質(zhì)量評(píng)估方法，生成的GMQE在0到1之間，數(shù)字越高表明可靠性越高。通過(guò)SWISS-MODEL預(yù)測(cè)得出，N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6），可見(jiàn)其α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)豐富，數(shù)量較多，推測(cè)α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲對(duì)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶生物學(xué)功能的發(fā)揮具有重要作用。

2.7? ?N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶磷酸化位點(diǎn)分析

利用NetPhosBac 1.0 server分析了N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的磷酸化位點(diǎn)。從圖7可以看出，磷酸化位點(diǎn)有6個(gè)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)包括73 S（殘基得分0.621）、183 S（殘基得分0.581）、194 S（殘基得分0.525）、278 S（殘基得分0.501），蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)包括24 T（殘基得分0.510）、174 T（殘基得分0.508）。殘基得分介于0和1，當(dāng)?shù)梅指哂?.5時(shí)，殘基被預(yù)測(cè)為磷酸化位點(diǎn)。

2.8? ?N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶跨膜結(jié)構(gòu)域分析

利用TMHMM 2.0 server分析了N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果如圖8所示。預(yù)測(cè)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶位于膜外的概率接近100%，位于膜內(nèi)和跨膜區(qū)域的概率幾乎為0。因N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，所以圖8中不顯示相應(yīng)標(biāo)記。推測(cè)N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶不屬于跨膜蛋白。

2.9? ?N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶功能結(jié)構(gòu)域分析

利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)（CDD）進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶參與細(xì)菌群體感應(yīng)淬滅。從圖9可看出，N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶在31-251位氨基酸處含有保守結(jié)構(gòu)域AHL_lactonase_MBL-fold，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆贛BL折疊金屬水解酶超家族，該家族主要由具有多種生物學(xué)功能的水解酶組成。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯是許多革蘭氏陰性細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)基因表達(dá)的信號(hào)分子。N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶具有群體感應(yīng)淬滅功能，催化N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)的水解和開(kāi)環(huán)，從而阻斷群體感應(yīng)系統(tǒng)功能的發(fā)揮。

3? 小結(jié)與討論

益生菌是指當(dāng)以足夠數(shù)量存在時(shí)可對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生有益作用的活的微生物[8 ]。沼澤紅假單胞菌屬于益生菌的一種，可作為微生物飼料添加劑使用，具有極高的應(yīng)用價(jià)? ? ?值[9 ]。微生物飼料添加劑在高溫、胃酸、膽鹽等條件下易失活[10 ]，生物被膜狀態(tài)下的益生菌能夠很好地解決上述諸多問(wèn)題[11 - 12 ]。與常規(guī)益生菌制劑相比，在高密度生物被膜狀態(tài)下益生菌制備的制劑具有更好的耐熱性、耐酸性和抗冷凍干燥能力[13 ]。我們利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶參與細(xì)菌群體感應(yīng)淬滅。群體感應(yīng)是微生物之間通過(guò)信號(hào)分子進(jìn)行交流的一種通訊機(jī)制，可使細(xì)菌表現(xiàn)出不同的生理行為，例如生物被膜的形成與生長(zhǎng)[14 - 16 ]。細(xì)菌群體感應(yīng)淬滅具有3種途徑，一是阻礙信號(hào)分子合成蛋白的產(chǎn)生，從源頭上使信號(hào)分子無(wú)法生成;二是通過(guò)降解信號(hào)分子，使信號(hào)分子濃度處于閾值以下，阻止下游基因的表達(dá);三是阻止信號(hào)分子與相應(yīng)受體蛋白的結(jié)合，使其無(wú)法行使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能[6，17 - 18 ]。群體感應(yīng)淬滅酶是最主要的群體感應(yīng)淬滅手段之一，通過(guò)降解信號(hào)分子以及阻斷信號(hào)的產(chǎn)生和識(shí)別起到淬滅的作用。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯都有一個(gè)高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和酰胺鍵，可為群體感應(yīng)淬滅酶提供相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。根據(jù)酶切位點(diǎn)的不同，群體感應(yīng)淬滅酶包括內(nèi)酯酶、酰胺酶和氧化還原酶三大類(lèi)，其中N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶表現(xiàn)出了極強(qiáng)的淬滅活性。N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶是群體感應(yīng)淬滅酶中首個(gè)被確定的群體感應(yīng)淬滅酶[6，19 ]。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶能夠水解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的內(nèi)酯環(huán)，產(chǎn)生N-?；呓z氨酸。在酸性條件下，N-?；呓z氨酸能夠重新環(huán)化成N-?；呓z氨酸內(nèi)酯，因此N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的淬滅作用是可逆的。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶可分為不同的蛋白家族，不同的蛋白家族又包含多種具有同源性的酶[20 ]，本研究中的N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶屬于金屬水解酶超家族，具有水解酶活性，能夠催化N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)的水解和開(kāi)環(huán)。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶通過(guò)降解革蘭氏陰性細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)信號(hào)分子，從而調(diào)控細(xì)菌生物被膜的形成。N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶作為生物被膜形成過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，是理想的生物被膜增強(qiáng)劑的候選蛋白，因此，通過(guò)不斷的對(duì)其進(jìn)行深入研究和分析，對(duì)生物被膜的人為控制將具有非常誘人的前景。

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（本文責(zé)編：陳? ? 偉）